Summary
Этот протокол описывает микроинъекции методологии, которая у нас есть стандартизированы и используются на протяжении нескольких лет для доставки определенного количества нуклеиновые кислоты непосредственно гемолимфа комаров и мух в дом. Этот протокол приводит к минимальным инъекции смертности и позволяет дозы коррелированных измерений плодовитость.
Abstract
Синтетических двуцепочечных РНК, используется, чтобы вызвать РНК-интерференции, могут иметь дозы зависимой фенотипические эффекты. Эти эффекты являются трудно определить если двуцепочечных РНК доставляются с помощью не количественный метод. Точная доставка известных количеств нуклеиновых кислот или других химических веществ имеет решающее значение для измерения эффективности соединения тестируется и позволить надежное сравнение между соединениями.
Здесь мы предоставляем воспроизводимость, количественных микроинъекции протокол, который обеспечивает точную доставку определенных доз двуцепочечной ДНК, сокращение смертности, обычно вызванное инъекций травмы. Эти изменения включают добавление родамин B, окончил иглу, и улучшение восстановления метод заимствованы из Isoe и Коллинз. Этот метод позволяет расчет дозы ответов и облегчает сопоставление соединения. Версии этого метода успешно применялись на трех родов комаров, а также дома мух для оценки сокращения в результате сайленсинга генов рибосомной РНК стенограмм плодовитость.
Этот протокол обеспечивает стратегии сокращения несколько проблем малых насекомых микроинъекции. Вместе, механические доставка двуцепочечных РНК в сопровождении визуального контроля, выявления эффективных мест для доставки и включение впрыск восстановительного периода обеспечить точное дозирование и смертности низкий травмы. Этот протокол также описывает откладки яиц биопроб для единообразного определения воздействия на плодовитость.
Introduction
Доставку небольших биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, Взрослый двукрылых оказался сложным в Culicidae и настоящие мухи. Производить стерильности (когда ориентация генов исключительно выражается в яичках взрослых) и смертности (при таргетинге SNF7 и стероидных рецепторов coactivator) в личинки Aedes aegyptiбыло сообщено устные поглощения двуцепочечных РНК1,2 . Смертности наблюдается также при нацеливании HSP70 в личиночной Муха domestica3. Однако, такая фенотипические эффекты, не привели после кормления двуцепочечной ДНК для взрослых А.е. aegypti в сахар питание4,5.
Микроинъекции был использован для обхода средняя при внедрении возбудителей или нуклеиновые кислоты, тем самым вызывая системный ответ5,6,,78,9,10 . Существует несколько методик микроинъекции, с участием оборудования, начиная от внутреннего производства аппаратов, которые требуют визуального измерения объёма инъекции с микропроцессором инжекторов, которые позволяют для автоматизированных объем доставки как низко как 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. РНК интерференции (RNAi) триггеры ориентации рибосомных мРНК, нарушить яичников развития членистоногих как скот клещ Rhipicephalus Дуо, комары Aedes aegypti и Culex pipiens, и дом Муха Муха domestica5,9,12,13. В этих исследованиях мониторинг нарушения откладки яиц был существенно важное значение для определения эффективности отливках, как фенотипа может проявляться как прекращение или сокращение потомства. Это форма многопоколенных смертоносных фенотипа, это критический и желаемого эффекта во многих нетрадиционных биоконтроля методы, такие как Wolbachia -инфицированных мужчин введение (сексуальной несовместимости) и RNAi-наведенный стерильности5 ,9,14. Отслеживание смертности и плодовитость необходимыми для развития весьма специфический biorationals (естественно-происходя патогенов или природные производные)15и характеристике.
Этот протокол представляет подробные микроинъекции методы для взрослых комаров и мух дома; процесс, который часто не хорошо описаны в литературе. Кроме того описаны методики биопроб откладки яиц адекватно оценить эффекты двуцепочечной ДНК на взрослых двукрылых. Эти протоколы были разработаны специально для Aedes aegypti и Муха domestica , но могут быть изменены для других видов.
Protocol
1. насекомых подготовка
- Анестезировать комаров, охлаждение их на 4 ° C на несколько часов или воздействием 2 мин CO2 и затем удерживая на 4 ° C до инъекции. Холодная анестезировать мух на 4 ° C 2\u20123 h до инъекции. Обеспечения, комаров и мух вязка, если откладки яиц является переменной ответ.
Примечание: Метод анестезии комара зависит от видов и деформации, например, Culex восстановить гораздо быстрее, от холодных анестезии чем Aedes aegypti и поэтому предпочтительнее CO2 нокдаун. - На льду тщательно этап комаров и мух с помощью мягкой щипцы сложить их вентрально выставленные на Микроскоп слайды ~0.5 см друг от друга. Стандартный слайды могут содержать две строки 6 комаров или 6 – 7 дом мухи. Оставьте 1 – 1,5 см пространства на левый или правый конец слайд подальше от комаров и мух для помощи слайд обработки.
- Храните слайды поставил насекомых на 4 ° C в больших Петри до готовности для инъекций.
Примечание: Сверлить отверстие через крышку Петри поможет предотвратить насекомых от помех путем перемещения воздуха когда укупорочные. Размещение слайды на пару стеклянных капилляров, обеспеченные на блюдо дно будет облегчить удаление от Петри.
2. насекомых инъекций
- Подготовить двуцепочечной ДНК, как описано в Эстеп и др. 5 и Sanscrainte и др. 9. Если свободной от загрязнений, двуцепочечной ДНК может быть определена количественно с помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности на 260 Нм и расчета концентрации РНК в мкг/мл × коэффициент разбавления260 × 40.
- Настройка рассекает микроскопом и microinjector над холод таблицы или мелкой ведро льда для выполнения инъекции под наркозом холодной комаров и мух (см. шаг 1.1 – 1.3 и рис. 1).
- Вытяните стеклянные капилляры штрафа отзыв с иглы съемник (параметры: нагреватель = 15 единиц, электромагнитный = 4 A).
Примечание: Таблица материалов производителя см. - Поместите капиллярного иглы в microinjector в соответствии с инструкциями изготовителя и кончик иглы перерыв, щипать с парой щипцы для производства острым концом.
Примечание: Предлагаемые иглы открытия, ~ 150 мкм для комаров и ~ 250 мкм для муха. - Набор microinjector для доставки нужного тома. Мениск движение от ~ 50 nL аликвоты легко наблюдаемых и рекомендуется для комаров микроинъекций. Если возможно, включите параметры быстрой инъекции. Промойте иглы, заполнив и высылки нуклеиназы свободной воды 3 раза.
- Приготовления растворов для инъекций в концентрации, такое что 100\u2012150 nL обеспечит нужную дозу для комаров и 500 nL будет предоставить требуемой дозы для дома мух.
Примечание: Предложил начальная доза: 1 мкг для каждого комара и 5 мкг каждая Муха5,9. - При необходимости для комаров, добавьте родамин B (для оказания помощи в визуализации) для решения в конечной концентрации 3,0 мкг/мл.
Примечание: Краска будет отчетливо видна ее розовый цвет после инъекции через почти ясно кутикулы на вентральной поверхности на пересечении живота/грудной клетки. - Пипетка 3 – 4 мкл раствора привнести на чистую поверхность (такие, как кусок парафина пленки) и рисовать в стеклянных иглу без сосание в воздух. Отожмите кнопку вставки неоднократно до тех пор, пока жидкость начинает обойтись от иглы и осторожно протрите капли деликатную задачу стеклоочистителя.
Примечание: Хотя некоторые модели microinjectors требует засыпка шприц, инжектор, на которые имеются ссылки в Таблице материалов не. - Используя маркер ультра-тонкой точке, нарисуйте хэш-символы ~ 1 мм друг от друга начиная от жидкого мениска к хвостовику иглы. Это будет помощь в визуализации движения мениска и убедитесь, что решение вступил комаров во время инъекции.
- Установите слайд комаров и мух (как подготовленные в шагах 1,2 – 1,3) под иглу на холод таблицы или льда (рис. 1). Убедитесь, что поле зрения микроскопа достаточно широк увидеть решение мениска в иглу.
- Для комаров, выровняйте иглой с средней трети mesokatepisternum (рисунок 2A) и хотя раскосы Москито против игла с щипцами размещены на противоположной стороне, аккуратно прокол кутикулы с помощью кончика иглы Микрометр microinjector.
- Для дома мух выравнивание иглой с mesopleuron (рис. 2B) и во время крепления лету против иглы, аккуратно прокол кутикулы с кончик иглы.
- Аккуратно вставьте иглу в комаров или летать тела до тех пор, пока кончик прошло через средней линии.
Примечание: Вставка иглу слишком мелкой часто приводит к закачиваемой жидкости бисером из насекомых (см. шаг 2.15). - Во время просмотра для движения жидкого мениска в иглу, отожмите кнопку вставки до тех пор, пока необходимое количество жидкости был вставлен. Для комаров Если задано значение 50.6 nL аликвоты, нажмите 2 X ~ 100 nL или 3 X ~ 150 nL. Для дома мух, отожмите кнопку вставки до ~ 500 вводят nL (т.е., с 69 nL аликвоты нажмите 7 X 483 nL).
- Если не переместить мениска, медленно слайд комаров или улететь иглы во время просмотра для движения мениска. Если часть вводят раствор бусы из кутикулы после удаления иглы или мениска, если не двигаться, отказаться от насекомых, как это инъекции не был успешным.
- Передача успешно вводят комаров в группах по 10-15 или дома мух в группах по 5 для очистки 3,5 унции Холдинг чашек. Крышка с тюлевой ткани или сетки и восстановить при комнатной температуре.
- После того, как комары и мухи оправились (1-2 ч), переверните чашку Холдинг над ватный тампон, смоченный раствором сахарозы 10%.
Примечание: Инверсия Кубок поверх СПИДа хлопок сахарозы в выживания, обеспечивая легкий доступ к еды сахар10. - Промойте иглу как шаг 2,5 между инъекционных растворов. Когда это сделано путем инъекций, утилизируйте использованные иглы в соответствующие Шарпс контейнер.
3. aedes aegypti смертности и откладки яиц биопроб
- Течение трех дней после инъекции продолжать оказывать комаров с 10%-ая сахароза и записывать количество заметно мертвой комаров.
- Заполните ≤12-дюймовый Искусственная мембрана (например, коллагеновая колбасная) с свежей крови (т.е., говядину для Aedes aegypti) и тепла до 60 ° C в ванну с горячей водой.
- Кратко сухой мембраны путем прокатки на бумажное полотенце и лежал через тюль шапки 3,5 унции, ясно Холдинг чашек. Чтобы улучшить питание, Спайк крови с 1 мм СПС после Отопление как phagostimulant или ручку утепленные кровяная колбаса с чистой голыми руками оставить человека летучих веществ на поверхности корпуса.
- После кормления крови заменить ватный тампон, смоченный с 10%-ая сахароза поверх Холдинг чашек и позволяют комаров для отдыха ~ 24 h перед передачей для откладки яиц чашки.
- Конструкция откладки яиц чашки, заполнив ясно 3.5 oz биопроб чашки с ~ 30 мл деионизированная H2O и размещение кусок бумаги всхожесть семян (шириной ~ 4 см и 5 см длиной, с хребтов работает вертикально) в нижней части Кубка и против стороны (рис. 3A) . Крышка с тюлевой ткани или сетки и вырезать небольшой разрез (~ 1 см) в крышку тюлевой ткани или сетки.
- На 24 ч после крови кормление, вырезать небольшой разрез (~ 1 см) в крышку тюль проведение Кубка и передачи только отдельных женщин, которые успешно кормить — с болюсным видимой крови в брюшной полости — стремлением нежный рот чашкам откладки яиц (1 Кубок девушки/откладки яиц). Уплотнение небольшой разрез в крышку откладки яиц с 10% сахарозы насыщенных ватным тампоном.
- Держите чашки на ~ 27 ° C на 5\u20127 дней, чтобы позволить комаров полностью разведению отслеживая ежедневной смертности. Количество яиц под областью рассечения.
4. Муха domestica смертности и откладки яиц биопроб
- Течение трех дней после инъекции продолжать оказывать мух с 10%-ая сахароза и записывать количество заметно мертвые мухи.
- Через три дня после инъекции, анестезировать мух, кратко поместив полиэтиленовые трубки, дозирования CO2 над Холдинг чашек, до тех пор, пока все мухи неподвижно на дне чашки.
- Передача летит к чистой клетке состоит из 4 Л пластиковая банка с stockinette рукавом, охватывающих открытия (10 см, рисунок 3B). Летит с воды и смесь гранулированного сахарозы, сухое молоко и сушеные желток в 8: коэффициент 8:1 (по объему) для четырех дней, запись и удаление мертвых летает ежедневно.
- Подготовьте сухие ингредиенты для свежих летать личиночной воспитания средних путем смешивания отруби пшеницы 75% с 25% гранулированных кормовых по весу. Добавьте воды до 62% влаги (до тех пор, пока капля воды может едва быть выдавливается).
- Подготовить мяч диаметром 2,5 см от 1:1 смесь выше свежие личинки СМИ и «используется» летать личиночной среднего (средний, в котором ранее pupated мухи). Оберните мяч в квадрат черный хлопчатобумажной ткани, слегка сжать до средних жидкость просачивается через, а затем использовать резинки провести ткань в место вокруг мяча.
- Положить мяч в 60 мл чашки и поместите его в лету клетке для 5 h (рис. 3B).
- Промойте яйца от мяча откладки яиц и убедитесь, что яйца удаляются из-под складки ткани. Встряхните яйца, чтобы сорвать кластеров и передавать их на градуированной 20 мл пластиковых пробирок с передачей пипетки.
- Подождите, пока яйца урегулировать и обратите внимание, объем поселились яйца в градуированной трубки. Добавьте достаточно воды, довести объем до 20 X объем поселились яиц. Запишите общий объем воды, плюс яйца.
- Во время смешивания воды и яиц подвеска с магнитной перемешать бар или энергичным перемешиванием, использовать наконечник пипетки 1 мл (с конца отрезать кончик) отказаться от 0,5 мл воды и яиц подвески на предварительно смоченной черной тканью в серии линий. Граф яйца под микроскопом рассечения.
- Повторите шаг 4.9 еще два раза. Если один из графов является тяжелой останец (то есть, отличается от других двух отсчеты по > 35%), четвертый оставим и игнорировать выброс.
- Вычислить среднее количество яиц в образец и умножьте это значение на 2, чтобы получить количество яиц/мл суспензии. Умножьте значение яйца/мл, получаемый объем яйцо подвеска из шага 4.8. Это смета расходов на общее количество яиц.
Representative Results
Микроинъекции двуцепочечной ДНК в комаров
Этот метод микроинъекции использовался в нашей лаборатории для оценки экспрессии генов, смертности и откладки яиц ответ для более чем 80 dsRNA триггеры через несколько родов комаров (Aedes, малярийные комары, Настоящие комары). Инъекций самки из колонии штамма А.е. aegypti (ORL1952) с 1 мкг двуцепочечной ДНК, производный от рибосомных стенограммы RPS6 и RPL26 (см. Эстеп et al. 5 методы производства двуцепочечной ДНК и последовательности данных) показали значительное снижение относительной выражение (RE) через несколько откладка циклов по сравнению с комаров, вводится с dsGFP управления. Aedes aegypti RE, измеренная после 2-й gonotrophic цикла показал значительное снижение экспрессии RPS6 (P < 0,05) в комаров, вводится с dsRPS6 определяется студента t теста между dsGFP управления той же группы (рис. 4)5 .
Плодовитость оценивалась от отдельных женщин, используя откладки яиц биопроб описано здесь. После 3 дней после инъекции комаров были кровь кормили, переведены в отдельных откладка контейнеры и позволили заложить до завершения. Средняя сцепления размеров для первого цикла gonotrophic были значительно сокращены для обоих dsRPS6 лечение А.е. aegypti (n = 102 женщины, 1,3 ± 0,8 (среднее ± SE) яйца) и dsRPL26 лечение (n = 86 женщин, 4.0 ± 1.1 яйца) по сравнению с dsGFP инъекции (n = 79 женщины, 49.3 ± 3.5 яйца, рис 5A). Сцепление оценки после второго цикла gonotrophic также показали значительно сокращена откладки яиц для обеих групп dsRNA лечить, но с размер снижение эффекта. Группа размеры А.е. aegypti были переменной и таким образом средства разделения была исполнена Данн тест5. Двадцать четыре часа смертности обычно был 3% или меньше.
Четкие дозы эффект наблюдался при внутривенном введении dsRPS6 от 1 мкг 50 нг в женских А.е. aegyptiи сцепление размера существенно различаются по сравнению с 1 мкг/девушки dsGFP вводят элементы управления во всех 25 нг/девушки dsRPS6 дозы (Рисунок 5B).
Микроинъекции двуцепочечной ДНК в доме мух
Колонии Муха domestica (ORL нормальной) вводили с 5 мкг dsRNA конструкций, направленных против дом fly RPS6 и RPL26 стенограммы9. Как было отмечено в А.е. aegypti, значительное сокращение как выражения конкретных Стенограмма (RPS6 и RPL26) и уменьшение размера сцепление было отмечено (рис. 4 и Рисунок 5A). Значительное снижение в RE определяется t критерия Стьюдента между dsGFP управления той же группы (P < 0,05) и холм-Sidak тест был использован для определения значимости между размерами муфты для различных м. domestica лечения групп. Яичников вскрытия показали снижение женских в dsRPS6 и dsRPL26 лечения, в то время как dsGFP кормить мух были нормальные вителлогенина осаждения оценке масштаба Tyndale-Биско9.
Рисунок 1: Установка микроинъекции для доставки микрообъемах взрослых комаров и мух в дом. Инъекции выполняются под наркозом холодной насекомых, поставил на скольжениях микроскопа над таблицей холод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Микроинъекции сайты для Ae. aegypti и м. domestica. (A) взрослых А.е. aegypti впрыснуты в средней трети mesokatepisternum. (B) взрослых м. domestica вводят в mesopleuron. Стрелки указывают места инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Oviposition биопроб установки. (A) А.е. aegypti откладки яиц пробирного чашки с бумагой всхожесть семян как Субстрат откладки яиц, покрытые тюль и 10% хлопок смоченной сахарозы. (B) взрослых женщин м. domestica в контейнере пробирного откладки яиц с продовольствия (A), вода (B) и личинок СМИ (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Относительное выражение RPS6 aegypti А.е. и м. domestica вводят с вегетационных двуцепочечных РНК. Aedes aegypti и м. domestica были введены с 1 и 5 мкг соответственно либо управления двуцепочечной ДНК (dsGFP) или dsRNA направленных против RPS6 или RPL26 транскрипты от каждого насекомых. Значительное снижение (P < 0,05) RPS6 выражение было отмечено в комаров и мух, вводят с dsRPS6 и мухами, вводится с dsRPL26 (обозначается звездочками). Погрешностей представляют собой среднее ± SE и число в столбце база указывает количество лиц изучены. Эта цифра была изменена от Эстеп и др. 5 и Sanscrainte и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Средняя сцепления размер aegypti А.е. и м. domestica вводят с вегетационных двуцепочечных РНК. (A) яйцо осаждения значительно сократилось (P < 0,05) в А.е. aegypti и м. domestica после инъекции 1 и 5 мкг соответственно либо управления двуцепочечной ДНК (dsGFP) или dsRNA разработан против RPS6 или RPL26 транскрипты от каждого насекомых. Звездочки показывают существенные отличия от управления dsGFP той же группы. Погрешностей представляют собой среднее ± SE и число в столбце база указывает количество лиц изучены. Эта цифра была изменена от Эстеп и др. 5 и Sanscrainte и др. 9. кривая доза (B) А.е. aegypti вводят с dsRPS6 от 50 нг/девушки до 1000 нг/женщина показывает значительные сокращения в плодовитость по сравнению с dsGFP вводят когорты (50, 100 и 1000 нг/женщины). Планки погрешностей представляют среднее ± 95% ДИ от 36-81 отдельных организмов за дозу. Точки с буквы представляют значительную разницу между группами (P < 0,05) определены ANOVA. Эта цифра была изменена от Эстеп и др. 5. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Микроинъекции — ценный лабораторных техника для обеспечения доставки двуцепочечной ДНК или других biorationals (например, пестициды, вирусы, Микроспоридии). Хотя многие лаборатории выполняют микроинъекции, точное количество вводят неясно часто из-за технических ограничений системы доставки где поставленный объем не является непосредственно измеренное11. Поставленный объем и концентрации являются критическими параметрами, которые позволяют вычисление стандартных токсикологические мер, таких как ЭК50 или IC50 или для определения минимальной эффективной дозы5,16. Это особенно важно в функциональных исследований с помощью РНК-интерференции у взрослых насекомых, где доставка питания не всегда приводит к системного воздействия частиц желаемого и пересечения Средняя фактическая доза составляет неясным5.
В то время как процедура микроинъекции может быть изначально сложным, быстрого улучшения в скорости и доставки точности достигаются с практики и терпения. Овладение самой процедуры инъекции является инвестиции времени, но, после того, как достигнуто, процедура производит воспроизводимость результатов и травмы смертности < 3%. Коэффициент успешных инъекции будет увеличиваться как знание увеличивает разрешение инъекций 300 комаров или летит в день.
Многие из задач микроинъекции обусловлены используется игла. Определение надлежащих капилляров иглы точки останова и угол кончика является сложным аспектом процедуры и требует некоторых проб и ошибок, чтобы определить наиболее эффективный размер отверстия для данного вида. Тонкой иглой наиболее полезным для комаров микроинъекции (~ 150 мкм) слишком мал, чтобы быстро доставить больший объем, вводят в мух, а наоборот, более крупные иглы, открытие, что работает на мух (~ 250 мкм) повреждает обширные травмы меньше комаров и смертности неприемлемым инъекций. Сломанный с тупым кончиком иглы часто трудно получить через кутикулу без повреждения тканей и увеличение смертности. Насекомых чешуйки или куски ткани может засорить иглы в течение эксперимента, поэтому часто бывает полезно иметь несколько игл, если требуется замена. Мы нашли, что это легче заменить сложным игл, вместо того чтобы тратить время, чтобы попытаться очистить застряла или загрязненные иглы.
Наблюдая инъекционного раствора, введя насекомое имеет решающее значение, так что неудачной инъекции могут быть удалены (см. шаги 2.14 и 2.15). Родамин B дополнение к инъекционных растворов обеспечивает четкое визуальное обеспечить холодной поставил насекомые получают надлежащей дозировки и особенно полезно во время практики (см. шаг 2.7).
Инъекции а откладка Методы биопроб, представленные здесь успешно побудили генов нокдаун и измеримые фенотипические эффекты в взрослых aegypti А.е. и м. domestica при использовании двуцепочечных РНК направленных против вегетационных рибосомных стенограммы (рис. 4 и Рисунок 5A). Кроме того, способность этого метода точно доставить микрообъемах лицам позволяет дозы ответ кривых для небольшого количества материала (как низкий, как 50 нг; Рисунок 5B). Это особенно полезно для методов, таких как скрининг малые интерферирующие РНК или двуцепочечных РНК, как производство большого количества этих молекул может быть непомерно.
Этот метод может быть изменен придать биологическими агентами (вирусы, бактерии, Микроспоридии) или химические пестициды, после обеспечения того, чтобы все буферы доставки безобидные путем инъекций. Поскольку объем поставки ограничен размер насекомого, производство сосредоточено тестирование решения имеет важное значение.
Чтобы адекватно оценить эффективность малым интерферирующим РНК, необходимо отслеживать откладки яиц как смертоносное фенотипов может проявляться только в потомстве. Как здесь представлены, проведение женского А.е. aegypti отдельно после инфарктами позволяет для определения размера отдельных сцепления и дальнейшего тестирования на тех же лиц может быть сделано после откладки яиц (то есть, исследования выражение гена, Дополнительные gonotrophic циклы, ткани конкретных нокдаун) соотнести репродуктивные выход с другими мерами, например экспрессии генов. Как domestica м. обычно разведению в группе ответ, разжигание изолированных беременных мух заложить является очень труда интенсивной и не практичным для большого числа лиц17. Таким образом представлен метод для определения размера средней сцепления.
Микроинъекции метод, представленные здесь обеспечивает последовательное системных доставку для комаров и мух в дом. В сочетании с смертности и откладки яиц, отслеживание bioassays, эти универсальные инструменты могут использоваться для оценки транскрипционный анализ и фенотипические эффекты малых молекул РНК, биологических агентов и традиционные пестицидов где устные доставки не является жизнеспособным.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками или подрядчиками Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов или Министерство обороны. Эта рукопись была подготовлена в ходе служебных обязанностей и является законом в общественном достоянии. Мнения, выраженные представляют мнение авторов и не отражают официальной позиции или одобрение правительством США. Упоминание о коммерческий продукт не является рекомендацией для использования.
Acknowledgments
Авторы благодарят Arimoto Ханаё (ВМС США), Дана Джонсон, Люси ли и Рокси белый (USDA-ARS) для помощи с сбора и анализа данных. Мы также благодарим Drs. Пиа Уступи (USDA-ARS) и Ke Wu (университет Флориды) для критического обзора рукописи и Niklaus Hostettler (университет Флориды) для съемок Микроскоп кадры. Финансирование было предоставлено USDA, WII - 141C проект военно-морского флота и морской пехоты общественного здравоохранения центр и программа защиты развернутых бойцов войны. Спонсоры имел никакой роли в конструкции или направление исследования или разработки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
