Summary
Descrevemos o estabelecimento de um modelo murino para a doença de Parkinson usando MPTP e avaliações comportamentais usando o cilindro e testes de campo aberto para medir a função motora. Então usamos l-dopa como um exemplo para mostrar como aplicar este modelo no estudo de drogas de PD.
Abstract
A doença de Parkinson (PD) é uma doença comum da desordem neurodegenerativas, causando o fenômeno de agitação, rigidez, lentidão de movimentos e demência. 1-methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) pode levar a alguns sintomas de Parkinson, destruindo os neurônios dopaminérgicos na substância negra do cérebro. Tem sido assim era estabelecer modelos de PD em vários estudos com animais. Aqui, os ratos recebem injeções de MPTP (20 mg/kg/dia) por sete dias e os testes comportamentais são executadas no oitavo dia. Este modelo é adaptado com eficiência no estudo de PD. Os testes comportamentais aqui incluem o teste de cilindro e o teste de campo aberto. O experimento de cilindro é usado para detectar a capacidade dos animais para levantar suas patas da frente quando colocadas em um ambiente diferente. Como o PD ratos modelo mostram arqueando — o mouse arcos suas costas — o número de diminuição de carregamentos de pata. Este teste é fácil de executar. O teste de campo aberto é usado para detectar a quantidade de tempo que os ratos passam correndo, andando, e permanecendo imóvel. Podemos analisar os movimentos dos animais em campo aberto, utilizando o software e obter dados. Por último, nós usamos o l-dopa, um dos mais comumente usado drogas PD, como um exemplo para mostrar como aplicar este modelo para o estudo de drogas de PD. Nossos resultados indicam que a neurotoxicidade MPTP induz déficit motor, que pode ser atenuado por l-dopa.
Introduction
A doença de Parkinson (PD), uma das doenças mais comuns entre indivíduos mais velhos, é um longo prazo neurodegenerativas transtorno1. Pacientes sempre mostram o fenômeno de agitação, rigidez, lentidão de movimentos e demência que piorar com o tempo2. Outros sintomas, incluindo sensorial, sono e problemas emocionais são também comumente observados2. A causa da DP ainda é incerto, mas geralmente acredita-se que envolvem fatores genéticos e ambientais, que induzem a perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra3e o desenvolvimento de corpos de Lewy e neuritos de Lewy, em várias regiões do cérebro4.
Entre os estudos de PD, 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 é adaptado amplamente em recriar alguns sintomas de PD em modelos experimentais. Em 1984, Langston et al primeiro descobriu que injeções de aminoácidos Excitatórios em macacos-esquilo resultaram em parkinsonismo6. Embora o modelo de roedores MPTP não mostra a presença de corpos de Lewy, que é o biomarcador de PD, MPTP causa sintomas de Parkinson, destruindo os neurônios dopaminérgicos na substância negra do cérebro7. Em comparação com outro modelo de drogas para a polícia como aquelas induzidas por 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 e9de 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +), injeção de MPTP é fácil de executar e o modelo do MPTP leva menos tempo. Os ratos recebem injeções de MPTP (20-30 mg/kg/dia) por sete dias e os testes comportamentais são executadas no oitavo dia10.
O teste de campo aberto11 foi desenvolvida pelo Calvin S. Hall, um americano de12. Em vários estudos, diferentes tipos de comportamentos são testados. Na pesquisa que incide sobre as doenças de Parkinson, comportamentos como atividades de locomoção e a velocidade de locomoção são testados para ver se a capacidade do animal para se movimentar é afectada. Em comparação com outros métodos usados para testar a criação de animais de PD, teste de campo aberto é fácil de realizar, porque o equipamento necessário é simples, e software de análise prototipagem e dados (por exemplo, MATLAB, Excel) pode ser usado para coletar e gráfico facilmente a dados. Além disso, o coeficiente de variação é relativamente pequena13, que significa que o resultado do teste de campo aberto é confiável. Outra vantagem sobre outros métodos é que os comportamentos incluídos neste experimento são fáceis de distinguir; os ratos podem ser correndo, andando ou parado. Geralmente o teste de campo aberto pode ser usado em roedores quando o pesquisador precisa avaliar a mobilidade do sujeito.
O teste de cilindro é também chamado o teste de utilização assimétrica dos membros dianteiros. Quando este teste foi inicialmente concebido, foi usado para testar o uso assimétrico de membros dianteiros14 o rato. Aqui, podemos usar este teste para analisar a capacidade do animal para esticar e usar os dois de seus membros dianteiros para explorar novos ambientes. Quando a substância negra e corpo estriado são danificados por aminoácidos Excitatórios no cérebro, o animal tende a arquear suas costas e se torna menos provável a esticar-se e explorar o ambiente desconhecido. Este teste é fácil de executar e pode dar um resultado preliminar. No entanto, este teste tem alta variabilidade interna, então ele é geralmente usado com juntamente com outras experiências de comportamento.
Tomar l-dopa, que também é conhecido como levodopa ou L-3,4-dihidroxifenilalanina, é uma forma comum de tratar a doença de Parkinson, uma vez que uma das causas da DP é a diminuição da dopamina na. L-dopa é o precursor da dopamina. Mas ao contrário da dopamina, pode atravessar a barreira sangue - cérebro, que significa que será mais eficiente em aumentar a concentração de dopamina na área do cérebro. Depois de cruzar a barreira sangue - cérebro, l-dopa é convertida em dopamina pela L-amino-descarboxilase ácida15.
Aqui descrevemos a medição e análise da função motora em camundongos de modelo MPTP-induzida-PD usando um teste de cilindro14 e um teste de campo aberto modificados. Podemos administrar l-dopa como um exemplo para mostrar como aplicar este modelo no estudo de drogas de PD. Nossos resultados indicam que o MPTP induz déficit motor que pode ser atenuado por l-dopa.
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Protocol
Este estudo foi realizado de acordo com as regras internacionais, nacionais e institucionais, considerando as experiências com animais. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética animal da Universidade de Nankai.
1. aminoácidos Excitatórios e l-dopa administração
Nota: Camundongos BALB/c fêmeas de dez semanas de idade foram fornecidos pelo Instituto de Zoologia, da Academia Chinesa de Ciências. Os ratos foram alojados seis por gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h (luzes acesas às 08:00-20:00), uma temperatura constante de 21-22 ° C e uma humidade relativa de 55% ± 5%. Comida de ratos padrão autoclavado da mesma formulação e água ad libitum foi dado a todos os animais.
- Após uma semana de aclimatação, divida os animais em três grupos de seis ratos cada.
- Para o grupo 1, administrar injeções intraperitoneal (ver passo 1.5) de 250 µ l/rato/dia de soro do dia 1 ao dia 7 e em seguida, executar administração intragástrico (ver passo 1.6) de 250 rato / µ l de solução salina no dia 8.
- Para o grupo 2, administrar injeções intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de MPTP, todos os dias do dia 1 ao dia 7 e em seguida, executar intragástrico administração de 250 µ l/rato de solução salina no dia 8.
- Para o grupo 3, administrar injeções intraperitoneal de 20 mg/kg/dia de aminoácidos Excitatórios do dia 1 ao dia 7 e em seguida, executar intragástrico administração de 5 mg/kg de l-dopa no dia 8.
- Execute a injeção intraperitoneal como segue.
- Carrega a droga para uma seringa estéril 1 mL com agulha 26G. Elimine o ar da seringa.
- Nuca o mouse com a barriga virada para cima. Manter a cabeça, pescoço e corpo do mouse em uma linha reta, bem com a cabeça fixada.
- Ângulo da agulha penetrar no peritônio. Empurre a agulha para uma distância apropriada até que haja pouca resistência e em seguida, injetar a droga. Retire a agulha suavemente.
- Execute a administração intragástrico como segue.
- Prepare a medicação em uma seringa de 1ml estéril com uma agulha de gavagem-oral. Elimine o ar da seringa.
- Segure o mouse com a barriga virada para cima. Mantenha a cabeça, pescoço e corpo do mouse em uma linha reta com a cabeça fixada.
- Manter a agulha paralela ao corpo do mouse e inseri-lo no canto da boca do mouse, pressionando a língua e empurrando para dentro contra o maxilar superior.
- Com pouca resistência, que mostra a agulha está entrando suavemente o esôfago, empurre com cuidado a agulha em uma distância apropriada. Antes que a ponta da agulha atinge a parte inferior do peito, injecte o medicamento.
- Retire a agulha suavemente.
2. teste de cilindro
Nota: Os testes comportamentais foram realizados no dia 8. L-dopa foi injetada ao terceiro grupo de ratos 40 min antes dos testes comportamentais. Se os testes comportamentais não é feito na mesma sala onde os animais estão alojados, os animais precisam ser aclimatados à nova sala para 30-60 min antes do teste.
- Realize o teste de 24 horas após a última dose de aminoácidos Excitatórios.
- Coloque um cilindro de vidro transparente (altura = 19,5 cm, diâmetro = 15 cm, peso ≥ 1 kg) no centro de uma tabela. Cercam o cilindro em três lados com papelão preto para reduzir o efeito de iluminação ambiental. Deixe um lado do cilindro virado para a câmera para gravação de vídeo.
Nota: A distância entre o cartão e o cilindro deve estar cerca de 4 a 8 cm. - Colocar uma câmera (> 1 milhão-pixels de resolução) em ~ 40-60 cm de distância do cilindro para garantir que o cilindro completo é visível.
Nota: Esta é demasiado perto nem longe demais a fim de não perturbar o mouse enquanto gravava o vídeo de seu movimento. - Colocar um rato dentro do cilindro de cada vez e começar a filmar imediatamente. Pare de filmar após 3 min.
Nota: Durante este processo, tentar evitar o ruído ou mudanças de luz, a fim evitar influenciar o comportamento do rato. - Coloque o mouse volta para a jaula para casa após o teste.
- Limpe a garrafa com água e em seguida, spray etanol a 70% v/v ao longo da parede interna higienizar e remover rato perfumes. Seque o cilindro antes de outro rato é colocado no.
- Reproduzir o vídeo em uma taxa de 0,5 x a velocidade normal e contar o número de elevadores de pata contra a parede de cada rato.
Nota: Pata elevadores ocorrem quando o mouse cresce em seus membros traseiros, levanta as duas patas dianteiras acima do nível do ombro e terras. Um elevador do membro anterior não é contado. Normalmente, um mouse gera seus membros dianteiros para tocar as paredes do cilindro. Se o mouse gera seus membros dianteiros, acima dos ombros várias vezes continuamente sem pouso, ele deve ser contado apenas como uma vez.
3. teste de campo aberto
- Realize o teste de campo aberto 24 h após a dose de aminoácidos Excitatórios.
Nota: Isso pode ser realizado ao mesmo tempo do teste do cilindro. - Preparar uma caixa de reação de campo aberto transparente (45 cm L x 45 cm de larg x 25 cm H) com uma tampa da placa de madeira na parte inferior por um pano preto. Corrigir uma câmera (> 1 milhão-pixels de resolução) sobre o campo a uma altura de 1 m.
Nota: A cor de fundo de caixa de campo aberto deve ser diferente da cor do mouse testado para assegurar o contraste de cores no vídeo. - Ajuste a câmera para certificar-se de que a caixa de reação de campo aberto é bem no centro do vídeo.
- Colocaram um rato de teste na caixa e deixe o mouse familiarizar-se com o ambiente por cerca de 1 min.
- Gravar um vídeo de 5 min usando a câmera conectada ao computador.
- Analisar o vídeo usando ferramentas de software (por exemplo, MATLAB) para obter a figura de rastreamento de movimento, a distribuição de estática (velocidade < 1 cm/s), andando (velocidade 1-20 cm/s) e execução (velocidade > 20 cm/s) o tempo, o total percorrido distância e a média velocidade de cada rato testado.
Nota: Quando se analisa o vídeo, acompanhamos todo o corpo do mouse. A velocidade média de um corpo significa o comprimento total do caminho coberto, dividido pelo tempo decorrido. Portanto, se um mouse não se move, sua velocidade instantânea seria considerada como zero. - Limpe qualquer fezes na caixa de reação de campo aberto. Pulverizar o etanol a 70% na caixa e limpe-a.
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Representative Results
No teste de cilindro, a diminuição de fundos contra a parede foi observada em camundongos (grupo 2) tratados com aminoácidos Excitatórios do dia 1 ao dia 7 e solução salino no dia 8, em comparação com os ratos tratados com solução salina (grupo 1), enquanto observou-se um aumento de traseiros nos ratos (grupo 3) tratados com MP TP do dia 1 ao dia 7 e a l-dopa no dia 8, em comparação com os ratos (grupo 2) tratadocom com aminoácidos Excitatórios do dia 1 ao dia 7 e solução salino no dia 8 (Figura 1).
A Figura 2 mostra os traços representativos e a distribuição de tempo estático, andando o tempo e a duração dos três grupos de ratos. (A) ratos foram tratados com soro fisiológico. Em (B) os ratos tratados com aminoácidos Excitatórios do dia 1 ao dia 7 e solução salino no dia 8. Em (C) ratos tratados com aminoácidos Excitatórios do dia 1 ao dia 7 e a l-dopa no dia 8. Quando um rato estava se movendo na arena de campo aberto com velocidade < 1 cm/s, 1-20 cm/s, ou > 20 cm/s, foi julgado como estático, caminhar ou correr, respectivamente. Ratos tratadocom com apenas MPTP mostrou uma menor velocidade de movimento, uma distância menor de movimento, um tempo mais estático e um tempo de execução mais curto do que os ratos tratados com solução salina, que indicou o déficit motor induzido pelo MPTP. Ratos tratados com l-dopa e aminoácidos Excitatórios mostraram uma maior velocidade de movimento, uma longa distância de movimento, um menor tempo de estático e um tempo mais do que os ratos tratadocom com apenas MPTP (Figura 2, Figura 3), que mostrou que a l-dopa atenuado a Induzida por MPTP déficit motor.
Figura 1: efeitos de aminoácidos Excitatórios sobre o desempenho motor no teste de cilindro Isto mostra a análise dos números de criação no dia 8. * representa p < 0.05, * * representa p < 0,01 para um teste ANOVA One-Way. Todos os valores representam a média ± SD (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caminho de movimento dos ratos e a distribuição do tempo que ratos ficar, andar e correr durante 5 min no teste de campo aberto. (A) de ratos não tratados. (B) os ratos tratadocom com aminoácidos Excitatórios. Ratos de modelo (C) PD resgatados por l-dopa. Execução: o mouse estava se movendo com uma velocidade de mais de 20 cm/s. caminhada: o rato estava movendo-se em campo aberto e com uma velocidade de 1 a 20 cm/s. estática: o mouse estava estacionário (velocidade < 1 cm/s) em campo aberto (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O déficit motor induzido pelo MPTP e o efeito terapêutico de l-dopa no desempenho motor no teste de campo aberto. (A) análise de estática, caminhando e correndo o tempo. (B) análise da distância média do movimento. (C) análise de velocidade de movimento normal. representa p < 0,001, * * * representa p < 0,0001 para um teste ANOVA One-Way. Todos os valores representam a média ± SD (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido à destruição dos neurônios dopaminérgicos na substância negra do cérebro, MPTP causa sintomas de Parkinson em ratos7. L-dopa é a droga preferida para PD desde seu uso clínico, porque ele ajuda a manter as atividades diárias normais em pacientes com a polícia, com a supressão eficaz de anormalidades motor incluindo acinesia e rigidez15. Os ratos tratadocom com MPTP mostrou deficiências nos testes comportamentais como teste de cilindro e teste de campo aberto, o que poderia ser usado para estudar o modelo de aminoácidos Excitatórios. Teste de cilindro e teste de campo aberto geralmente são usados para medir a ação espontânea. Aqui, nós modificamos estes dois testes comportamentais para aplicá-las no estudo de PD. Como mostrado em nossos resultados, l-dopa pode atenuar as deficiências no comportamento, melhorar as habilidades de motor dos animais.
Normalmente, os ratos exploram seus arredors quando mantiveram introduzidas um novo ambiente. Assim, quando mantidos em um cilindro transparente, eles exploram dentro do cilindro, movimentando e aumentando seus corpos para tocar as paredes do cilindro com suas patas dianteiras. Os ratos intoxicados com agentes neurotóxicos, tais como aminoácidos Excitatórios, reduzir essa ação. Isto é que nos permite aplicar o teste do cilindro no estudo de PD. Pata elevadores quantidades indicam membro anterior uso para apoio do corpo e, portanto, são usadas para avaliar o efeito de novas entidades químicas sobre o desempenho motor16. O teste do cilindro também fornece uma medida para o membro anterior de função motora17 em muitas doenças neurodegenerativas, envolvendo lesões do córtex motor, tais como a esclerose lateral amiotrófica e atrofia espinocerebelar18.
O teste de campo aberto é um teste experimental convencionalmente usado para ensaiar os níveis gerais de atividade locomotora e a vontade de roedores em termos do tempo que ficam no centro da caixa. Medição de caminho de movimento, velocidade e os ratos de tempo ficar, andar e correr respectivamente em todo o campo ao invés de uma área específica em campo aberto pode avaliar a função motora em PD19. Aproveitando a simples e facilmente disponível software de codificação (ver a Tabela de materiais), podemos obter e analisar os dados relacionados à função locomotora eficientemente.
O teste do cilindro e o teste de campo aberto foram escolhidos para medir função locomotiva espontânea em ratos do modelo PD pelas seguintes razões. Os ratos não precisam ser treinados antes dos testes comportamentais. Apenas alguns minutos são necessários para a resposta, que garante a eficiência. O custo dos equipamentos necessários para a realização de testes é baixo. No entanto, a grande desvantagem desta medida é que os níveis de atividade dos animais podem variar significativamente devido às alterações do ambiente e as diferenças individuais. Para reduzir a quantidade de variação nos dados de resultado, devem ser tomadas precauções. Em primeiro lugar, os animais da mesma idade, sexo e fundo genético20,21,22 devem ser avaliados ao mesmo tempo. Em segundo lugar, o equipamento, o cilindro e o campo aberto, precisam ser limpos antes e após o teste a cada rato. Finalmente, manter o ambiente calmo e imperturbável durante o teste.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nosso trabalho é financiado pela Tianjin graduação programas de formação para inovação e empreendedorismo (Grant no. 63183004). Este projeto foi iniciado no estado chave laboratório de medicamentos químicos biologia na Universidade de Nankai. Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
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