Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lokalisatie van de Locus Coeruleus in de hersenen van de muis

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

De locus coeruleus is een kleine cluster van neuronen betrokken bij allerlei fysiologische processen. Hier beschrijven we een protocol ter voorbereiding van muis hersenen secties voor studies van eiwitten en metalen in deze kern.

Abstract

De locus coeruleus (LC) is een belangrijke zendmast voor noradrenaline produceren neuronen die moduleren van een aantal fysiologische functies. Structurele of functionele afwijkingen van LC gevolgen voor verschillende hersengebieden, waaronder cortex, hippocampus en kleine hersenen en kunnen bijdragen aan depressie, bipolaire stoornis, angst, evenals ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Deze aandoeningen worden vaak geassocieerd met metalen misbalance, maar de rol van metalen in LC is slechts ten dele begrepen. Morfologische en functionele studies van LC nodig zijn om de menselijke pathologieën en de bijdrage van metalen beter te begrijpen. Muizen zijn een gebruikte experimentele model, maar de muis LC is klein (~0.3 mm doorsnede) en moeilijk om te bepalen voor een niet-deskundige. Hier beschrijven we een stapsgewijze immunohistochemistry-gebaseerd protocol om te lokaliseren van de LC in het muis hersenen. Dopamine-β-hydroxylase (DBH), en anderzijds tyrosine hydroxylase (TH), beide enzymen sterk uitgedrukt in de LC, worden gebruikt als immunohistochemische markeringen in plakjes van de hersenen. Secties grenzend aan LC-bevattende secties bruikbaar zijn voor verdere analyse, met inbegrip van histologie voor morfologische studies, metabole testen, alsook metalen imaging X-ray fluorescentie microscopie (XFM).

Introduction

De locus coeruleus (LC) is een belangrijk gebied in de hersenstam en een grote site van noradrenaline (NE) productie1. De LC projecties in de hersenen2 naar de cortex, de hippocampus en de kleine hersenen3 stuurt en reguleert belangrijke fysiologische processen, met inbegrip van circadiane ritme4,5, aandacht en geheugen6, benadrukken7, cognitieve processen8en emotie9,10. Dysfunctie van LC heeft betrokken bij neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen11, met inbegrip van Parkinson ziekte12,13,14,14van de ziekte van Alzheimer, depressie15 ,16,17, bipolaire wanorde18,19, en angst20,21,22,23, 24. gezien deze rollen, analyse van LC is cruciaal voor het bestuderen van zijn functie en dysfunctie.

Muizen worden veel gebruikt voor het onderzoek van fysiologische en pathofysiologische processen. Vanwege hun kleine omvang heeft de muis LC een gemiddelde diameter van ~ 300 μm, wat leidt tot problemen lokaliseren van de structuur. Tijdens de hersenen afdelen, kan de LC gemakkelijk worden gemist in een coronale of Sagittaal secties. Beschikbare studies beschrijven identificatie van LC in dieren bieden niet een stapsgewijze protocol dat een niet-deskundige,1,25 volgen kan. Dus, als u wilt bieden begeleiding voor de lokalisatie van LC, beschrijven we een protocol die we ontwikkeld om te zoeken van deze regio in de hersenen van de muis voor verschillende toepassingen (Figuur 1, Figuur 2, , Figuur 3). Het protocol geldt zorgvuldig gecontroleerde hersenen afdelen en immunohistochemische detectie van DBH26,27, of als alternatief TH24, beide enzymen hoogverrijkt in de LC-28. Zodra LC door immunohistochemistry ligt, kunnen aangrenzende hersenen segmenten worden gebruikt voor verdere studies, met inbegrip van morfologische en metabole analyses, evenals metalen imaging studies via Röntgen fluorescentie microscopie (XFM)29. We beschrijven XFM als voorbeeld in dit protocol (Figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studies van dieren werd goedgekeurd door de Johns Hopkins Universiteit Animal Care en gebruik (ACUC) protocolnummer M017M385.

1. brain snijden

  1. Anesthetize om te immobiliseren, muizen door toepassing van 3% Isofluraan.
    1. Doordrenk een katoenen bal met druppels Isofluraan en plaats deze in een tube van 15 mL microcentrifuge. Plaats de neus van het dier in de buis en laat ze de Isofluraan inademt. Controleer of de diepte van de verdoving door het ontbreken van reactie op Teen-snuifje.
  2. Plaats het dier op zijn rug en immobiliseren het door haar ledematen pinning neer met een speld T terwijl het hebben van toegang tot haar buik.
  3. Snijd het dier met een chirurgische schaar doordat een knipsel van de buikhuid, en snijd via de huid in de regio van de thorax. PIN de huid naar beneden met behulp van T pinnen. Dan breken de peritoneale membraan tot de thorax. Het hart bloot door het kraken van de borstholte en snijden van het middenrif.
  4. Snijd de juiste atrium zodat het bloed stromen uit het dier. Invoegen van een 10 mL spuit met de naald van een 25-meter in het linkerventrikel en perfuse met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    Opmerking: Dit maakt het mogelijk de oplossing voor het doorstromen van de systemische circulatie en afsluiten door middel van de juiste atrium.
  5. Verwijder de 10 mL spuit en invoegen van een naald van de 25-meter aangesloten op de injectiespuit 60 mL. Perfuse via de linker ventrikel met 50 mL ijs koud 4% paraformaldehyde (PFA).
    1. Bereid ijs koud 4% PFA oplossing door verdunnen van 10%-oplossing van de PFA in H2O en het koelen van de eindoplossing van de PFA 4% bij 4 ° C.
  6. Isoleren van het hoofd van de muis en verwijder de hersenen van de schedel.
    1. Snij de huid van de nek en vervolgens gesneden naar de ogen te bloot van de schedel. De schedel van de nek tot de neus, en vervolgens van een oogbol naar de andere spleet. Schil de schedel uit en accijnzen van de hele hersenen.
  7. Incubeer de hersenen in 4% PFA gedurende 24 uur bij 4 ° C.
  8. Pipetteer de hersenen met pincet in een conische tube van 50 mL, gevuld met 25 mL van 30% sacharoseoplossing. Houd het bij 4 ° C gedurende 48-72 uur totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinkt.
  9. Snijd de hersenen met een volwassen muis hersenen slicer matrix coronale via de veroorzaakt (~ 3 mm posterior van bregma). Houd het gedeelte van de hersenen met de hersenstam.
    Opmerking: Dit zal resulteren in twee delen van de hersenen-één met allermeest cortex (voorste van de snede) en één met de hersenstam/cerebellum (posterior van de snede). De hersenstam sectie gebruiken voor de volgende stappen.
  10. De hersenstam sectie insluiten met het snijvlak geplaatst op de bodem van een insluiten schimmel, omringd door optimale scherpe temperatuur samengestelde (OCT); de ingesloten hersenen naar een vriezer-80 ° C en voor ten minste 12 h – bevriezen tot verder gebruik.
  11. Snijden op de cryostaat: plaats de inbedding schimmel die bevat van de hersenen in LGO in de cryostaat; Incubeer het in de cryostaat gedurende enkele uren aan te passen van de temperatuur van het blok van de hersenen met die van de cryostaat.
  12. Schil weg de insluiten mal om het blok van de OCT bevat de hersenen bloot te stellen.
  13. Gebruik scheermesjes overmaat van LGO uit het oppervlak van het blok verwijderen zonder het aanraken van de hersenen.
  14. Monteer de OCT-blok op de chuck van de cryostaat, bloot het snijvlak van de hersenen naar de voorkant.
  15. Het snijvlak van de hersenen zodanig aanpassen dat het parallel aan de Scheermesjes van de cryostaat is gericht.
  16. Trim de hersenen beginnen bij de medulla, rostrally 100 µm secties snijden.
  17. Trim rostrally totdat de kleine hersenen en hersenstam als één continu segment knippen. Beginnen met het verzamelen van segmenten bij 50 µm dikte.
    Opmerking: Als een trims rostrally uit de medulla, de hersenstam en kleine hersenen zal snijden als twee aparte secties. In rostraal secties, worden de hersenstam en kleine hersenen uiteindelijk samengevoegd op het niveau van de 4th ventrikel. Zodra de laterale rand van de 4th ventrikel goed gevormde, zijn dan de kleine hersenen en hersenstam als een continu segment komen zal.
    1. Verzamelen van OCT-omringd hersenen segment met een tang en plaats deze in een put van een 24-well plaat gevuld met PBS (Figuur 2a). De LC zal zijn meest prominente wanneer het cerebellum en de colliculus inferior elkaar bij ~-5.52 mm posterieure van bregma (Figuur 1b ontmoeten).
      Opmerking: Het meest voorste deel van de LC zal verdwijnen zodra het cerebellum heeft volledig zijn gesegmenteerd en niet langer de inferieure colliculus bij ~-5.34 mm posterieure van bregma (Figuur 1 c omringt).

2. Immunohistochemistry voor Dopamine β-Hydroxylase of Tyrosine Hydroxylase (figuur 2)

  1. Dag 1
    1. De geselecteerde segmenten drie keer, gedurende 5 minuten wassen in PBS.
    2. Permeabilize gedurende 24 uur in een 0,5% fosfaat gebufferde zoutoplossing met wasmiddel (Socialdemokrati) bij 4 ° C.
      1. Verdun 125 µL van wasmiddel in 25 mL PBS.
  2. Dag 2
    1. Segmenten drie keer, gedurende 5 minuten wassen in 0,5% Socialdemokrati.
    2. Het primaire antilichaam, anti-DBH of anti-TH voor 18u toevoegen bij een verdunning 1:500 in 0,5% Socialdemokrati bij 4 ° C.
  3. Dag 3
    1. Wassen segmenten driemaal voor 10 min 0,5% Socialdemokrati.
    2. Voeg de gewenste secundair antilichaam (488 ezel anti-konijn voor groene fluorescentie) bij een verdunning 1:1000 in 0,5% Socialdemokrati voor 16 h.
    3. Wikkel de 24 goed plaat in aluminium en plaats bij 4 ° C.
    4. Segmenten drie keer, gedurende 5 minuten wassen in 0,5% Socialdemokrati.
    5. Wassen gedurende 5 min. in PBS.
    6. Pipetteer segmenten met een potlood borstel in een watercontainer.
    7. Mount segmenten drijvend in het water op geladen dia's.
    8. Dekglaasje aan secties met hard-set montage media (zonder DAPI).
    9. De secties van de gemonteerde hersenen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur drogen.
    10. Afbeeldingssegmenten hersenen op een confocal of fluorescente microscoop met instellingen te detecteren signaal van passende secundair antilichaam fluorophore golflengte.
    11. Aanpassen van de Microscoop het brandvlak van het segment van de hersenen en het nemen van één afbeelding op 10 X vergroting.
    12. Gebruik om te vinden een mogelijke LC-regio in het segment van de hersenen, de 4th ventrikel voor oriëntatie; het cerebellum is gelegen boven het ventrikel, pons en hersenstam zijn te vinden onder de30.
    13. Voor het opzoeken van de LC, concentreren op de laterale rand van de 4th ventrikel; de LC is afkomstig van de randen van de 4th ventrikel en wijst naar de pons / regio van de hersenstam (Figuur 2b, 2 c).
    14. Volgende beeldvorming en lokalisatie van de LC in bepaalde segmenten van de hersenen, opslaan van dia's met segmenten van de hersenen bij 4 ° C.

3. opsporing van de LC in hersenen plakjes

  1. Ga naar de sectie van de hersenen met de LC, snijd de muis hersenen zoals hierboven beschreven en verzamelen van secties in PBS gevuld 24 goed gerechten, zoals weergegeven in Figuur 2a.
    1. Een deel van de hersenen plaats per putje te voorzien van de juiste lokalisatie van de LC.
  2. Een totaal van 48 segmenten van de hersenen die immunostained per hersenen zullen verzamelen.
    Opmerking: Alle putjes van de twee gerechten weergegeven in Figuur 2a bevatten hersenen segmenten van het ene dier.
  3. Immunokleuring elke derde tot en met vijfde segment voor DBH of TH. Bij voorkeur, het uitvoeren van immunohistochemistry van de hersenen segmenten die grenzen aan die zijn vehiculumcontrolegroep verdere (via Röntgen fluorescentie microscopie, XFM).
    Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk voor exacte lokalisatie van de LC in de definitieve bepaling plakjes (Figuur 2a; label met getallen tussen de putten).
  4. Pas het aantal segmenten van de hersenen die immunostained afhankelijk van de toepassing, bijvoorbeeldof zij de exacte locatie van het centrum en de rand van de LC, of enkel een ruwe benadering vereist.
  5. Naar aanleiding van immunohistochemistry, detecteren hersenen segmenten met LC via een karakteristiek patroon van meningsuiting aan beide zijden van de 4th ventrikel (Figuur 2b, 2 c). Vergroting van het signaal van de DBH in de LC van opeenvolgende hersenen segmenten wordt weergegeven in figuur 2d, 2e; het vergrote beeld van de LC dat is gekleurd voor TH wordt weergegeven in figuur 2f.
  6. De secties gebruiken grenzend aan die met LC voor verdere studies - in dit geval voor XFM te kwantificeren metalen niveaus (Figuur 3).
  7. Voor het uitvoeren van XFM, verzamelen van 10-30 µm (afhankelijk van de instelling) dunne coronale hersenen plakjes op dunne polymeer film waarmee ze kunnen worden gemonteerd op monster houders en beeld op het synchrotron.
  8. Opslaan van hersenen segmenten die zijn voorbereid op dunne polymeer film XFM bij kamertemperatuur en XFM uit te voeren.

4. metalen Imaging in de LC via XFM

  1. In het volgende voorbeeld muis hersenen slice zoals hierboven beschreven, bepalen LC, en metalen meten via XFM van deze segmenten van de hersenen met de LC.
  2. Afbeelding elemental distributies op beamline 2-ID-E bij de geavanceerde Photon bron (Argonne National Laboratory, Argonne IL).
  3. Registreren van gegevens 'on the fly' zoals eerder beschreven31.
  4. Elemental concentraties in plakjes van de hersenen met de LC met behulp van het programma kaarten32,33te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Veranderingen in de homeostase van de metalen (bijvoorbeeld Cu, Fe, Zn en Mn) worden vaak waargenomen in neurologische aandoeningen, met inbegrip van wijzigingen in de LC34,35. Metalen besturingsniveaus in de hersenen is dus nodig voor begrip van de mechanismen van de ziekte. De secties van de hersenen die zijn gegenereerd met het beschreven protocol kunnen worden gebruikt om te kwantificeren van de niveaus van Cu en andere metalen in de LC en vergelijk deze met de niveaus in gebieden buiten de LC. (Figuur 3). In ons voorbeeld, het segment van de hersenen dat werd gesneden door de LC, fosfaat, kalium, werd chloride en koper gemeten. Enige koper werd specifiek verheven in de LC. Hogere resolutie XFM beeldvorming (niet getoond hier) kan ook worden uitgevoerd voor de detectie van subcellular verdeling van metalen niveaus. Andere mogelijke toepassingen van dit protocol zijn de detectie van overvloed en intracellulaire distributie van DBH (Figuur 2b2d, 2e), TH (Figuur 2 c, 2f) en andere eiwitten uitgedrukt in de LC individueel of in de Co kleuring testen, studies van LC morfologie en neuronale dichtheid.

Figure 1
Figuur 1: lokalisatie van LC in het muis hersenstam. (een) schema aan te tonen de regio van de hersenstam dat zal worden gesegmenteerd om te lokaliseren van de LC. (b) op basis van de Paxinos en Franklin hersenen atlas30, LC zal zijn meest prominente wanneer het cerebellum en inferieur colliculus elkaar (-5.52 mm posterior van bregma). De linker afbeelding toont een coronale sectie doorsnijden de LC, terwijl de rechterafbeelding lokalisatie van LC op de laterale rand van de 4th ventrikel via Nissl kleuring toont. (c) de meest anterieure deel van LC zal verdwijnen zodra het cerebellum heeft volledig zijn gesegmenteerd en niet langer de inferieure colliculus (-5.34 mm posterior van bregma omringt). Nissl kleuring op de rechterafbeelding toont dat LC slechts marginaal aanwezig in deze coronale segment is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: detectie van LC door immunokleuring hersenen segmenten voor DBH of TH. de hersenen van (een) één muis was gesegmenteerd in 50 μm plakjes rond de hersenstam en verzameld in twee 24 goed gerechten. Elke 5th aan 8th verzamelde hersenen segment was gemonteerd op film bedekt dekglaasje aan voor imaging via XFM. Deze segmenten worden aangeduid met blauwe cijfers tussen de putten. Aangrenzende segmenten drijvend in PBS immunostained voor DBH moesten detecteren LC (aangeduid met rood kruis op wells). Groene cirkels duiden segmenten positief voor DBH signaal en dus bevatten LC. (b) een coronale hersenen segment met LC was immunostained met DBH en beeld op een confocal microscoop. De afbeelding toont een sterk signaal in de LC (in groen). (c) A coronale segment met LC was immunostained voor tyrosine hydroxylase (TH) en beeld op een fluorescente microscoop. Afbeelding toont sterk signaal voor zowel links als rechts LC. (d) segmenten waren immunostained voor DBH en segmenten 7 (aan de linkerkant) en 9 (aan de rechterkant) bevatte LC. Aangrenzende secties werden geselecteerd voor XFM analyse. (e) segment 10 bleek ook LC. In deze sectie, was de linker LC doorsnijden het middelpunt terwijl rechts LC werd gevangen bij de rand van het anterior-meeste. (f) A sectie waarin LC was immunostained voor TH en beeld op een confocal microscoop. Afbeelding toont TH uiting van neuronen in de LC gemarkeerd in het groen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: beeldvorming van metaal niveaus in de LC. De hersenen van een mannelijke 12-week-oude muis met een knockout van Cu-transporter ATP7B werd geïsoleerd en voorbereid zoals beschreven in dit protocol. Niet-gekleurde segmenten grenzend aan LC-bevattende secties zijn genomen en metalen niveaus werden gemeten via XFM. Cu niveaus werden specifiek in de LC (gemarkeerd met gele pijlen) verhoogd ten opzichte van de omliggende regio van de hersenen, terwijl andere elementen (K, P en Cl) waren onveranderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Goed kunt u het model is een cruciale stap in dit protocol. Omdat we zijn met behulp van anatomische eigenschappen van de dorsale oppervlak van de hersenen te vinden LC (grens tussen het cerebellum en de colliculus inferior), is het belangrijk dat de gedeelten correct zijn uitgelijnd. Dit vereist zorg bij het correct vaststellen van de hersenen naar de muis hersenen slicer matrix. Het is raadzaam snijden ~ 500 μm meer weefsel anterior en posterior naar LC om te voorkomen dat de celkern ontbreekt. De meest voorkomende fout is te snijden te weinig secties die resulteert in de LC geheel ontbreekt. Dus, voor iemands eerst na dit protocol, raden we snijden meer secties dan nodig. Zorgvuldige studie van de hersenen atlas beelden voorafgaand aan kleuring is zeer nuttig. Het uiterlijk van de hersenstam verandert aanzienlijk elke paar honderd microns en met enige ervaring, is het mogelijk om te weten wat de secties waard kleuring gewoon door de macroscopische verschijning zijn.

Tijdens het proces van het lokaliseren van de LC, kunnen er variaties in het signaal afhankelijk van hoe goed de hersenen tijdens afdelen georiënteerd was. Tijdens het snijden door het midden van de LC, het signaal is helder en heeft een grotere oppervlakte in vergelijking tot de rand van de LC, die als een signaal over een veel kleiner gebied verschijnen zal. In het geval dat coronale segmenten iets zijn gekanteld, de LC van de ene kant van de 4th ventrikel misschien wel herkenbaar en degene aan de andere kant misschien alleen zichbaar in een aangrenzende dia. Dus, een niet altijd verwachten dat het uiterlijk van beide LC regio's bij maximale intensiteit binnen één hersenen segment. Dit artefact kan worden vermeden door de hersenen precies coronale snijden in de muis hersenen slicer matrix en zorgvuldig door de hersenen in de kubusvormige insluiten mal te embedding met LGO.

Immunokleuring, ten minste met het anti-tyrosine hydroxylase antilichaam, is zeer vergevingsgezind en in onze ervaring, werken op afdelingen maximaal 100 μm in dikte. We hebben gevonden dat het blokkeren van de oplossing niet nodig is voor hoge signaal-ruis-kleuring van LC, vermindering van de kosten en het verminderen van de hoeveelheid tijd die nodig is om te zoeken van LC. In onze ervaring, kan het kleuring protocol worden versneld – zij het met minder kwaliteit en doordringendheid van kleuring – door het verminderen van permeabilization 2 h, primair antilichaam voor 8u en secundair antilichaam voor 2 h. Bovendien als een gewoon geïnteresseerd is in het lokaliseren van LC ( bijvoorbeeld, voor de validatie van de injectie van een virus/tracer), secties van een vaste hersenen kunnen worden gesneden op een vibratome bij 100 μm dikte.

Een beperking van dit protocol is, door ontwerp, euthanizing het dier en het verwijderen van de hersenen vereist. Daarom is het niet nuttig voor in vivo lokalisatie (b.v., electrophysiologic recordings). Een andere beperking is dat dit protocol vereist PFA fixatie, waardoor de oorspronkelijke staat van het weefsel kan worden gewijzigd. Deze wijzigingen omvatten de elementaire inhoud zoals koper, calcium, ijzer en zink36. De werkelijke verandering van metalen verdeling veroorzaakt door PFA fixatie kan worden getest in één monster die parallel aan een niet-vaste monster kan worden uitgevoerd. Een vergelijking van de metalen verdeling tussen deze twee monsters geeft bewijs over het effect van PFA fixatie op de verdeling van het metaal dat van belang in een bepaalde studie is. Als PFA fixatie moet worden vermeden, kan het algemene beginsel van dit protocol (LC door immunokleuring lokaliseren en met behulp van aangrenzende secties voor follow-up experimenten) worden uitgebreid tot bevroren secties zonder fixatie.

Wij stellen vast dat dit protocol grotendeels een verfijning van bestaande methoden is voor oplossen zulks werkstuk. De nieuwigheid bestaat in het afstemmen van vorige benaderingen om te zoeken van een zeer kleine, gemakkelijk gemiste kern. Wij verwachten dat dit protocol gemakkelijk kan worden gewijzigd en uitgebreid (bijvoorbeeldmet behulp van transgene dieren uiting van fluorophores in LC te vermijden van immunokleuring) op basis van behoefte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

Wij danken Abigael Muchenditsi voor het onderhoud van de kolonie van de muis. Gebruik van de geavanceerde Photon bron bij het Argonne National Laboratory werd gesteund door de Amerikaanse Department of Energy, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, onder contractnummer: DE-AC02-06CH11357. Wij danken Olga Antipova en Dr. Stefan Vogt voor gebruikersondersteuning en assistentie bij de geavanceerde Photon bron. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Health subsidie 2R01GM101502 aan SL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
  2. Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
  3. Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
  4. Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
  5. Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
  6. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
  7. Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
  8. Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
  9. Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
  10. File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
  11. Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
  12. Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
  13. Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
  14. Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
  15. Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
  16. Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
  17. Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
  18. Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
  19. Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
  20. Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. Neuroscience. 373, 7-19 (2018).
  21. Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
  22. McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
  23. Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
  24. Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
  25. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
  26. Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
  27. Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
  28. Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
  29. Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
  30. Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).
  31. Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
  32. Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
  33. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
  34. Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
  35. Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).
  36. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 145 Hersenen locus coeruleus metalen immunohistochemistry Röntgen fluorescentie microscopie noradrenaline koper DBH TH ATP7A ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

Lokalisatie van de Locus Coeruleus in de hersenen van de muis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter