Summary
ويصف هذا البروتوكول منهجية microinjection لدينا موحدة واستخدمت لعدة سنوات بتسليم كميات معينة من الأحماض النووية مباشرة إلى hemolymph من البعوض والذباب البيت. هذا البروتوكول يؤدي إلى وفيات حقن الحد الأدنى ويسمح قياسات الجرعات ارتباطاً من خصوبتها.
Abstract
دسرناس الاصطناعية، تستخدم للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي، قد آثار الجرعة تعتمد المظهرية. هذه الآثار من الصعب تحديد إذا تم تسليم دسرناس استخدام أسلوب غير كمي. دقة تسليم كميات معروفة من الأحماض النووية أو المواد الكيميائية الأخرى أمر بالغ الأهمية لقياس فعالية المجمع يجري اختبارها والسماح موثوقة مقارنة بين المركبات.
هنا نقدم بروتوكول microinjection استنساخه، والكمية التي تضمن دقة إيصال جرعات محددة من دسرنا، خفض معدل الوفيات عادة الناجم عن الإصابة الحقن. وتشمل هذه التعديلات إضافة "ب والرودامين"، إبرة حقن متدرجة، وأسلوب تحسين استرداد اقترضت من إيزوي وكولينز. هذا الأسلوب يسمح حساب الجرعة الردود ويسهل إجراء المقارنات بين المركبات. قد استخدمت إصدارات من هذا الأسلوب بنجاح في ثلاثة أجناس البعوض، فضلا عن الذباب البيت لتقييم الانخفاض في الخصوبة الناتجة عن إسكات الجينات الحمض النووي الريبي الريباسي النصوص.
يوفر هذا البروتوكول استراتيجيات للحد من العديد من التحديات ل microinjection الحشرات الصغيرة. تسليم دسرناس مصحوبة بالتحقق البصري معا، والميكانيكية، ضمان تحديد مواقع فعالة للتسليم، وإدراج فترة الانتعاش بعد حقن جرعات دقيقة والوفيات الناجمة عن الإصابات منخفضا. ويصف هذا البروتوكول أيضا الحشري أوفيبوسيشن لتصميم موحدة من تأثيرات على الخصوبة.
Introduction
تسليم الجزيئات الحيوية الصغيرة، مثل الأحماض النووية، للكبار ديبتيرانس ثبت أن يشكل تحديا في Culicidae ومسكيدي. تم الإبلاغ عن استيعاب شفوي من دسرناس إنتاج العقم (عند استهداف جينات حصرا المعرب عنها في الخصيتين للبالغين) والوفيات (عند استهداف SNF7 وكواكتيفاتور مستقبلات ستيرويد) في يرقات بعوض الزاعجة المصرية1،2 . الوفيات قد لوحظ أيضا عند استهداف HSP70 في اليرقات مستأنسة الذبابة3. هذه التأثيرات المظهرية، ومع ذلك، لم تؤد إلى بعد تغذية دسرنا للكبار عبد اللطيف-مصرية في السكر الوجبات4،5.
وقد استخدمت microinjection للتحايل الأمامي عند الأخذ بالعوامل الممرضة أو الأحماض النووية، مما يحفز استجابة المنظومة5،6،،من78،9،10 . توجد العديد من التقنيات microinjection، التي تشمل معدات تتراوح ما بين الأجهزة المنتجة داخل المنظمة التي تتطلب قياس حجم الحقن بالحقن تسيطر على المعالجات الدقيقة التي تسمح بإيصال التخزين الآلي منخفضة تصل إلى 2.3 البصرية nL 5 , 9 , 10 , 11-الجيش الملكي النيبالي المشغلات التدخل ([رني]) استهداف مرناس ريبوسومال، عرقلة التنمية المبيض في المفصليات متنوعة القراد الماشية ميكروبلوس رهيبيسيفالوس، البعوض Culex pipiens، و بعوض الزاعجة المصرية وذبابة المنزل مستأنسة الذبابة5،9،،من1213. في هذه الدراسات، ورصد تعطل أوفيبوسيشن ضروري لتحديد فعالية إينوكولانت كما قد تتظاهر النمط الظاهري كإنهاء أو الحد من النسل. هذا هو نموذج للنمط الظاهري قاتلة بين الأجيال هو تأثير حاسم والمطلوب في العديد من الأساليب غير التقليدية لذالك مثل ولبخيه-إصابة الذكور مقدمة (عدم التوافق الجنسي) و [رني] التي يسببها العقم5 9، ،14. تتبع كل من الوفيات والخصوبة ضروري لتميز وتطوير بيوراتيونالس محددة للغاية (مسببات الأمراض التي تحدث بشكل طبيعي و/أو المشتقات الطبيعية)15.
هذا البروتوكول يقدم تقنيات microinjection مفصلة للكبار البعوض والذباب البيت؛ هي عملية غالباً ما لا يوصف كذلك في الأدب. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف أوفيبوسيشن الحشري منهجيات لتقييم آثار دسرنا على ديبتيرانس الكبار على نحو كاف. هذه البروتوكولات وضعت خصيصا بعوض الزاعجة المصرية و الذبابة مستأنسة ولكن يمكن تعديله للأنواع الأخرى.
Protocol
1-إعداد الحشرات
- تخدير البعوض التي تقشعر لها عند 4 درجة مئوية لعدة ساعات، أو عن طريق التعرض 2 دقيقة إلى CO2 وثم الضغط على 4 درجة مئوية قبل الحقن. الباردة تخدير الذباب في 4 درجات مئوية 2\u20123 ح قبل الحقن. كفالة يتم تزاوج البعوض والذباب إذا أوفيبوسيشن متغير استجابة.
ملاحظة: الأسلوب أنيسثيتيزيشن البعوض الذي يعتمد على الأنواع والسلالة، مثلاً Culex استرداد أسرع بكثير من أنيسثيتيزيشن الباردة من بعوضة الزاعجة المصرية وذلك ضربة قاضية2 CO الأفضل. - على الجليد، بعناية يتعرض المرحلة البعوض أو الذباب باستخدام الملقط الناعمة لوضع لهم بطنيا في المجهر الشرائح ~0.5 سم عن بعضها البعض. الشرائح القياسية يمكن عقد صفين من كل 6 البعوض أو الذباب في البيت 6 – 7. ترك مسافة 1 – 1.5 سم في نهاية الأيمن أو الأيسر من الشريحة واضحة من البعوض أو الذباب للمساعدة في التعامل مع الشريحة.
- تبقى شرائح حشرات نظموا في 4 درجات مئوية في صحون بتري كبيرة حتى جاهزة للحقن.
ملاحظة: حفر ثقب غطاء صحن بيتري سوف تساعد على منع الحشرات من يجري بانزعاج التشرد الهواء عند وضع سقف. وضع الشرائح على زوجين من الشعيرات الزجاجية المضمونة إلى أسفل الطبق سيخفف الإزالة من طبق بيتري.
2-الحشرات حقن
- إعداد دسرنا كما وصفها إستيب et al. 5 وسانسكرينتي et al. 9-إذا كانت خالية من الملوثات، دسرنا يمكن قياسها كمياً باستخدام جهاز المطياف الضوئي قياس امتصاص 260 نيوتن متر وحساب تركيز الحمض النووي الريبي في ميكروغرام/مل ك260 × إضعاف عامل × 40.
- إعداد تشريح مجهر وميكروينجيكتور عبر الجدول البرد أو الضحلة الجليد دلو لتنفيذ الحقن على تخديره من البرد البعوض والذباب (راجع الخطوة 1، 1، 1-3 و الشكل 1).
- سحب الشعيرات الزجاجية لتلميح جيد مع ساحبة إبرة (إعدادات: سخان = 15 وحدة، اللولبي = 4 A).
ملاحظة: انظر الجدول للمواد للشركة المصنعة للحصول على التفاصيل. - ضع الإبرة الشعرية في ميكروينجيكتور وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وكسر إبرة تلميح معسر مع زوج من الملقط لإنتاج نقطة حادة.
ملاحظة: هي إبرة اقترح فتح أحجام ميكرومتر ~ 150 للبعوض وميكرومتر ~ 250 للذبابة. - تعيين ميكروينجيكتور لوحدة التخزين المطلوب إيصالها. حركة غضروف من مختبرين nL ~ 50 الموصى به للبعوض ميكروينجيكشنز ويمكن ملاحظتها بسهولة. إذا كان متوفراً، تمكين إعدادات حقن سريعة. شطف الإبرة بملء وطرد المياه خالية من نوكلياسي 3 مرات.
- إعداد حلول لحقن بتركيز هذه أن توفر 100\u2012150 nL الجرعة المطلوبة للبعوض و 500 nL سوف توفر المطلوب جرعة للبيت الذباب.
ملاحظة: اقترح الجرعات الأولية: 1 ميكروغرام لكل البعوض و 5 ميكروغرام لكل5،الذبابة9. - بشكل اختياري للبعوض، إضافة "ب والرودامين" (للمساعدة في التصور) للحلول بتركيز نهائي 3.0 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: سيتم الصبغ واضحة للعيان بلونه الوردي بعد الحقن من خلال بشرة تقريبا واضحة على السطح البطني عند تقاطع البطن/الصدر. - "الماصة؛" 3 – 4 ميليلتر من حل لحقن على سطح نظيف (مثل قطعة من الفيلم البارافين) ورسم في الإبرة الزجاج دون مص في أي الهواء. خفض زر إدخال مرارا وتكرارا حتى يبدأ السائل الاستغناء عن الإبرة ولطف يمسح قطرات مع ممسحة مهمة حساسة.
ملاحظة: في حين تتطلب بعض نماذج من ميكروينجيكتورس ردمها المحاقن، حاقن المشار إليها في الجدول للمواد لا. - باستخدام علامة نقطة جيد جداً، رسم علامات التجزئة ~ 1 ملم بعيداً بدءاً من غضروف السائل لشأنك إبرة. وهذا المساعدة في تصور حركة غضروف والتأكد من أن الحل قد دخلت البعوض أثناء الحقن.
- تعيين الشريحة من البعوض أو الذباب (كما أعد الخطوات 1.2 – 1.3) تحت الإبرة على الطاولة البرد أو الثلج (الشكل 1). التأكد من أن مجال الرؤية في المجهر واسعة بما يكفي لرؤية غضروف الحل في الإبرة.
- للبعوض، محاذاة الإبرة مع الثلث الأوسط من ميسوكاتيبيستيرنوم (الشكل 2A)، وبينما تستعد البعوض ضد الإبرة مع ملقط يوضع على الجانب الآخر، ثقب بلطف بشرة مع استخدام تلميح إبرة ميكروينجيكتور ميكرومتر.
- للذباب البيت، محاذاة الإبرة مع ميسوبليورون (الشكل 2)، وبينما تستعد الطاير ضد الإبرة، ثقب بلطف بشرة بطرف الإبرة.
- بلطف تنزلق الإبرة في البعوض أو تطير الجسم حتى اجتاز غيض من خلال خط الوسط.
ملاحظة: إدخال إبرة ضحلة جداً وكثيراً ما ينتج عن الديكور السائل المحقون من الحشرات (راجع الخطوة 2.15). - بينما يراقب حركة غضروف السائل بالإبرة، كساد على زر الإدخال حتى تم ضخ المبلغ المطلوب من السائل. للبعوض، إذا تعيين إلى 50.6 nL مختبرين، اضغط 2 X 100 ~ nL أو 3 X ~ 150 nL. لبيت الذباب وكساد على زر الإدخال حتى ~ 500 قد ضخت nL (أي، مع 69 nL مختبرين اضغط 7 X ل 483 nL).
- إذا لم تتحرك غضروف، ببطء الشريحة البعوض أو تطير الإبرة بينما يراقب حركة غضروف. إذا كان جزء من الخرز الحل حقن من بشرة عند إزالة إبرة أو إذا فشل غضروف للتحرك، تجاهل الحشرة كحقن هذا لم يكن ناجحاً.
- نقل البعوض بنجاح حقن في مجموعات من 10-15 أو منزل يطير في مجموعات من 5 لمسح 3.5 أوقية عقد الكؤوس. وتغطي بقماش أو المعاوضة واسترداد في درجة حرارة الغرفة.
- بعد أن شُفي البعوض والذباب (1 – 2 ح)، عكس كل كوب القابضة على كرة القطن مبللة مع محلول السكروز 10%.
ملاحظة: عكس كأس على رأس الإيدز القطن السكروز في البقاء على قيد الحياة بتوفير وصول أسهل إلى وجبة سكر10. - شطف الإبرة كما في الخطوة 2، 5 بين الحلول الحقن. عند القيام بذلك عن طريق الحقن، تجاهل استخدام الإبر في حاوية الأدوات الحادة مناسبة.
3-الحشري بعوض الزاعجة المصرية وفيات وأوفيبوسيشن
- لمدة ثلاثة أيام بعد الحقن، تواصل تقديم البعوض مع السكروز 10% وسجل عدد البعوض الميت واضح.
- تعبئة غشاء اصطناعي دي وان تو بوصة (مثل الكولاجين نقانق) بدماء جديدة (أي، الأبقار بعوض الزاعجة المصرية) والحرارة إلى 60 درجة مئوية في حمام الماء الساخن.
- بإيجاز الجاف للغشاء قبل المتداول على منشفة ورقية ويكمن عبر قبعات تول 3.5 أوقية واضح الضغط الكؤوس. لتحسين التغذية، سبايك الدم مع 1 مم ATP بعد تدفئة فاجوستيمولانت أو عن طريق التعامل مع السجق الدم المعالجون بأيديهم العارية نظيفة لمغادرة التطاير البشرية على سطح الغلاف.
- بعد الدم التغذية، استبدال الكرة القطن غارقة مع السكروز 10% على رأس الكؤوس القابضة والسماح للبعوض للراحة ح ~ 24 قبل نقل إلى كوب أوفيبوسيشن.
- بناء أوفيبوسيشن كوب بملء مسح 3.5 أكواب الحشري أوز ~ 30 مل منزوع ح2س ووضع قطعة من الورق إنبات البذور (~ 4 سم و 5 سم طويلة مع الارتفاعات المتطاولة تشغيل عمودياً) في الجزء السفلي من الكأس وضد الجانب (الشكل 3A) . وتغطي بقماش أو المعاوضة وقص فتحه صغيرة (~ 1 سم) في كاب تول أو المعاوضة.
- في تغذية الدم بعد 24 ساعة، قص فتحه صغيرة (~ 1 سم) في كاب تول كأس القابضة ونقل الإناث الفردية فقط التي تغذيها بنجاح – مع بولس دم مرئياً في البطن – بالفم لطيف التطلع إلى أوفيبوسيشن كوب (كوب أنثى/أوفيبوسيشن). ختم قطع صغيرة في كاب أوفيبوسيشن مع كرة القطن مشبعة سكروز 10%.
- عقد الكؤوس في ~ 27 درجة مئوية لأيام 5\u20127 للسماح للبعوض الكامل أوفيبوسيت حين تتبع الوفيات اليومية. عد البيض تحت نطاق تشريح.
4. الذبابة مستأنسة الحشري وفيات وأوفيبوسيشن
- لمدة ثلاثة أيام بعد الحقن، تواصل تزويد الذباب السكروز 10% وسجل عدد الذباب الميت واضح.
- ثلاثة أيام بعد الحقن، تخدير الذباب بإيجاز وضع أنبوب بولي إيثيلين الاستغناء عن CO2 على مدى عقد الكؤوس حتى الذباب جميع بلا حراك في قاع الكؤوس.
- نقل الذباب إلى قفص نظيف تتكون من جرة بلاستيك 4 لتر مع الأكمام ستوكينيتي تغطي الافتتاح (10 سم، الشكل 3). توفير الذباب مع الماء وخليط سكروز حبيبات، الحليب المجفف، والمجففة صفار البيض في 8: نسبة 8:1 (من حيث الحجم) لمدة أربعة أيام، تسجيل وإزالة قتل الذباب يوميا.
- تحضير المكونات الجافة الطازجة المتوسطة تربية اليرقات يطير بخلط نخالة القمح 75% مع المواشي 25% القريبون تغذية حسب الوزن. إضافة الماء تصل إلى 62% رطوبة (حتى بالكاد يمكن أن تقلص قطره الماء بها).
- إعداد كرة قطره 2.5 سم من خليط 1:1 من وسائط الإعلام اليرقات الطازجة الواردة أعلاه و "المستخدمة" التحليق اليرقات المتوسطة (المتوسطة التي قد بوباتيد الذباب سابقا). لف الكرة في ساحة من قماش قطنية سوداء، ضغط طفيفة حتى متوسطة السائل يتسرب من خلال، ثم استخدام الأربطة المطاطية لعقد القماش في مكان حول الكرة.
- وضع الكرة في كوب 60 مل ووضعه في القفص يطير ح 5 (الشكل 3B).
- شطف البيض خارج الكرة أوفيبوسيشن وضمان إزالة البيض من تحت طيات في القماش. هز البيض لتعطيل الكتل ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي تخرج 20 مل مع بيبيت نقل.
- الانتظار لحين تسوية البيض وملاحظة حجم البيض المستقرين في أنبوب تخرج. إضافة المياه الكافية لتحقيق الحجم يصل إلى 20 X حجم البيض تمت تسويتها. سجل إجمالي حجم المياه بالإضافة إلى البيض.
- بينما خلط تعليق البيض والماء مع شريط المغناطيسي ضجة أو إثارة قوية، استخدام تلميح بيبيت 1 مل (مع نهاية الحافة قطع) الاستغناء عن 0.5 مل تعليق المياه والبيض على قطعة من القماش الأسود ترطب مسبقاً في سلسلة من الخطوط. عد البيض تحت مجهر تشريح.
- كرر الخطوة 4.9 مرتين أخريين. إذا كان أحد من التهم الخارجة شديدة (أي يختلف من التهم الأخرى اثنين من > 35%)، وجعل عدد الرابع والاستخفاف الخارجة.
- حساب متوسط عدد البيض كل عينة وضرب هذه القيمة بواسطة 2 للحصول على عدد البيض/مل تعليق. اضرب البيض مليلتر القيمة التي تم الحصول عليها من وحدة التخزين لتعليق البيض من الخطوة 4، 8. وهذا تقدير العدد الإجمالي لوضع البيض.
Representative Results
Microinjection دسرنا في البعوض
قد استخدمت هذا الأسلوب microinjection في المختبر لتقييم التعبير الجيني، معدل الوفيات، واستجابة أوفيبوسيشن لما يزيد على 80 دسرنا المشغلات عبر عدة أجناس البعوض (بعوضة، انوفل، Culex). حقن الإناث من سلالة مستعمرة من عبد اللطيف-مصرية (ORL1952) مع 1 ميكروغرام من دسرنا المستمدة من النصوص ريبوسومال RPS6 و RPL26 (انظر إستيب et al. 5 لتسلسل البيانات وأساليب الإنتاج دسرنا) أظهرت كبيرة الحد في التعبير النسبي (RE) عبر أوفيبوسيشن عدة دورات عند مقارنتها بحقن دسجفب السيطرة البعوض. بعوض الزاعجة المصرية إعادة قياس عقب دورة جونوتروفيك 2nd أظهرت انخفاض كبير في التعبير RPS6 (ف < 0.05) في البعوض حقن dsRPS6 حسبما يقرره الطالب الاختبار t بين عنصر التحكم دسجفب في نفس المجموعة (الشكل 4)5 .
وجرى تقييم الخصوبة من الإناث الفردية باستخدام العينة أوفيبوسيشن الموصوفة هنا. بعد 3 أيام بعد الحقن، كان البعوض الدم تغذية ونقلها في حاويات أوفيبوسيشن الفردية ويسمح بإرساء لإكمال. أحجام مخلب متوسط دورة جونوتروفيك الأولى خفضت إلى حد كبير لتعامل كلا dsRPS6 الزاعجة المصرية عبد اللطيف. (n = 102 من الإناث، والبيض (يعني ± SE) ± 0.8 1.3) و dsRPL26 معاملة (n = الإناث 86, 4.0 ± 1.1 البيض) عند مقارنتها بحقن دسجفب (n = 79 الإناث 49.3 ± 3.5 البيض، الشكل 5A). وأظهر تقييم مخلب بعد دورة جونوتروفيك ثاني أيضا أوفيبوسيشن انخفاض ملحوظ لكل من المجموعتين دسرنا معاملة، ولكن مع تأثير انخفاض حجم. مجموعة أحجام الزاعجة المصرية عبد اللطيف. متغير وهكذا فصل الوسائل كان يؤديها دن لاختبار5. كان معدل الوفيات الأربع العشرين ساعة عادة 3% أو أقل.
ولوحظ تأثير جرعة واضحا عند الحقن dsRPS6 من 1 ميكروغرام إلى 50 نانوغرام في الإناث Ae-مصرية، وحجم مخلب تفاوتاً كبيرا بالمقارنة مع الضوابط 1 ميكروغرام/أنثى دسجفب حقن في جميع ولكن جرعة dsRPS6 25 نانوغرام/أنثى (الشكل 5 (ب)).
Microinjection دسرنا في منزل من الذباب
تم حقن مستعمرة مستأنسة الذبابة (الحنجرة العادية) مع 5 ميكروغرام من بنيات دسرنا مصممة ضد ذبابة المنزل النصوص RPS6 و RPL269. كما لوحظ في Ae. مصرية، لوحظ انخفاض كبير في التعبير نسخة محددة على حد سواء (RPS6 و RPL26) وتخفيض في حجم مخلب(الشكل 4 و الشكل 5 ألف). تخفيض كبير في إعادة يحدده الطالب الاختبار t بين عنصر التحكم دسجفب في نفس المجموعة (ف < 0.05) واختبار هولم-صداق كان يستخدم لتحديد أهمية بين مخلب أحجام مختلفة مستأنسة م. مجموعات العلاج. أظهر تشريح المبيض تكون البويضات انخفاض في العلاجات dsRPS6 و dsRPL26، بينما دسجفب تغذية الذباب قد ترسب تغيرات طبيعية حسب تصنيفها على مقياس تيندال-بيسكو9.
رقم 1: Microinjection في الإعداد لتقديم ميكروفولوميس للكبار البعوض والذباب البيت. وتجري الحقن على الحشرات تخديره من البرد التي شنت على شرائح المجهر على مدى طاولة البرد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مواقع Microinjection Ae. مصرية و مستأنسة م. (أ) الكبار عبد اللطيف-مصرية يتم حقنها في الثلث الأوسط من ميسوكاتيبيستيرنوم. (ب) يتم حقن البالغين مستأنسة م. في ميسوبليورون. تشير الأسهم إلى مواقع الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الإعداد الحشري أوفيبوسيشن. (أ) الإنزيم أوفيبوسيشن عبد اللطيف-مصرية أكواب مع ورقة إنبات البذور كما الركيزة أوفيبوسيشن، توج بتول و 10 في المائة من القطن السكروز بالدماء. (ب) المياه الإناث الكبار مستأنسة م. في حاوية الإنزيم أوفيبوسيشن مع الغذاء (أ)، (ب)، ووسائط الإعلام اليرقات (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التعبير النسبي من RPS6 في Ae. مصرية و مستأنسة م. حقن دسرناس إبلاغها. بعوض الزاعجة المصرية و مستأنسة م. تم حقن ميكروغرام 1 و 5 على التوالي من أما دسرنا عنصر التحكم (دسجفب) أو تصميم دسرنا ضد RPS6 أو RPL26 النصوص من كل الحشرات. تخفيض كبير (ف < 0.05) من RPS6 وقد لوحظ التعبير في البعوض والذباب حقن مع dsRPS6 والذباب حقن dsRPL26 (المشار إليها بواسطة علامات نجمية). تمثل أشرطة الخطأ يعني ± سراج الدين ورقم في العمود الأساسي يشير إلى عدد الأفراد الذين درست. وقد تم تعديل هذا الرقم من إستيب et al. 5 وسانسكراينتي et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: مخلب متوسط حجم Ae. مصرية و مستأنسة م. حقن دسرناس إبلاغها. (أ) ترسب البيض انخفضت انخفاضا كبيرا (ف < 0.05) في Ae. مصرية و مستأنسة م. بعد حقن ميكروغرام 1 و 5 على التوالي للتحكم أما دسرنا (دسجفب) أو دسرنا مصممة ضد النصوص RPS6 أو RPL26 من كل الحشرات. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة من عنصر التحكم دسجفب في نفس المجموعة. تمثل أشرطة الخطأ يعني ± سراج الدين ورقم في العمود الأساسي يشير إلى عدد الأفراد الذين درست. وقد تم تعديل هذا الرقم من إستيب et al. 5 وسانسكراينتي et al. 9- (ب) جرعة منحنى من الزاعجة المصرية عبد اللطيف- حقن dsRPS6 من 50 نانوغرام/أنثى إلى 1000 نانوغرام/أنثى يظهر تخفيضات كبيرة في خصوبة بالمقارنة مع الأفواج دسجفب حقن (50 و 100 و 1000 نانوغرام/أنثى). تمثل أشرطة الخطأ ± يعني 95% CI من 36-81 الكائنات الفردية للجرعة. تمثل النقاط على الحروف فرق كبير بين المجموعات (ف < 0.05) حددها ANOVA. وقد تم تعديل هذا الرقم من إستيب et al. 5- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
Microinjection أسلوب المعملية قيماً لضمان تسليم دسرنا أو بيوراتيونالس الأخرى (أي، مبيدات الآفات، والفيروسات، microsporidia). بينما تؤدي العديد من المختبرات microinjection، المبلغ بالضبط حقن غالباً غير واضح بسبب قيود تقنية نظام التسليم بحيث وحدة تخزين تم تسليمها لا يقاس مباشرة11. وحدة تخزين تم تسليمها وتركيز المعلمات الحرجة التي تسمح لحساب قياسي التدابير السمية مثل EC50 أو IC50 أو لتعريف الحد الأدنى الفعال جرعات5،16. وهذا مهم بشكل خاص في الدراسات الفنية باستخدام [رني] في الحشرات البالغة، حيث التسليم عن طريق التغذية لا يؤدي دائماً الجهازية التعرض للجسيمات المرجوة والجرعة الفعلية عبور الأمامي غير واضحة5.
بينما يمكن أن يكون الإجراء microinjection في البداية الصعبة، تتحقق تحسينات سريعة في دقة السرعة والتسليم مع الممارسة والصبر. إتقان الإجراء حقن نفسه استثمار وقت، ولكن مجرد إنجاز الإجراء ينتج نتائج قابلة للتكرار، والوفيات الناجمة عن الإصابات من < 3%. سيتم زيادة نسبة نجاح الحقن إجادة يزيد الحقن مما يسمح للبعوض 300 أو الذباب يوميا.
العديد من تحديات microinjection بسبب الإبرة المستخدمة. تحديد نقطة فاصل الإبرة الشعرية السليمة وزاوية نصيحة جانبا تحديا للإجراء وتتطلب بعض التجربة والخطأ لتحديد حجم الافتتاحية الأكثر فعالية لنوع معين. غرامة إبرة الأكثر فائدة للبعوض microinjection (~ 150 ميكرومتر) صغير جداً لسرعة تسليم حقن الذباب بينما على العكس من ذلك، الإبرة أكبر فتح أن يعمل على الذباب (~ 250 ميكرومتر) يتسبب في أضرار الإصابة الواسعة للبعوض أصغر حجم أكبر ووفيات الحقن غير مقبول. وكثيراً ما إبرة مكسورة مع تلميح كليلة من الصعب الحصول على عن طريق بشرة دون الأضرار الأنسجة وزيادة في معدل الوفيات. يمكن أن تسد جداول الحشرات أو قطع الأنسجة الإبر على مدى التجربة، حيث أنها غالباً ما تكون مفيدة للابر عدة انسحبت إذا استبدال مطلوب. وقد وجدنا أنه من الأسهل يحل محل إبرة صعبة بدلاً من قضاء بعض الوقت في محاولة لمسح إبرة التشويش أو عرقلة.
مراقبة دخول الحشرة الحل حقن أمر بالغ الأهمية حيث أن الحقن غير ناجحة يمكن إزالتها (انظر الخطوات 2.14 2.15). ويوفر والرودامين ب بالإضافة إلى حقن الحلول البصرية واضحة لضمان تلقي الجرعات المناسبة الحشرات نظموا الباردة ومفيد بشكل خاص أثناء ممارسة (راجع الخطوة 2.7).
حقن وأوفيبوسيشن أساليب العينة المعروضة هنا بنجاح التي يتسبب فيها الجينات تأثيرات المظهرية ضربة قاضية وقابلة للقياس في الكبار Ae. مصرية و مستأنسة م. عند استخدام دسرناس مصممة ضد إبلاغها ريبوسومال محاضر (الشكل 4 و الشكل 5 ألف). بالإضافة إلى ذلك، يتيح قدرة هذا الأسلوب على دقة تسليم ميكروفولوميس للأفراد للجرعة منحنيات الاستجابة إلى يتم إنشاؤها لكميات صغيرة من المواد (ما يصل إلى 50 نانوغرام؛ الشكل 5 (ب)). وهذا مفيد بشكل خاص لأساليب مثل فحص سيرناس أو دسرناس، كما تنتج كميات كبيرة من هذه الجزيئات يمكن أن تكون باهظة التكلفة.
يمكن تعديل هذا الأسلوب لحقن المواد البيولوجية (الفيروسات والبكتيريا، microsporidia) أو مبيدات الآفات الكيميائية، بعد التأكد من أن أي المخازن المؤقتة للتسليم حميدة بالحقن. كما يقتصر حجم التسليم بحجم الحشرة، المنتجة تتركز اختبار الحلول لها أهمية.
لتقييم فعالية دسرنا على نحو كاف، من الضروري أن تتبع أوفيبوسيشن كما تعمل الفتاكة قد تتظاهر فقط في ذرية. كما عرضت هنا، عقد الإناث Ae-مصرية بشكل منفصل بعد بلودينج يسمح لتحديد حجم مخلب الفردية، ويمكن أن يتم إجراء مزيد من التجارب على نفس الأفراد المتلقين للمعلومات من أوفيبوسيشن (أي دراسات التعبير الجيني، جونوتروفيك إضافية دورات، ضربة قاضية خاصة الأنسجة) للربط بين مخرجات الإنجابية مع تدابير أخرى مثل التعبير الجيني. كما مستأنسة م. أوفيبوسيت عموما في استجابة فريق، التحريض على الذباب جرابيد معزولة إرساء هو جداً العمل المكثف وغير عملي لإعداد كبيرة من الأفراد17. لذلك، يعرض طريقة لتحديد حجم مخلب يعني.
يوفر الأسلوب microinjection المعروضة هنا التسليم منهجية متسقة للبعوض والذباب البيت. مقترنة بوفيات وأوفيبوسيشن تتبع المقايسة، تنوعاً استخدام هذه الأدوات يمكن لتقييم آثار النسخي والمظهرية لجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة والعوامل البيولوجية، ومبيدات الآفات التقليدية حيث التسليم الشفوي غير قابلة للبقاء.
Disclosures
جميع المؤلفين بالموظفين أو المقاولين من وزارة الدفاع أو وزارة الزراعة في الولايات المتحدة. هذه المخطوطة وأنتج خلال الواجبات الرسمية والقانون في المجال العام. الآراء التي أعرب عنها تمثل رأي المؤلفين ولا تمثل موقف رسمي أو تأييد من الحكومة الأمريكية. ذكر لمنتج تجاري ليست توصية للاستخدام.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون هانايو اريموتو (البحرية الأمريكية)، دانا جونسون ولي لوسي والأبيض روكسي (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية) للمساعدة في الحصول على البيانات وتحليلها. كما نشكر الدكتور بيا أولافسون (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية) ووو كه (جامعة فلوريدا) لاستعراض دقيق للمخطوط وهوستيتلير نيكلاوس (جامعة فلوريدا) لتصوير لقطات المجهر. تم توفير التمويل بوزارة الزراعة، المشروع ج وي-141 من البحرية ومركز الصحة العامة في سلاح البحرية، ونشر برنامج حماية مقاتلي الحرب. وكان الممولين أي دور في تصميم أو الاتجاه للدراسة أو التطوير من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
