इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक microinjection पद्धति है कि हम मानकीकृत किया है और कई वर्षों के लिए इस्तेमाल के लिए न्यूक्लिक एसिड की विशिष्ट मात्रा में मच्छरों और घर मक्खियों के hemolymph सीधे देने के लिए । इस प्रोटोकॉल न्यूनतम इंजेक्शन मृत्यु दर में परिणाम और खुराक fecundity की माप संबंधित अनुमति देता है.
सिंथेटिक dsRNAs, आरएनए हस्तक्षेप प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया, खुराक निर्भर phenotypic प्रभाव हो सकता है. ये प्रभाव यदि dsRNAs एक गैर-मात्रात्मक विधि का उपयोग कर वितरित कर रहे हैं को परिभाषित करने के लिए कठिन हैं । न्यूक्लिक एसिड या अन्य रसायनों की ज्ञात मात्रा का सटीक वितरण यौगिक परीक्षण किया जा रहा की प्रभावकारिता को मापने के लिए और यौगिकों के बीच विश्वसनीय तुलना की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है.
यहां हम एक reproducible, मात्रात्मक microinjection प्रोटोकॉल है कि dsRNA की विशिष्ट खुराक के सटीक वितरण सुनिश्चित करता है, आम तौर पर इंजेक्शन चोट से प्रेरित मृत्यु दर को कम करने प्रदान करते हैं । इन संशोधनों Rhodamine बी, एक स्नातक इंजेक्शन सुई के अलावा शामिल हैं, और एक बेहतर वसूली विधि Isoe और कोलिंस से उधार लिया । इस विधि की अनुमति देता है खुराक प्रतिक्रियाओं की गणना और यौगिकों के बीच तुलना की सुविधा. इस विधि के संस्करण सफलतापूर्वक मच्छरों के तीन पीढ़ी पर इस्तेमाल किया गया है और साथ ही घर मक्खियों राइबोसोमल आरएनए टेप के जीन मुंह बंद करने से उत्पन्न fecundity में कमी का आकलन करने के लिए.
इस प्रोटोकॉल छोटे कीट microinjection की कई चुनौतियों को कम करने के लिए रणनीतियों प्रदान करता है । साथ में, dsRNAs के यांत्रिक वितरण दृश्य सत्यापन के साथ, वितरण के लिए प्रभावी स्थानों की पहचान, और एक पोस्ट इंजेक्शन वसूली अवधि के शामिल किए जाने के सटीक खुराक और कम चोट मृत्यु दर सुनिश्चित. इस प्रोटोकॉल भी fecundity पर प्रभाव के समान दृढ़ संकल्प के लिए एक oviposition परख का वर्णन ।
छोटे न्यूक्लिक एसिड के रूप में, वयस्क dipterans करने के लिए Culicidae और Muscidae दोनों में चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है, जैसे dsRNAs के मौखिक रूप से बांझपन का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है (जब विशेष रूप से वयस्कों के परीक्षण में व्यक्त जीन लक्ष्यीकरण) और मृत्यु दर (जब लक्ष्यीकरण SNF7 और एक स्टेरॉयड रिसेप्टर coactivator) में लार्वा एडीज aegypti1,2 . लार्वा Musca domestica3में HSP70 को टारगेट करते समय मृत्युदर को भी देखा गया है । इस तरह के phenotypic प्रभाव, तथापि, चीनी भोजन में वयस्क Ae. aegypti को dsRNA खिलाने के बाद परिणाम नहीं है4,5।
Microinjection जब रोगज़नक़ों या न्यूक्लिक एसिड शुरू midgut दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जिससे एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया उत्प्रेरण5,6,7,8,9,10 . कई microinjection तकनीक मौजूद है, में घर से लेकर उपकरणों का उत्पादन किया है कि माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित इंजेक्टर कि स्वचालित मात्रा में प्रसव के लिए अनुमति के रूप में २.३ nL के लिए इंजेक्शन की मात्रा के दृश्य माप की आवश्यकता 5 , 9 , 10 , 11. आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) राइबोसोमल mRNAs लक्ष्यीकरण ट्रिगर्स, arthropods में डिंबग्रंथि के विकास में बाधा के रूप में विविध के रूप में मवेशी टिक Rhipicephalus microplus, मच्छरों एडीज aegypti और Culex pipiens, और घर उड़ Musca domestica5,9,12,13। इन अध्ययनों में, oviposition के विघटन की निगरानी inoculant की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए आवश्यक था के रूप में phenotype समाप्ति या संतान की कमी के रूप में प्रकट हो सकता है. इस multigenerational घातक phenotype का एक रूप है कि गैर के कई में एक महत्वपूर्ण और वांछित प्रभाव है Wolbachia-संक्रमित पुरुषों परिचय (यौन असंगति) और RNAi प्रेरित बांझपन की तरह पारंपरिक-5 ,9,14. दोनों मृत्यु दर और fecundity पर नज़र रखने निस्र्पक और अत्यधिक विशिष्ट के विकास के लिए आवश्यक है (स्वाभाविक रूप से रोगजनकों और/
इस प्रोटोकॉल दोनों वयस्क मच्छरों और घर मक्खियों के लिए विस्तृत microinjection तकनीक प्रस्तुत करता है; एक प्रक्रिया है कि अक्सर साहित्य में अच्छी तरह से वर्णित नहीं है । इसके अलावा, oviposition परख के तरीके पर्याप्त रूप से वयस्क dipterans पर dsRNA प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए वर्णित हैं । ये प्रोटोकॉल विशेष रूप से एडीज aegypti और Musca domestica के लिए विकसित किए गए थे लेकिन अन्य प्रजातियों के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
Microinjection dsRNA या अंय जैव-तर्कसंगत (यानी, कीटनाशक, वायरस, microsporidia) के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगशाला तकनीक है । जबकि कई प्रयोगशालाओं microinjection प्रदर्शन, सटीक राशि इंजेक्शन अक्सर वितरण प्रणाली की तकनीकी सीमाओं के कारण स्पष्ट नहीं है, जहां वितरित की मात्रा सीधे11मापा नहीं है. वितरित की मात्रा और एकाग्रता महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि ऐसे EC50 या IC50 के रूप में मानक विषाक्तता उपायों की गणना की अनुमति या ंयूनतम प्रभावी खुराक5,16को परिभाषित कर रहे हैं । यह कार्यात्मक अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है वयस्क कीड़ों में RNAi का उपयोग कर, जहां वितरण के द्वारा डिलीवरी हमेशा वांछित कणों के लिए प्रणालीगत जोखिम में परिणाम नहीं है और वास्तविक midgut पार खुराक स्पष्ट5है ।
जबकि microinjection प्रक्रिया शुरू में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, गति और वितरण सटीकता में तेजी से सुधार अभ्यास और धैर्य के साथ प्राप्त कर रहे हैं । माहिर इंजेक्शन प्रक्रिया ही एक समय निवेश है, लेकिन, एक बार पूरा, प्रक्रिया दोहराने परिणाम और चोट की मौत का उत्पादन < 3%. सफल इंजेक्शन का अनुपात वृद्धि के रूप में प्रवीणता ३०० मच्छरों के इंजेक्शन या प्रति दिन मक्खियों की अनुमति बढ़ जाएगी ।
microinjection की चुनौतियों के कई कारण सुई इस्तेमाल किया जा रहा है । उचित केशिका सुई तोड़ बिंदु और टिप कोण का निर्धारण प्रक्रिया का एक चुनौतीपूर्ण पहलू है और किसी दिए गए प्रजातियों के लिए सबसे प्रभावी खोलने के आकार का निर्धारण करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता है । ठीक सुई मच्छर microinjection के लिए सबसे उपयोगी (~ १५० µm) भी जल्दी से बड़ी मात्रा में मक्खियों में इंजेक्शन देने के लिए छोटा है, जबकि इसके विपरीत, बड़ी सुई खोलने कि मक्खियों पर काम करता है (~ २५० µm) छोटे मच्छरों के लिए व्यापक चोट क्षति का कारण बनता है और अस्वीकार्य इंजेक्शन मृत्यु दर । एक कुंद टिप के साथ टूट सुई अक्सर ऊतक क्षति और वृद्धि की मृत्यु के बिना छल्ली के माध्यम से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । कीट तराजू या ऊतक टुकड़े एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर सुई रोकना कर सकते हैं, तो यह अक्सर प्रतिस्थापन की आवश्यकता है, तो खींच लिया कई सुइयों के लिए उपयोगी है. हमने पाया है कि यह एक मुश्किल सुई की जगह के बजाय एक जाम या बेईमान सुई स्पष्ट करने की कोशिश करने के लिए समय बिताने के लिए आसान है ।
इंजेक्शन समाधान कीट में प्रवेश अवलोकन महत्वपूर्ण है ताकि असफल इंजेक्शन (2.14-2.15 कदम देखें) हटाया जा सकता है । इंजेक्शन समाधान के लिए Rhodamine बी इसके अलावा एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है कि ठंड का मंचन कीड़ों उचित खुराक प्राप्त है और विशेष रूप से उपयोगी है, जबकि अभ्यास (२.७ कदम देखें) ।
इंजेक्शन और oviposition परख तरीकों यहां प्रस्तुत सफलतापूर्वक जीन पछाड़ना और मध्यम श्रेणी का phenotypic प्रभाव वयस्क Ae. aegypti और M. domestica में प्रेरित किया है जब प्रजातियों के खिलाफ डिजाइन dsRNAs का उपयोग कर विशिष्ट राइबोसोमल टेप (चित्रा 4 और आंकड़ा 5 ए) । इसके अतिरिक्त, इस विधि की क्षमता को सही व्यक्तियों को microvolumes देने के लिए खुराक प्रतिक्रिया curves के लिए सामग्री की छोटी मात्रा के लिए उत्पंन होने की अनुमति देता है (के रूप में कम के रूप में ५० एनजी; चित्रा 5B). यह विशेष रूप से ऐसी स्क्रीनिंग siRNAs या dsRNAs के रूप में तरीकों के लिए उपयोगी है, के रूप में इन अणुओं की बड़ी मात्रा में उत्पादन लागत निषेध किया जा सकता है ।
यह विधि जैविक एजेंटों (वायरस, बैक्टीरिया, microsporidia) या रासायनिक कीटनाशकों इंजेक्षन करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के बाद कि किसी भी डिलीवरी बफ़र्स इंजेक्शन द्वारा अहानिकर है संशोधित किया जा सकता है । के रूप में वितरण की मात्रा कीट के आकार तक सीमित है, केंद्रित परीक्षण समाधान उत्पादन महत्व का है ।
पर्याप्त रूप से dsRNA प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, यह घातक phenotypes संतान में ही प्रकट हो सकता है के रूप में oviposition ट्रैक करने के लिए आवश्यक है. के रूप में यहां प्रस्तुत है, महिला एई aegypti अलग पकड़ के बाद व्यक्तिगत क्लच आकार निर्धारण और एक ही व्यक्ति पर आगे परीक्षण के लिए अनुमति देता है oviposition के बहाव किया जा सकता है (यानी, जीन अभिव्यक्ति अध्ययन, अतिरिक्त gonotrophic चक्र, ऊतक विशिष्ट पछाड़ना) जीन अभिव्यक्ति जैसे अन्य उपायों के साथ प्रजनन उत्पादन को सहसंबंधित करने के लिए. के रूप में एम. domestica आम तौर पर एक समूह की प्रतिक्रिया में oviposit, अलग gravid के लिए करना मक्खियों के लिए करना बहुत गहन श्रम और व्यक्तियों की बड़ी संख्या के लिए व्यावहारिक नहीं है17। इसलिए, मतलब क्लच आकार निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत है ।
microinjection विधि यहां प्रस्तुत मच्छरों और घर मक्खियों के लिए लगातार प्रणालीगत प्रसव प्रदान करता है । मृत्यु दर और oviposition ट्रैकिंग परख के साथ युग्मित, इन बहुमुखी उपकरण के लिए छोटे आरएनए अणु, जैविक एजेंटों के transcriptional और phenotypic प्रभाव का आकलन किया जा सकता है, और पारंपरिक कीटनाशकों जहां मौखिक वितरण व्यवहार्य नहीं है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों Hanayo Arimoto (यूएस नेवी), दाना जॉनसन, लुसी ली, और Roxie व्हाइट (USDA-ARS) डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ मदद के लिए धंयवाद । हम डीआरएस का भी शुक्रिया अदा करते हैं । पिया Olafson (USDA-ARS) और (फ्लोरिडा विश्वविद्यालय) के वू पांडुलिपि और Niklaus Hostettler (फ्लोरिडा विश्वविद्यालय) के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए माइक्रोस्कोप फुटेज फिल्माने के लिए । धन USDA, WII-नौसेना और मरीन कोर सार्वजनिक स्वास्थ्य केंद्र के 141C परियोजना, और तैनात युद्ध सेनानियों संरक्षण कार्यक्रम द्वारा प्रदान की गई थी । निधियों में पांडुलिपि के अध्ययन या विकास की डिजाइन या निर्देशन में कोई भूमिका नहीं थी ।
needle pulling | |||
vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
microinjector station | |||
Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mosquito oviposition bioassays | |||
large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
house fly oviposition bioassays | |||
4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |