Summary
Vi beskriver etableringen av en murine modell for Parkinsons sykdom MPTP og atferdsmessige vurderinger bruker sylinder og åpne feltet testene for å måle motorikk. Deretter bruker vi L-DOPA eksempel som viser hvordan du bruker denne modellen i studiet av PD narkotika.
Abstract
Parkinson's sykdom er en vanlig nevrodegenerativ lidelse sykdom, forårsaker fenomenet risting, stivhet, treghet og demens. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kan føre til noen Parkinson-lignende symptomer ved å ødelegge dopaminergic nerveceller i substantia nigra av hjernen. Det er dermed brukt til å etablere PD modeller i ulike dyrestudier. Her, mus motta MPTP injeksjoner (20 mg/kg/dag) i syv dager og atferdsmessige testene utføres på den åttende dag. Denne modellen er tilpasset effektivt i studiet av PD. Atferdsmessige testene her inkluderer sylinder testen og åpne feltet testen. Sylinder eksperimentet brukes til å oppdage dyrenes evne til å løfte sin front paws når satt i et annet miljø. Som PD modell mus vise overordnede-musen buer ryggen-antall pote løfting nedgang. Denne testen er enkelt å utføre. Åpne feltet testen brukes til å oppdage hvor tid musene bruker på kjøre, gå og gjenværende immobile. Vi analysere dyrene bevegelser i åpne-feltet bruker programvare og hente data. Til slutt, vi bruker L-DOPA, en av mest vanlige PD narkotika, som et eksempel som viser hvordan du bruker denne modellen til studiet av PD narkotika. Våre resultater viser at MPTP nevrotoksisitet induserer motor underskudd som gjøres ved L-DOPA.
Introduction
Parkinson's sykdom (PD), en av de vanligste sykdommene blant eldre personer, er en langsiktig nevrodegenerativ lidelse1. Pasienter vise alltid fenomenet risting, stivhet, treghet og demens som forverres over tid2. Andre symptomer inkludert sensoriske, er sove, og emosjonelle problemer også ofte observert2. Årsaken til PD er fortsatt uklart, men det er generelt antatt å involvere både genetiske og miljømessige faktorer, som har medført tap av dopaminergic nerveceller i substantia nigra3, og utvikling av Lewy organer og Lewy neurites i ulike regioner i den hjernen4.
Blant studier av PD, er 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 tilpasset mye gjengi noen PD symptomer i eksperimentelle modeller. I 1984 funnet Langston et al. først at injeksjoner av MPTP i ekorn aper resulterte i Parkinsonism6. Selv om MPTP gnager modellen ikke viser tilstedeværelse av Lewy etater, som er biomarkør av PD, forårsaker MPTP Parkinson-lignende symptomer ved å ødelegge dopaminergic nerveceller i substantia nigra av hjernen7. MPTP modellen tar mindre tid sammenlignet med andre narkotika modell for PD som de av 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 og 1-metyl-4-phenylpyridinium (MPP +)9, injeksjon av MPTP er enkelt å utføre. Mus motta MPTP injeksjoner (20-30 mg/kg/dag) for syv dager, og atferdsmessige testene utføres på åttende dag10.
Åpne feltet test11 ble først utviklet av Calvin S. Hall, en amerikansk12. I ulike studier, er ulike typer atferd testet. I forskning som fokuserer på Parkinsons sykdommer, atferd som bevegelse aktiviteter og hastigheten på bevegelse er testet for å se hvis dyrets muligheten til å flytte rundt påvirkes. Sammenlignet med andre metoder brukes til å teste etablering av PD dyr, åpne feltet testen er lett å gjennomføre fordi utstyret som trengs er enkel, og prototyper og data analyseprogramvare (f.eks MATLAB Excel) kan brukes enkelt samle og grafen den data. Variasjonskoeffisienten er også relativt liten13, som betyr at resultatet av åpen test er pålitelig. En annen fordel over andre metoder er at virkemåtene inkludert i dette eksperimentet er enkelt å skille; musene kan være kjører, gåing eller står stille. Vanligvis kan åpne feltet testen brukes på gnagere når forskeren må vurdere emnet mobilitet.
Sylinder testen kalles også asymmetrisk bruk av forelimbs test. Når denne testen ble først utviklet, ble det brukt til å teste asymmetrisk bruk rottas forelimbs14. Her bruker vi denne testen for å analysere dyrets evnen til å strekke ut og bruke begge sine forelimbs for å utforske nye omgivelser. Den substantia nigra og corpus striatum skades av MPTP i hjernen, dyret gjerne arch ryggen og blir mindre sannsynlig å strekke ut og utforske ukjent miljøet. Denne testen er lett å kjøre, og kan gi et foreløpig resultat. Men har denne testen høy interne variasjon, så det er vanligvis brukt med sammen med andre atferd eksperimenter.
L-DOPA, som er også levodopa eller L-3,4-dihydroxyphenylalanine, er en vanlig måte å behandle Parkinsons sykdom siden en årsak til PD er reduksjon av dopamin i den. L-DOPA er forløperen til dopamin. Men i motsetning til dopamin, det kan ta blod - hjerne barrieren, som betyr at det vil være mer effektiv i å øke konsentrasjonen av dopamin i hjernen området. Etter den krysser blod - hjerne barrieren, omdannes L-DOPA til dopamin av L-amino acid dekarboksylasehemmer15.
Her beskriver vi måling og analyse av funksjon i MPTP-indusert-PD modell mus med en sylinder test14 og en modifisert åpne feltet testen. Vi administrerer L-DOPA eksempel som viser hvordan du bruker denne modellen i studiet av PD narkotika. Våre resultater viser at MPTP induserer motor underskudd som gjøres ved L-DOPA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til internasjonale, nasjonale og institu reglene vurderer dyreforsøk. Studien protokollen ble godkjent av dyreetikk Nankai University.
1. MPTP og L-DOPA administrasjon
Merk: Ti-uke-gamle kvinnelige BALB/c mus ble levert av Institutt for zoologi, kinesiske vitenskapsakademi. Mus var ligger seks per bur under en 12t lys/mørke syklus (lys på på 08:00-20:00), en konstant temperatur på 21-22 ° C og en relativ luftfuktighet på 55% ± 5%. Autoklaveres standardmus chow av den samme formulering og vann annonse libitum ble gitt til alle dyr.
- Etter en uke med Akklimatisering, dele dyrene i tre grupper av seks mus.
- Gruppe 1, administrere intraperitoneal injeksjoner (se trinn 1.5) 250 µL/mus/Day saltoppløsning fra dag 1 dag 7 og deretter utføre intragastric administrasjon (se trinn 1.6) 250 µL/mus saltoppløsning på dag 8.
- Gruppe 2, administrere intraperitoneal injeksjoner av 20 mg/kg/dag MPTP hver dag fra dag 1 dag 7 og deretter utføre intragastric administrasjon av 250 µL/mus saltoppløsning på dag 8.
- Gruppe 3, administrere intraperitoneal injeksjoner av 20 mg/kg/dag av MPTP fra dag 1 dag 7 og deretter utføre intragastric administrasjon av 5 mg/kg av L-DOPA på dag 8.
- Utføre intraperitoneal injeksjon som følger.
- Legg stoffet i et sterilt 1 mL sprøyte med en 26 G nål. Fjerne luft fra sprøyten.
- Scruff musen med dens vommen grossist. Holde hodet, nakken og kroppen av mus i en rett linje også med hodet fast.
- Vinkel p å trenge peritoneum. Stikk nålen for riktig avstand til det er lite motstand, og deretter injisere stoffet. Dra ut pinnen jevnt.
- Utføre intragastric administrasjonen som følger.
- Forberede medisiner i et sterilt 1 mL sprøyte med en oral-gavage nål. Fjerne luft fra sprøyten.
- Hold musen med magen grossist. Holde hodet, nakken og kroppen av mus i en rett linje med hodet fast.
- Holde nålen parallelt med kroppen av musen, og sett den fra hjørnet av musen er munn, trykke tungen og skyve innover mot overkjeven.
- Med lite motstand, som viser nålen inn spiserøret jevnt, trykk forsiktig nålen i riktig avstand. Før spissen av nålen når den nederste delen av brystet, injisere medisinering.
- Dra ut pinnen jevnt.
2. sylinder test
Merk: Atferdsmessige testene ble utført på dag 8. L-DOPA ble injisert i den tredje gruppen av mus 40 min før atferdsmessige testene. Hvis behavioral testing ikke er gjort i samme rom der dyrene er plassert, må dyr være acclimated til det nye rommet i 30-60 minutter før testen.
- Utfør testen 24 timer etter den siste dosen av MPTP.
- Plasser en gjennomsiktig glass sylinder (høyde = 19,5 cm, diameter = 15 cm, vekt ≥1 kg) i midten av en tabell. Omgi sylinderen på tre sider med svart papp å redusere effekten av miljømessige belysning. La ene sylinderen utsikt kamera for videoopptak.
Merk: Avstanden mellom papp og sylinder bør være ca 4 til 8 cm. - Feste et kamera (> 1 millioner piksler oppløsning) på ~ 40-60 cm fra sylinderen slik at full sylinderen er synlig.
Merk: Dette er verken for nær eller langt for å ikke forstyrre musen mens du tar opp video av sin bevegelse. - Plasser ett museklikk inn i sylinderen om gangen og starte innspillingen samtidig. Stoppe innspillingen etter 3 minutter.
Merk: Under denne prosessen prøver å unngå støy eller lyset endres for unngå påvirke musen er atferd. - Plass musen tilbake til hjem buret etter testing.
- Rengjør sylinderen med vann og deretter sprayer 70% v/v etanol over indre veggen for å rense det og fjerne musen dufter. Tørk sylinderen tørr før en annen mus er plassert i.
- Spille av videoen med en hastighet på 0,5 x vanlig hastigheten og antall pote heiser mot veggen av hver musen.
Merk: Pote heiser oppstår når musen steiler opp på sin hindlimbs, reiser både forelimbs over skulderen nivå og land. En forlemen heisen telles ikke. Vanligvis hever en mus sin forelimbs å røre sylinder veggene. Hvis musen hever sin forelimbs over skulderen nivå flere ganger kontinuerlig uten landing, bør det bli regnet som en gang.
3. Åpne felttest
- Utfør den åpen 24 timer etter MPTP dosering.
Merk: Det kan utføres samtidig av sylinder testen. - Forberede en gjennomsiktig åpne feltet reaksjon boks (45 cm L x 45 cm b x 25 cm H) med en tre plate cover på bunnen av en svart klut. Fikse et kamera (> 1 millioner piksler oppløsning) over feltet i en høyde av 1 m.
Merk: Fargen på åpen boksen nederst skal være forskjellig fra testet musen fargen å sikre fargekontrasten i videoen. - Juster kameraet til å sikre at boksen Åpne reaksjon er midtstilt på videoen.
- Sett en test musen i boksen, og la musen gjøre seg kjent med miljøet for ca 1 min.
- Registrere en 5 minutter video med kameraet koblet til datamaskinen.
- Analysere video bruker programvareverktøy (f.eks MATLAB) for å få bevegelse spor figuren, distribusjon av statisk (hastighet < 1 cm/s), gangavstand (hastighet 1-20 cm/s) og kjører (hastighet > 20 cm/s) tid, totalen reiste avstand og gjennomsnitt hastigheten på hver testet musen.
Merk: Når du analyserer video, vi spore hele kroppen av musen. Den gjennomsnittlige hastigheten på en kropp betyr Totallengden på banen dekket, delt på tiden. Hvis musen ikke beveger seg, ville derfor øyeblikkelig hastigheten anses som null. - Rydde opp alle feces i boksen Åpne reaksjon. Spray 70% etanol på boksen og tørk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sylinder testen, ble reduksjon av steiler mot veggen observert i mus (gruppe 2) behandlet med MPTP fra dag 1 dag 7 og saltvann på dag 8 sammenlignet med saltvann-behandlet mus (gruppe 1), mens en økning på steiler ble observert i mus (gruppe 3) behandlet med MP TP fra dag 1 dag 7 og L-DOPA på dag 8 mot mus (gruppe 2) behandlet med MPTP fra dag 1 dag 7 og saltvann på dag 8 (figur 1).
Figur 2 viser representant spor og distribusjon av statisk tid, gangtid og kjøretid på tre typer mus. (A) ble mus behandlet med saltvann. I (B) mus behandlet med MPTP fra dag 1 dag 7 og saltvann på dag 8. I (C) mus behandlet med MPTP fra dag 1 dag 7 og L-DOPA på dag 8. Når en mus ble flyttet i åpne-feltet arena med hastighet < 1 cm/s, 1-20 cm/s, eller > 20 cm/s, det ble dømt som statisk, walking eller løping henholdsvis. Mus behandlet med bare MPTP viste en lavere bevegelseshastighet, kortere bevegelse avstand, lengre statiske tid og en kortere kjøretid enn saltholdig-behandlet mus, som indikerte motor underskuddet av MPTP. Mus behandlet med både MPTP og L-DOPA viste en høyere bevegelseshastighet, større bevegelse avstand, kortere statisk tid og en lenger tid enn mus behandlet med bare MPTP (figur 2, Figur 3), som viste at L-DOPA oppveies av MPTP-indusert motor underskudd.
Figur 1: effekter av MPTP på motor, er ytelsen i sylinder test Dette viser analyse av antall oppdrett 8 dag. * representerer p < 0,05, ** representerer p < 0,01 for en enveis ANOVA test. Alle verdiene representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bevegelse banen til mus og distribusjon som mus bo, gå og kjøre under 5 min i åpne-felttest. (A) ubehandlet mus. (B) mus behandlet med MPTP. (C) PD modell mus reddet av L-DOPA. Bruk: musen var i bevegelse med en hastighet av mer enn 20 cm/s. gange: musen var i åpne-feltet og med en hastighet på 1-20 cm/s. statisk: musen var stasjonære (hastighet < 1 cm/s) i åpne-feltet (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: motor underskuddet indusert av MPTP og terapeutiske effekten av L-DOPA på motor, er ytelsen i åpne-felttest. (A) analyse av statisk, gå og kjøretiden. (B) analyse av gjennomsnittlig musebevegelsen avstand. (C) analyse av gjennomsnittlig bevegelseshastighet. representerer p < 0,001, *** representerer p < 0,0001 for en enveis ANOVA test. Alle verdiene representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av ødeleggelse av dopaminergic nerveceller i substantia nigra av hjernen forårsaker MPTP Parkinson-lignende symptomer i mus7. L-DOPA er den mest foretrukne medikament for PD helt siden klinisk bruk, fordi det hjelper opprettholde normale daglige aktiviteter hos pasienter med PD, med effektiv undertrykkelse av motor unormalt inkludert akinesia og stivhet15. Mus behandlet med MPTP viste impairments i atferdsdata testene som sylinder test og åpne felttest, som kan brukes til å studere MPTP modellen. Sylinder test og åpne felttest brukes vanligvis til å måle spontan handling. Her endret vi disse to atferdsmessige tester for å bruke dem i studiet av PD. Som vist i resultatene, kan L-DOPA begrense nedskrivningen oppførsel ved å forbedre dyrenes motoriske ferdigheter.
Normalt utforske mus deres omgivelser når de holdt introdusert til et nytt miljø. Dermed når oppbevares i en gjennomsiktig sylinder, utforske de i sylinderen ved å flytte og oppdra sine organer for å berøre sylinder veggene med sine forelimbs. Mus beruset med nevrotoksiske stoffer som MPTP, redusere denne handlingen. Dette tillater oss å bruke sylinder testen i PD studien. Pote heiser angi forlemen bruk for body støtte og dermed brukes for å evaluere effekten av nye kjemiske enheter på motor, er ytelsen16. Sylinder testen gir også et mål for de forlemen motorikk17 i mange nevrodegenerative sykdommer som involverer motorisk cortex lesjoner, som amyotrofisk lateral sklerose og spinocerebellar atrofi18.
Åpne feltet testen er en eksperimentell test konvensjonelt brukes til analysen generelt locomotor aktivitetsnivå og vilje av gnagere i form av tiden de bo på midten av boksen. Måling av bevegelsen banen, fart og tid musene bo, gå og kjøre henholdsvis i hele feltet i stedet for å bestemt område åpen kan vurdere funksjon i PD19. Utnytte enkel og lett tilgjengelig koding programvare (se Tabell for materiale), vi kan hente og analysere data relatert til funksjonen locomotor effektivt.
Sylinder testen og åpne feltet testen ble valgt for å måle spontan lokomotiv funksjon i PD modell mus for følgende årsaker. Mus trenger ikke å bli trent før atferdsmessige testene. Bare noen minutter kreves for svaret, som sikrer effektiv. Kostnaden for utstyret som trengs for å utføre testene er lav. En stor ulempe av dette tiltaket er imidlertid at dyrenes aktivitetsnivåer kan variere betydelig miljøendringer og individuelle forskjeller. For å redusere mengden av variasjon i utfallet data, bør forsiktighet tas. Først bør dyr av samme alder, kjønn og genetisk bakgrunn20,21,22 vurderes samtidig. For det andre må utstyret, sylinder og åpne-feltet renses før og etter testing hver musen. Endelig holde miljøet rolig og uforstyrret under testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vårt arbeid er finansiert av Tianjin Undergraduate treningsprogrammer for innovasjon og entreprenørskap (Grant nr. 63183004). Dette prosjektet ble igangsatt i staten nøkkel laboratorium av medisinske kjemiske biologi ved Nankai University. Forfatterne erklærer at det ikke er noen konflikter av interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
References
- Dehay, B., Bourdenx, M., Gorry, P., Przedborski, S., Vila, M., Hunot, S., Singleton, A., Olanow, C. W., Merchant, K. M., Bezard, E. Targeting -synuclein for treatment of Parkinson's disease: mechanistic and therapeutic considerations. Lancet Neurology. 14, 855-866 (2015).
- Weintraub, D., Comella, C., Horn, L., S, Parkinson's disease - Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. American Journal of Managed Care. 14, 40-48 (2008).
- Ismaiel, A. A., et al. Metformin, besides exhibiting strong in vivo anti-inflammatory properties, increases mptp-induced damage to the nigrostriatal dopaminergic system. Toxicology and Applied Pharmacology. , 19-30 (2016).
- Bayliss, J. A., et al. Ghrelin-AMPK signaling mediates the neuroprotective effects of calorie restriction in Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 36, 3049-3063 (2016).
- Olanow, C. W., Stern, M. B., Sethi, K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease. Neurology. 72 (21 Supplement 4), (2009).
- Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochemical & Biophysical Research Communications. 120 (2), 574-578 (1984).
- Bakay, R. A., et al. Biochemical and behavioral correction of MPTP parkinson-like syndrome by fetal cell transplantation. Annals of the New York Academy of Sciences. 495 (1), 623-638 (2010).
- Kelly, P. H., Seviour, P. W., Iversen, S. D. Amphetamine and apomorphine responses in the rat following 6-OHDA lesions of the nucleus accumbenssepti and corpus striatum. Brain Research. 94 (3), 507-522 (1975).
- Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
- Katila, N., et al. Metformin lowers α-synuclein phosphorylation and upregulates neurotrophic factor in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 125, (2017).
- Goldberg, N. R. S., Haack, A. K., Lim, N. S., Janson, O. K., Meshul, C. K. Dopaminergic and behavioral correlates of progressive lesioning of the nigrostriatal pathway with MPTP. Neuroscience. 180, 256-271 (2011).
- Schwarting, R. K., Sedelis, M., Hofele, K., Auburger, G. W., Huston, J. P. Strain-dependent recovery of open-field behavior and striatal dopamine deficiency in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 1 (1), 41 (1999).
- Shiguang, S., et al. The open field test as a method for ethology in Kunming mice: test-retest reliability. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science. 19 (12), 1093-1095 (2010).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test. Journal of Visualized Experiments. (98), e52701 (2015).
- Cotzias, G. C., Van Woert, M. H., Schiffer, L. M. Aromatic amino acids and modification of Parkinsonism. New England Journal of Medicine. 282, 31-33 (1967).
- Cassady, J. C., Johnson, R. E. Cognitive test anxiety and academic performance. Contemporary Educational Psychology. 27 (2), 270-295 (2002).
- Rogalewski, A., et al. Semaphorin 6A improves functional recovery in conjunction with motor training after cerebral ischemia. Plos One. 5 (5), 0010737 (2010).
- Chen, W., Qiao, D., Liu, X., Shi, K. Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-ohda-induced parkinson's disease. Neural Plasticity. 2017, 2583910 (2018).
- Colas-Zelin, D., et al. The imposition of, but not the propensity for, social subordination impairs exploratory behaviors and general cognitive abilities. Behavioural Brain Research. 232 (1), 294-305 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. American Journal of Psychology. 83, 103-111 (1970).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51785 (2014).
