Этот протокол описывает микроинъекции методологии, которая у нас есть стандартизированы и используются на протяжении нескольких лет для доставки определенного количества нуклеиновые кислоты непосредственно гемолимфа комаров и мух в дом. Этот протокол приводит к минимальным инъекции смертности и позволяет дозы коррелированных измерений плодовитость.
Синтетических двуцепочечных РНК, используется, чтобы вызвать РНК-интерференции, могут иметь дозы зависимой фенотипические эффекты. Эти эффекты являются трудно определить если двуцепочечных РНК доставляются с помощью не количественный метод. Точная доставка известных количеств нуклеиновых кислот или других химических веществ имеет решающее значение для измерения эффективности соединения тестируется и позволить надежное сравнение между соединениями.
Здесь мы предоставляем воспроизводимость, количественных микроинъекции протокол, который обеспечивает точную доставку определенных доз двуцепочечной ДНК, сокращение смертности, обычно вызванное инъекций травмы. Эти изменения включают добавление родамин B, окончил иглу, и улучшение восстановления метод заимствованы из Isoe и Коллинз. Этот метод позволяет расчет дозы ответов и облегчает сопоставление соединения. Версии этого метода успешно применялись на трех родов комаров, а также дома мух для оценки сокращения в результате сайленсинга генов рибосомной РНК стенограмм плодовитость.
Этот протокол обеспечивает стратегии сокращения несколько проблем малых насекомых микроинъекции. Вместе, механические доставка двуцепочечных РНК в сопровождении визуального контроля, выявления эффективных мест для доставки и включение впрыск восстановительного периода обеспечить точное дозирование и смертности низкий травмы. Этот протокол также описывает откладки яиц биопроб для единообразного определения воздействия на плодовитость.
Доставку небольших биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, Взрослый двукрылых оказался сложным в Culicidae и настоящие мухи. Производить стерильности (когда ориентация генов исключительно выражается в яичках взрослых) и смертности (при таргетинге SNF7 и стероидных рецепторов coactivator) в личинки Aedes aegyptiбыло сообщено устные поглощения двуцепочечных РНК1,2 . Смертности наблюдается также при нацеливании HSP70 в личиночной Муха domestica3. Однако, такая фенотипические эффекты, не привели после кормления двуцепочечной ДНК для взрослых А.е. aegypti в сахар питание4,5.
Микроинъекции был использован для обхода средняя при внедрении возбудителей или нуклеиновые кислоты, тем самым вызывая системный ответ5,6,,78,9,10 . Существует несколько методик микроинъекции, с участием оборудования, начиная от внутреннего производства аппаратов, которые требуют визуального измерения объёма инъекции с микропроцессором инжекторов, которые позволяют для автоматизированных объем доставки как низко как 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. РНК интерференции (RNAi) триггеры ориентации рибосомных мРНК, нарушить яичников развития членистоногих как скот клещ Rhipicephalus Дуо, комары Aedes aegypti и Culex pipiens, и дом Муха Муха domestica5,9,12,13. В этих исследованиях мониторинг нарушения откладки яиц был существенно важное значение для определения эффективности отливках, как фенотипа может проявляться как прекращение или сокращение потомства. Это форма многопоколенных смертоносных фенотипа, это критический и желаемого эффекта во многих нетрадиционных биоконтроля методы, такие как Wolbachia –инфицированных мужчин введение (сексуальной несовместимости) и RNAi-наведенный стерильности5 ,9,14. Отслеживание смертности и плодовитость необходимыми для развития весьма специфический biorationals (естественно-происходя патогенов или природные производные)15и характеристике.
Этот протокол представляет подробные микроинъекции методы для взрослых комаров и мух дома; процесс, который часто не хорошо описаны в литературе. Кроме того описаны методики биопроб откладки яиц адекватно оценить эффекты двуцепочечной ДНК на взрослых двукрылых. Эти протоколы были разработаны специально для Aedes aegypti и Муха domestica , но могут быть изменены для других видов.
Микроинъекции — ценный лабораторных техника для обеспечения доставки двуцепочечной ДНК или других biorationals (например, пестициды, вирусы, Микроспоридии). Хотя многие лаборатории выполняют микроинъекции, точное количество вводят неясно часто из-за технических ограничений системы доставки где поставленный объем не является непосредственно измеренное11. Поставленный объем и концентрации являются критическими параметрами, которые позволяют вычисление стандартных токсикологические мер, таких как ЭК50 или IC50 или для определения минимальной эффективной дозы5,16. Это особенно важно в функциональных исследований с помощью РНК-интерференции у взрослых насекомых, где доставка питания не всегда приводит к системного воздействия частиц желаемого и пересечения Средняя фактическая доза составляет неясным5.
В то время как процедура микроинъекции может быть изначально сложным, быстрого улучшения в скорости и доставки точности достигаются с практики и терпения. Овладение самой процедуры инъекции является инвестиции времени, но, после того, как достигнуто, процедура производит воспроизводимость результатов и травмы смертности < 3%. Коэффициент успешных инъекции будет увеличиваться как знание увеличивает разрешение инъекций 300 комаров или летит в день.
Многие из задач микроинъекции обусловлены используется игла. Определение надлежащих капилляров иглы точки останова и угол кончика является сложным аспектом процедуры и требует некоторых проб и ошибок, чтобы определить наиболее эффективный размер отверстия для данного вида. Тонкой иглой наиболее полезным для комаров микроинъекции (~ 150 мкм) слишком мал, чтобы быстро доставить больший объем, вводят в мух, а наоборот, более крупные иглы, открытие, что работает на мух (~ 250 мкм) повреждает обширные травмы меньше комаров и смертности неприемлемым инъекций. Сломанный с тупым кончиком иглы часто трудно получить через кутикулу без повреждения тканей и увеличение смертности. Насекомых чешуйки или куски ткани может засорить иглы в течение эксперимента, поэтому часто бывает полезно иметь несколько игл, если требуется замена. Мы нашли, что это легче заменить сложным игл, вместо того чтобы тратить время, чтобы попытаться очистить застряла или загрязненные иглы.
Наблюдая инъекционного раствора, введя насекомое имеет решающее значение, так что неудачной инъекции могут быть удалены (см. шаги 2.14 и 2.15). Родамин B дополнение к инъекционных растворов обеспечивает четкое визуальное обеспечить холодной поставил насекомые получают надлежащей дозировки и особенно полезно во время практики (см. шаг 2.7).
Инъекции а откладка Методы биопроб, представленные здесь успешно побудили генов нокдаун и измеримые фенотипические эффекты в взрослых aegypti А.е. и м. domestica при использовании двуцепочечных РНК направленных против вегетационных рибосомных стенограммы (рис. 4 и Рисунок 5A). Кроме того, способность этого метода точно доставить микрообъемах лицам позволяет дозы ответ кривых для небольшого количества материала (как низкий, как 50 нг; Рисунок 5B). Это особенно полезно для методов, таких как скрининг малые интерферирующие РНК или двуцепочечных РНК, как производство большого количества этих молекул может быть непомерно.
Этот метод может быть изменен придать биологическими агентами (вирусы, бактерии, Микроспоридии) или химические пестициды, после обеспечения того, чтобы все буферы доставки безобидные путем инъекций. Поскольку объем поставки ограничен размер насекомого, производство сосредоточено тестирование решения имеет важное значение.
Чтобы адекватно оценить эффективность малым интерферирующим РНК, необходимо отслеживать откладки яиц как смертоносное фенотипов может проявляться только в потомстве. Как здесь представлены, проведение женского А.е. aegypti отдельно после инфарктами позволяет для определения размера отдельных сцепления и дальнейшего тестирования на тех же лиц может быть сделано после откладки яиц (то есть, исследования выражение гена, Дополнительные gonotrophic циклы, ткани конкретных нокдаун) соотнести репродуктивные выход с другими мерами, например экспрессии генов. Как domestica м. обычно разведению в группе ответ, разжигание изолированных беременных мух заложить является очень труда интенсивной и не практичным для большого числа лиц17. Таким образом представлен метод для определения размера средней сцепления.
Микроинъекции метод, представленные здесь обеспечивает последовательное системных доставку для комаров и мух в дом. В сочетании с смертности и откладки яиц, отслеживание bioassays, эти универсальные инструменты могут использоваться для оценки транскрипционный анализ и фенотипические эффекты малых молекул РНК, биологических агентов и традиционные пестицидов где устные доставки не является жизнеспособным.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Arimoto Ханаё (ВМС США), Дана Джонсон, Люси ли и Рокси белый (USDA-ARS) для помощи с сбора и анализа данных. Мы также благодарим Drs. Пиа Уступи (USDA-ARS) и Ke Wu (университет Флориды) для критического обзора рукописи и Niklaus Hostettler (университет Флориды) для съемок Микроскоп кадры. Финансирование было предоставлено USDA, WII – 141C проект военно-морского флота и морской пехоты общественного здравоохранения центр и программа защиты развернутых бойцов войны. Спонсоры имел никакой роли в конструкции или направление исследования или разработки рукописи.
needle pulling | |||
vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
microinjector station | |||
Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mosquito oviposition bioassays | |||
large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
house fly oviposition bioassays | |||
4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |