Summary
이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.
Abstract
RNA 간섭, 유도 하는 데 사용 하는 합성 dsRNAs 복용량 의존 phenotypic 효과 있을 수 있습니다. 이러한 효과 dsRNAs 비 양적 방법을 사용 하 여 배달 되는 경우를 정의 하기 어려운 있습니다. 알려진된 양의 핵 산 또는 다른 화학 물질의 정확한 전달이 테스트 중인 화합물의 효능을 측정 하 고 신뢰할 수 있는 비교 화합물 중요 합니다.
여기 우리는 일반적으로 사출 부상에 의해 유도 된 사망률 감소 dsRNA의 특정 복용량의 정확한 배달을 보장 하는 재현성, 양적 microinjection 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 수정 Rhodamine B, 졸업된 주사 바늘의 추가 포함 하 고 향상 된 복구 방법 하면와 콜린스에서 빌린. 이 메서드는 복용량 응답의 계산을 허용 하 고 화합물 사이 비교를 용이 하 게. 이 메서드의 버전은 성공적으로 통치 유전자 리보솜 RNA 사본을의 입을에서 결과에 감소를 평가 하기 위해 모기 집 파리의 3 속에 사용 되었습니다.
이 프로토콜은 작은 곤충 microinjection의 몇 가지 과제를 줄이기 위해 전략을 제공 합니다. DsRNAs 시각적 확인 동반의 함께, 기계적 배달, 배달, 효과적인 위치 식별 및 포스트 주입 복구 기간 포함 정확한 먹이 지 고 낮은 부상 사망 확인 합니다. 이 프로토콜은 또한 통치에 대 한 효과의 유니폼 결정에 대 한 산란 검정을 설명합니다.
Introduction
성인 dipterans에 작은 생체, 핵 산 등을 제공 하는 Culicidae와 Muscidae에도 전하실을 입증 했다. 불 임 (때 독점적으로 유전자를 대상으로 성인의 고환에 표현)과 사망률 (때 대상 SNF7 및 스테로이드 수용 체 coactivator) 애벌레 Aedes aegypti생산 dsRNAs의 구두 글귀 보고 되었습니다1,2 . 사망률 또한 애벌레 파리 자리 부채에 HSP70을 대상으로 관찰 되었습니다3. 그러나 이러한 phenotypic 효과,, 하지 설탕 식사4,5성인 Ae aegypti dsRNA 먹이 후 이어지고 있다.
Microinjection 때 병원 체 또는 핵 산, 그로 인하여 유도 하는 조직의 반응5,6,,78,9,10 소개는 midgut를 우회 하는 데 사용 되었습니다. . 몇몇 microinjection 기술은 존재 한다, 자동된 볼륨 배달 2.3 최저 허용 하는 마이크로프로세서 제어 인젝터 분사 볼륨의 시각적 측정을 필요로 하는 사내 생산된 기구에서 배열 하는 장비와 관련 된 nL 5 , 9 , 10 , 11. ribosomal mRNAs를 표적으로 하는 RNA 간섭 (RNAi) 트리거 절지동물 소 틱 Rhipicephalus microplus, 다양 한와 Culex pipiens, Aedes aegypti 모기 난소 개발 중단 그리고는 집에서 파리 파리 자리 부채5,9,,1213. 이러한 연구에서 산란의 장애 모니터링 종료 또는 자손의 표현 형 명단 수도는 접종의 효능을 결정 하기 위한 필수적 이었다. 이것은 같은 Wolbachia-비 전통적인 biocontrol 방법의 많은 것에서 중요 하 고 원하는 효과 남성 소개 (성적 비호 환성) 감염 및 RNAi 유도 무 균5은 대가족제 치명적인 표현 형의 형태 ,,914. 사망률과 통치를 추적 하는 것은 특성화 및 매우 구체적인 biorationals (자연적 사건 병원 체 그리고/또한 자연 파생 상품)15의 개발 필요.
이 프로토콜 제공 성인 모기와 집 파리;에 대 한 자세한 microinjection 기술 종종 잘 문학에서 설명 하는 프로세스입니다. 또한, 산란 검정 방법론 성인 dipterans에 dsRNA 효과 적절 하 게 평가 하는 설명 합니다. 이러한 프로토콜 Aedes aegypti 및 파리 자리 부채 를 위해 특별히 개발 되었다 그러나 다른 종에 대 한 수정할 수 있습니다.
Protocol
1. 곤충 준비
- 몇 시간 동안 또는 CO2 를 2 분 노출 4 ° C에서 그들을 재미을 누른 다음 주사 전에 4 ° C에서 모기를 anesthetize. 감기 주사 전에 h 4 ° C 2\u20123에서 파리 anesthetize. 모기와 파리는 성관계를 산란 응답 변수 인지 확인 하십시오.
참고: 모기 anesthetization 메서드는 종 및 변형에 따라 다릅니다, 그리고 예를 들어, Culex Aedes aegypti 보다 차가운 anesthetization에서 훨씬 빨리 복구 및 따라서 CO2 최저 바람직합니다. - 얼음, 신중 하 게 단계 모기 또는 파리 ventrally 그들을 부드러운 집게를 사용 하 여 노출 현미경 슬라이드 ~0.5 c m 간격에. 표준 슬라이드 6 모기의 두 행을 저장할 수 또는 6-7 집 파리. 모기 또는 슬라이드 처리를 돕기 위해 파리의 명확한 슬라이드의 왼쪽 이나 오른쪽 끝에 1-1.5 c m의 공간을 남겨 주세요.
- 주입에 대 한 준비까지 큰 접시에 4 ° C에서 준비 된 곤충의 슬라이드를 계속.
참고: Petri 접시 뚜껑을 통해 구멍을 드릴 때 상한 공기 변위에 의해 방해 되 고에서 곤충을 방지 도움이 됩니다. 몇 접시 바닥에 확보 유리 모 세관에 슬라이드 배치 페 트리 접시에서 제거를 쉽게 것입니다.
2. 곤충 주입
- Estep 외 에 설명 된 대로 dsRNA를 준비 5 와 Sanscrainte 외. 9. 만약, 오염 물질의 무료 dsRNA 수 측정할 수 260 nm로260 × 희석 비율 × 40 μ g/mL에서 계산 RNA 농도에서 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 진정 표 또는 얕은 얼음 양동이 현미경 및 microinjector를 해 부 하도록 설정 냉 취 모기와 파리 (1.1-1.3 단계 및 그림 1참조)에 주사를 수행.
- 유리 모 세관 바늘 끌어당기는 사람와 좋은 팁을 당겨 (설정: 히터 = 15 단위, 솔레노이드 = 4 A).
주: 제조업체의 세부 사항에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. - 모 세관 바늘을 날카로운 포인트를 생산 하는 집게의 쌍을 곤란 하 게 하 여 제조업체의 지침과 휴식 바늘 팁에 의하여 microinjector에 넣으십시오.
참고: 제안된 바늘 오프닝 크기는 모기에 대 한 ~ 150 µ m 및 집 파리에 대 한 ~ 250 µ m입니다. - 원하는 배달 볼륨에 대 한 microinjector를 설정 합니다. ~ 50 nL aliquots에서 초승달 모양 움직임은 쉽게 관찰 하 고 모기 microinjections에 대 한 권장. 가능한 경우, 빠른 주입 설정 가능 작성 및 추방 nuclease 무료 물 3 번 바늘을 씻어.
- 주입 농도 100\u2012150 nL 모기에 대 한 원하는 복용량 그리고 500 nL 제공할 것입니다 같은 제공에 원하는 집 파리에 대 한 복용량에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
참고: 제안 초기 복용량: 1 µ g 대는 각 모기 및 각 집 파리5,95 µ g. - 선택적으로 모기, Rhodamine B (시각화에 도움) 3.0 µ g/mL의 최종 농도에 솔루션을 추가 합니다.
참고: 염료 복 부/가슴 교차로에서 복 부 표면에 거의 분명 표 피를 통해 주입 후의 핑크 색상으로 명확 하 게 표시 됩니다. - 하 주사 (파라핀 필름의 조각) 등 깨끗 한 표면에 유리 바늘으로 공기에서 빠는 없이 솔루션의 3-4 µ L 플라스틱 액체는 바늘에서 분배 하 여 섬세 한 작업와이 퍼와 물방울을 닦아 부드럽게 시작 될 때까지 반복 해 서 넣기 버튼을 눌러.
참고: microinjectors의 일부 모델 필요 하지만 백필 주사기, 인젝터 재료의 테이블에서 에서 참조 하지 않습니다. - 울트라 벌금 포인트 마커를 사용 하 여 해시 마크 ~ 1 mm 떨어져 시작 액체 초승달 모양에서 바늘 칼을 그립니다. 이 초승달 모양 움직임을 시각화에 도움이 되며 솔루션은 주입 동안 모기를 입력 확인.
- 진정 테이블 또는 얼음 (그림 1)에 바늘에서 모기 또는 파리 (로 단계 1.2-1.3에서에서 준비)의 슬라이드를 설정 합니다. 확인 현미경에서 그의 시야는 넓은 바늘에 솔루션 초승달을 볼 정도로.
- 모기에 대 한 mesokatepisternum (그림 2A)의 중간 1/3로 바늘을 정렬 하 고 반대편에 배치 집게와 바늘에 대 한 모기를 보강 하는 동안 부드럽게 찌르는 바늘 팁 사용 하 여 표 피는 microinjector 마이크로 미터입니다.
- 집 파리에 대 한 mesopleuron (그림 2B)와 바늘을 정렬 하 고 바늘에 대 한 비행을 보강 하면서 부드럽게 펑크 바늘 팁과 표 피.
- 부드럽게 모기에 바늘을 슬라이드 또는 끝 중간 선 통과 될 때까지 신체를 비행.
참고: 곤충에서 주입 된 액체 구슬에서 결과 수시로 너무 얕은 바늘을 삽입 (단계 2.15 참조). - 원하는 양의 액체 주입 되어 때까지 바늘에 액체 초승달의 움직임을 보면서, 넣기 버튼을 눌러. 모기에 대 한 경우 50.6 nL aliquots로 설정, ~ 100에 대 한 2 X를 눌러 nL 또는 3 배 ~ 150 nL. ~ 500 nL 주입 되어까지 넣기 버튼을 눌러 집 파리에 대 한 (즉, 69 nL aliquots와 7 X 483 눌러 nL).
- 초승달 모양 이동 하지 않으면 천천히 모기 슬라이드 또는 초승달 모양 운동에 대 한 보고 하는 동안 바늘을 비행. 만약 주입된 솔루션 비즈 바늘 제거 또는 이동, 실패 하는 초승달 모양의 표 피에서의 부분 취소로 곤충이이 주입 실패 했다.
- 10-15의 그룹에 성공적으로 삽입 된 모기 또는 3.5 온스 컵 개최를 취소 하는 5의 그룹에서 집 파리를 전송 합니다. 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 실내 온도에 복구.
- 모기와 파리 (1-2 h) 회복, 후 10% 자당 해결책으로 흠뻑 목화 공을 통해 각 지주 컵을 반전.
참고: 설탕 식사10에 쉽게 액세스를 제공 하 여 생존에 자당 면 에이즈 위에 컵의 반전 - 단계 2.5 주입 솔루션 사이 바늘을 씻어. 완료 되 면 주입, 폐기 적절 한 sharps 용기에 바늘을 사용 합니다.
3. aedes aegypti 사망률과 산란 검정
- 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 모기 제공 가시 죽은 모기의 수를 기록.
- (예: 콜라겐 소시지 케이싱) ≤12-인치 인공 막을 신선한 혈액 (즉, Aedes aegypti소)과 뜨거운 물 목욕에서 60 ° C에 열을 채우십시오.
- 짧게 막 종이 타월에 압 연 하 여 건조 하 고 3.5 온스 투명 컵을 들고의 얇은 명주 그물 모자에 걸쳐 누워. 을 강화 하기 위해 먹이 phagostimulant 또는 핸들 케이스 표면에 인간의 휘발성을 떠나 깨끗 한 맨 손으로 따뜻하게 혈액 소시지를가 열 후 혈액 1 m m ATP 스파이크.
- 혈액 공급, 후 10% 자당 지주 컵 위에 적셔 목화 공을 교체 하 고 모기 산란 컵을 전송 하기 전에 ~ 24 h 동안 휴식을 허용.
- 작성 하 여 건설 산란 컵 취소 ~ 30 mL 이온된 H2O와 씨앗 발 아 종이 조각을 배치 3.5 온스 검정 컵 (~ 4 c m 폭 및 5 cm 긴 능선 수직 실행) 측면 (그림 3A)에 대 한 컵의 아래쪽에 . 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 얇은 명주 그물 이나 그물 모자에 작은 슬릿 (~ 1 cm)를 잘라.
- 24 시간 후 혈액 공급에서 작은 슬릿 (~ 1 cm) 지주 컵의 얇은 명주 그물 모자에 자르고 성공적으로 먹이 개별 여성 전송-복 부에 보이는 혈액 bolus로-산란 컵 (1 여성/산란 컵)으로 부드러운 입 포부에 의해. 10% 자당 포화 목화 공 함께 산란 모자에 작은 상처를 봉인.
- 모기 완전히 일일 사망률을 추적 하는 동안 oviposit를 허용 하도록 5\u20127 일 ~ 27 ° C에서 컵을 개최. 해 범위에서 계란을 계산 합니다.
4. 파리 자리 부채 사망률과 산란 검정
- 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 파리 제공 가시 죽은 파리의 수를 기록.
- 주입 후 3 일 짧게 모든 파리는 컵의 바닥에 움직이지 않는 때까지 들고 컵에 CO2 를 분배 하는 폴 리 에틸렌 튜브를 배치 하 여 파리를 anesthetize.
- 깨끗 한 케이지 stockinette 소매 취재 열기 (10 cm, 그림 3B)와 4 L 플라스틱 용기 구성에 파리를 전송. 제공 된 파리 물 입자가 굵은 자당의 혼합물 우유, 가루 및 달걀 노 른 자는 8에 건조: 4 일간 (볼륨)에 의해 8:1 비율, 기록 하 고 죽은 제거 매일 날아.
- 75% 밀 밀기 울 25% 수송과 가축 체중으로 사료와 혼합 하 여 신선한 비행 거리 애벌레 양육 매체에 대 한 마른 재료를 준비 합니다. (때까지 한 방울의 물 밖으로 겨우 압착 수) 62% 습기를 도달할 물을 추가 합니다.
- 위의 신선한 애벌레 미디어의 1:1 혼합물에서 2.5 cm 직경 공 준비와 애벌레 중간 비행 "사용" (파리는 pupated 이전 매체). 검은 무명 천으로의 광장에 공을 랩, 중간 액체, 새 어 나온 때까지 가볍게 짠 다 다음 공 주위 장소에서 옷감을 고무 밴드를 사용 합니다.
- 60 mL 컵에 볼을 넣고 5 h (그림 3B)에 대 한 비행 감 금 소에.
- 산란 공을 달걀 린스를 계란 옷감의 주름에서 제거 되도록 합니다. 계란을 나누며 피펫으로 졸업된 20 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 전송 하 고 클러스터를 흔들어.
- 계란 정착 고 졸업된 튜브에 정착된 계란의 볼륨 때까지 기다립니다. 볼륨 최대 20 배 정착된 계란의 볼륨을가지고 충분 한 물을 추가 합니다. 기록 물 플러스 계란의 총 볼륨입니다.
- 물과 계란 정지 자기 볶음 바 또는 활발 한 교 반 혼합 하는 동안 사용 1 mL 피펫으로 팁 (팁 잘라 끝) 라인의 일련에 사전 moistened 검은 헝겊 조각에 물과 달걀 현 탁 액의 0.5 mL를 분배 하. 계산 해 현미경 계란.
- 단계 4.9 두 번 더 반복 합니다. 경우는 수 중 심각한 국외 자 (즉, 에 의해 다른 두 건의에서 다릅니다 > 35%), 4 수를 하 고 국외 자 무시.
- 샘플 당 계란의 평균 수를 계산 하 고 2는 서 스 펜 션의 계란/mL 수로이 값을 곱하면. 단계 4.8에서에서 계란의 서 스 펜 션의 볼륨에 의해 얻은 달걀/mL 값을 곱하면 됩니다. 이것은 누워 계란의 총 수에 대 한 견적 이다.
Representative Results
모기에 dsRNA의 microinjection
이 microinjection 메서드는 여러 모기 속 (Aedes, Anopheles, Culex)에 걸쳐 유전자 발현, 사망률 및 산란 80 dsRNA 트리거에 대 한 응답을 평가 하 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. Ae aegypti (ORL1952)의 식민지 변형에서 여성 dsRNA ribosomal 성적표 (참조 Estep 외. RPS6 및 RPL26에서에서 파생 된의 1 µ g 주입 dsRNA 생산 방법 및 시퀀스 데이터 5 ) 보여준 중요 한 다중 산란에 걸쳐 상대 식 (재)에서 감소 사이클 모기 제어 dsGFP 주사에 비해. Aedes aegypti 다시 2nd gonotrophic 주기 다음 측정 RPS6 식의 상당한 감소를 보여주었다 (P < 0.05) dsRPS6 같은 그룹 (그림 4)5 dsGFP 제어 스튜던트 t-검정에 의해 결정으로 주사 하는 모기에 .
통치는 여기 설명 된 산란 검정을 사용 하 여 개별 여성에서 평가 되었다. 3 일 후 주입 후 모기 혈액 공급, 개별 산란 컨테이너로 전송 완료를 허용 했다. 두 dsRPS6 Ae aegypti 취급에 대 한 첫 번째 gonotrophic 사이클에 대 한 평균 클러치 크기 크게 감소 (n = 102 여성, 1.3 ± 0.8 (평균 ± SE) 계란) 및 처리 하는 dsRPL26 (n = 86 여성, 4.0 ± 1.1 계란) dsGFP 주사에 비해 (n = 79 여성, 49.3 ± 3.5 계란 그림 5A). 두 번째 gonotrophic 주기 후 클러치 평가 또한 두 dsRNA 대우 그룹에 대 한 하지만 감소 효과 크기가 크게 감소 산란을 보였다. Ae aegypti 의 그룹 크기 변수 되었고 따라서 수단 분리 던의 테스트5에 의해 수행 됐다. 20-4 시간 사망률은 일반적으로 3% 이하로.
50 µ g 1에서 dsRPS6를 주입 하면 명확한 복용량 효력 관찰 되었다 여성 Ae aegypti, 및 클러치 크기 ng 25 ng/여성 dsRPS6 복용량 (그림 5B) 제외한 모든 주입 1 µ g/여성 dsGFP 컨트롤에 비해 크게 변화.
DsRNA 집의 microinjection 파리
식민지 파리 자리 부채 (정상 ORL)는 5 µ g의 dsRNA 구문 집 비행기 RPS6와 RPL26 증명서9에 대 한 설계와 함께 주입 했다. Ae aegypti에서 관찰 되었다 (그림 4 및 그림 5A)에 모두 특정 대 본 식 (RPS6 및 RPL26)의 상당한 감소와 클러치 크기 감소 관찰 되었다. 다시 중요 한 감소 같은 그룹의 dsGFP 제어 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (P < 0.05) Holm Sidak 테스트 다른 M. domestica 에 대 한 클러치 크기 사이 의미를 결정 하는 데 사용 되었다 치료 그룹. DsGFP 파리를 먹이 틴데일 비스코 규모9에 별 정상 vitellogenin 증 착 했다 동안 난소 해 dsRPS6 및 dsRPL26 치료 감소 oogenesis를 보였다.
그림 1: 성인 모기 및 집 파리 microvolumes를 제공 하기 위한 Microinjection 설치. 주사는 현미경 슬라이드에서 진정 테이블 준비 냉 취 곤충에 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Ae aegypti 및 M. domesticaMicroinjection 사이트. (A) 성인 Ae aegypti 는 mesokatepisternum의 중간 1/3에 주입 됩니다. (B) 성인 M. domestica 는 mesopleuron에 주입 됩니다. 화살표는 주사의 사이트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 산란 검정 설치. (A) Ae aegypti 산란 분석 결과 산란 기판, 얇은 명주 그물 및 10% 자당 흠뻑 목화와 함께 출장으로 씨앗 발 아 종이 컵. (B) 성인 여성 M. domestica 산란 분석 결과 컨테이너에서와 음식 (A), 물 (B), 그리고 애벌레 미디어 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Ae aegypti M. domestica 종의 dsRNAs 주사에서 RPS6의 상대 식입니다. Aedes aegypti 와 M. domestica 어느 제어 dsRNA (dsGFP)의 각각 1과 5 µ g을 주입 했다 또는 dsRNA 성적표 각 곤충에서 RPS6 또는 RPL26에 대 한 설계. 상당한 감소 (P < 0.05) RPS6의 식 모기와 파리 dsRPS6와 주입 파리 dsRPL26 (별표로 표시 된) 주사에 의해 관찰 되었다. 오차 막대는 평균 ± SE 나타내고 기본 열 번호 검사는 개인의 수를 나타냅니다. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5 와 Sanscrainte 외. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Ae aegypti 및 M. domestica 종의 dsRNAs 주사의 평균 클러치 크기입니다. (A) 계란 증 착 크게 감소 했다 (P < 0.05) Ae aegypti 에 어느 컨트롤의 각각 1과 5 µ g의 주사 후 M. domestica dsRNA (dsGFP) 또는 dsRNA 각 곤충에서 RPS6 또는 RPL26 성적에 대 한 설계. 별표는 같은 그룹의 dsGFP 컨트롤에서 상당한 차이 나타냅니다. 오차 막대는 평균 ± SE 나타내고 기본 열 번호 검사는 개인의 수를 나타냅니다. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5 와 Sanscrainte 외. 9. Ae aegypti 1000 ng/암 으로부터 50 ng/여성 dsRPS6 주사의 (B) 복용량 곡선 dsGFP 주입 동료에 비해 통치에 상당한 절감을 보여줍니다 (50, 100, 및 1000 ng/여성). 오차 막대는 복용량 당 36-81 개별 유기 체에서 평균 ± 95 %CI 나타냅니다. 문자로 포인트 대표 그룹 간의 중요 한 차이 (P < 0.05) ANOVA로 식별. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Microinjection 전달의 dsRNA 또는 다른 biorationals (즉, 살충제, 바이러스, microsporidia) 하는 귀중 한 실험실 기술입니다. 많은 실험실 microinjection를 수행 하는 동안 정확한 양을 주입 명확 하지 않습니다 종종 배달 시스템의 기술적인 제한으로 인해 하지 직접 측정된11의 배달된 볼륨은. 배달된 볼륨 및 농도 EC50 등 IC50 표준 독성 측정의 계산을 허용 하는 중요 한 매개 변수 또는 정의 최소한의 효과적인 복용5,16. 이것이 성인 곤충을 먹이로 납품 귀착되 지 않는다 항상 원하는 입자에 조직의 노출 및 건너는 midgut 실제 복용량은 불분명5에 RNAi를 사용 하 여 기능 연구에서 특히 중요 합니다.
Microinjection 프로시저 수 있지만 처음 도전, 연습과 인 내와 함께 속도 배달 정확도에 급속 한 개선 달성 된다. 주입 절차 자체를 지배 하는 것은 시간 투자 하지만, 성취, 일단 절차 생산 하 고 반복 가능한 결과의 상해 사망률 < 3%. 능력 300 모기의 수 주입을 증가 하거나 1 일 파리 성공적인 주사의 비율 증가 합니다.
Microinjection 과제 중 많은 사용 되 고 바늘 예정 이다. 적절 한 모 세관 바늘 브레이크 포인트와 팁 각도 결정 절차의 도전적인 측면 고 특정된 종족에 대 한 가장 효과적인 오프닝 크기를 확인 하려면 몇 가지 시행 착오를 요구 한다. 모기 microinjection (~ 150 µ m)에 대 한 가장 유용한 벌금 바늘이 너무 작아 반대로, 큰 바늘에는 파리 (~ 250 µ m)에서 작동 되도록 광범위 한 부상을 손상 작은 모기 여 동안 파리에 주입 하는 더 큰 볼륨을 신속 하 게 제공 그리고 허용 되지 않는 주입 사망률입니다. 무딘 팁 깨진 바늘은 종종 조직 손상과 사망률 증가 없이 표 피를 통해 얻을 수 어렵습니다. 곤충 비늘 이나 조직 조각 막힐 수 있습니다 바늘 실험의 과정을 통해 그것은 종종 여러 바늘 뽑아 교체가 필요한 경우 도움이 그래서. 우리는 쉽게 걸린 또는 더럽혀진 바늘을 취소 하려고 시간을 보내고 하는 것 보다 어려운 바늘을 교체 하는 것을 발견 했다.
실패 한 주사 (2.14-2.15 단계 참조) 제거 될 수 있도록 주입 솔루션 입력 곤충을 관찰 하는 것이 중요 합니다. 주입 솔루션 rhodamine B 또한 감기 개최 곤충 적절 한 먹이 지 수신 고 (단계 2.7 참조) 연습 하는 동안에 특히 유용 명확한 시각을 제공 합니다.
여기에 제시 된 주입 및 산란 검정 방법 성공적으로 유전자를 유도 해야 성인 Ae aegypti 에 M. domestica 에 대 한 종의 ribosomal 설계 dsRNAs를 사용 하 여 최저이 고 측정 가능한 phenotypic 효과 성적 증명서 (그림 4 및 그림 5A) 또한, 정확 하 게 개인에 게 microvolumes를 제공 하는이 방법의 능력 복용량 응답 곡선이 물자의 적은 양을 위해 생성 될 수 있습니다 (최저 50 ng; 그림 5B)입니다. SiRNAs 심사 같은 방법을 위해 특히 유용 또는 dsRNAs, 이러한 분자의 대량 생산으로 비용 금지 일 수 있다.
이 메서드는 주입에 의해 어떤 배달 버퍼는 무해 하지 확인 한 후 생물 학적 에이전트 (바이러스, 박테리아, microsporidia) 또는 화학 살충제를 주입 하 수정할 수 있습니다. 로 배달 볼륨 집중 생산 곤충의 크기에 의해 제한 됩니다 테스트 솔루션은 중요 합니다.
DsRNA 효능을 적절 하 게 평가 하려면 치명적인 고기만 자손에서 매니 페스트 수 있습니다으로 산란을 추적할 필요가 있다. 여기에 제시 된 대로 blooding 후 여성 Ae aegypti 를 별도로 들고 개별 클러치 크기 결정에 대 한 허용 하 고 동일한 개인에 추가 테스트를 할 수 있는 (즉, 유전자 표현 연구, 산란의 다운스트림 추가 gonotrophic 사이클, 조직의 특정 최저) 유전자 발현 같은 다른 측정을 가진 생식 출력을 연결할. M. domestica 그룹 응답에 일반적으로 oviposit, 선동을 격리 벗 파리는 매우 노동 집약적인 하지 개인17의 큰 숫자에 대 한 실용적. 따라서, 평균 클러치 크기를 결정 하는 방법을 제시 합니다.
여기에 제시 된 microinjection 메서드 모기와 집 파리를 일관 된 체계 배달을 제공 합니다. 사망률과 산란 생물 검정 추적와 결합, 이러한 다양 한 도구 사용할 수 있습니다 작은 RNA 분자, 생물 학적 에이전트 및 전통적인 살충제의 transcriptional phenotypic 효력을 평가 하기 위해 구두 배달 가능한 아니다.
Disclosures
모든 저자는 직원 또는 미국 농 무부 또는 국방부의 계약자. 이 원고 공무의 과정 동안 만들어진 이며 공개 도메인에 법률에 의해. 표현 작가의 의견을 대표 하 고 미국 정부에 의해 공식적인 위치 또는 지지를 대표 하지 않는다. 상용 제품의 언급은 하지 사용에 대 한 추천입니다.
Acknowledgments
저자 감사 Hanayo 아리 (미 해군), 다 나 존슨, 루시 리, 그리고 록 시 화이트 (미국 농 무부-ARS)에 대 한 데이터 수집 및 분석 도움이. 우리 또한 감사 박사 피아 Olafson (미국 농 무부-ARS), 애 우 (플로리다 대학) 원고와 니클라우스 Hostettler (플로리다 대학)의 중요 한 검토에 대 한 현미경 영상 촬영. 자금 USDA, 해군 및 해병대 부 대 보건 센터, 그리고 배포 전쟁 전투기 보호 프로그램의 WII-141 C 프로젝트에 의해 제공 했다. Funders는 디자인 또는 연구의 방향 또는 원고의 개발에 아무런 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
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