Summary
يصف هذا المقال طريقة جديدة لتوليد مستضد الورم محددة المستحثة المتعددة القوى الخلايا الجذعية المستمدة من المهاجرين الثيميك (iTE) من قبل نظام الثقافة الثهيميك ثلاثي الأبعاد (3D). iTE هي مجموعة فرعية متجانسة من الخلايا T ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا T السذاجة مع القدرة على الانتشار، وتشكيل الذاكرة، وقمع الورم.
Abstract
إن وراثة مستقبلات الخلايا T التي تم إعادة ترتيبها مسبقًا (TCRs) وتجديدها الجيني يجعل الخلايا الجذعية المتعددة القوى المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC) مصدراً واعداً للعلاج بالخلايا T بالتبني (ACT). ومع ذلك، فإن الأساليب الكلاسيكية في المختبر لإنتاج الخلايا T المجددة من iPSC تؤدي إما إلى الخلايا T الفطرية أو المتمايزة بشكل نهائي، والتي تتميز بشكل ظاهري ووظيفي عن الخلايا الساذجة T. في الآونة الأخيرة، تم تطوير رواية ثلاثية الأبعاد (3D) نظام الثقافة الثيميك لتوليد مجموعة فرعية متجانسة من CD8αβ+ الخلايا T مستضد محددة مع النمط الظاهري الوظيفي T الخلية السذاجة، بما في ذلك القدرة على الانتشار، وتشكيل الذاكرة ، وقمع الورم في الجسم الحي. يتفادى هذا البروتوكول مصائر النمو الشاذة، مما يسمح بتوليد خلايا T مشتقة من iPSC ذات الصلة سريرياً، والمصنفة كمهاجرين ثيميك مشتقة من iPSC(iTE)، مع توفير أداة قوية لتوضيح الوظائف اللاحقة الضرورية لنضج الخلية T بعد اختيار الغدة الصعترية.
Introduction
يمكن أن يكون العلاج بالخلايا T بالتبني (ACT) علاجًا فعالًا لبعض المرضى المصابين بالسرطان المتقدم. لسوء الحظ، العديد من المرضى لا يعانون من تراجع الورم، والخلايا المنقولة تفشل في الاستمرار بعد التسريب. قد يكون هذا بسبب جودة الخلايا T غرست. وأظهر نموذج الماوس ACT أنه بالمقارنة مع الخلايا T الذاكرة المركزية السذاجة أو أقل تميزا، والخلايا تأثير متباينة بشكل نهائي هي أقل قوة بسبب الفقراء في استمرار الجسم الحي1، وهي ملاحظة تدعمها أيضا البيانات السريرية2، 3.
في محاولة لتحسين فعالية ACT الحالي، وقد درست الخلايا الجذعية المضادة للقوى المستحثة T (T-iPSC) على نطاق واسع4،5. عندما يتم إعادة برمجة الخلايا T في T-iPSC وإعادة تمييزها في الخلايا T، يتم وراثة التكوين المعاد ترتيبها من جينات TCR بواسطة T-iPSC، وبالتالي الخلايا T المعاد تمييزها. ولذلك، فإن قدرة T-iPSC على الخضوع للتوسع غير محدود في المختبر يسمح بالتكاثر الفعال للخلايا T غير الناضجة التي تحمل مستقبلات الخلايا T الخاصة بمستضد جديد (TCR) عندما يتم تصميم هذه الخلايا من الخلايا T مستضد الورم6 ،7. ومع ذلك، فإن الطريقة الدقيقة للتمييز بين T-iPSC في الخلايا T الناضجة، والتي من شأنها أن تسمح بإنتاج الخلايا T مستضد السرطان محددة مع النمط الظاهري أقل تميزا وأفضل فعالية المضادة للورم، لا يزال يتعين توضيحها.
T-iPSC التمايز توظيف الثقافة المشتركة للخلايا سترومال murine OP9 الإفراط في التعبير عن الإنسان الشق ligand DLL1 هو أسلوب راسخ لإنتاج الخلايا T في المختبر6،7. في الفئران والبشر، وهذا النظام الثقافة المشتركة يمكن أن تميز باستمرار iPSC، وبالتالي تلخيص الأحداث التنموية من مرحلة الكيسة الكيسية حتى غير ناضجة T خلية النسب المرحلة6،7. وعلى الرغم من هذه التطورات التكنولوجية الحيوية، لا يزال من الصعب تحقيق التمايز الفسيولوجي بعد مرحلة CD4+CD8+ الإيجابية المزدوجة (DP). أحد الأسباب هو أنه في الجسم الحي CD4+CD8- CD4-CD8+ خلايا T إيجابية واحدة (SP) يتم إنشاؤها في الغدة الصعترية، وهو جهاز مسؤول عن نضج واختيار الخلايا T التي لديها مستضد أجنبي ولكن لا النشاط التلقائي8. وتُعرَّف هذه العمليات الانتقائية بأنها اختيار إيجابي وسلبي، على التوالي. ومع ذلك، فإن معظم الآليات الجزيئية اللازمة لنضج الخلايا T في الغدة الصعترية لا تزال غير مفهومة تماما، مما يجعل من الصعب إعادة بناء هذه العملية في المختبر. في محاولة للتغلب على هذه العقبة الفسيولوجية، وقد حفزت عدة مجموعات مجمع TCR باستخدام الأجسام المضادة CD3 أو الببتيدات المؤثرة. هذه التقنيات في المختبر توليد منتجات الخلايا التي تعبر عن علامات الخلية T الرئيسية، مثل CD3، CD8αβ، TCRαβ، وCD62L، مع الحفاظ على خصوصية مستضد الورم. لسوء الحظ، تشكل الخلايا T الناتجة عن هذه الأساليب خارج الثيميك مجموعة واسعة من الخلايا غير المتجانسة تتميز بانتقاء إيجابي غير كامل، وميزات تشبه الفطرية، والقتل غير محدد TCR، وعدم القدرة على تكوين الذاكرة، و الآثار المضادة للورم غير المستمرة في الجسم الحي8،9،10،11. وقد أثارت هذه التشوهات مخاوف من أن مثل هذه الخلايا قد تؤدي إلى مجموعة متنوعة من الآثار الجانبية، بما في ذلك سرطان الغدد الليمفاوية وتشوهات الجلد والعظام على حد سواء، إذا ما استخدمت للتطبيقات العلاجية12،13،14 .
لإعادة إنشاء الإشارات الفسيولوجية المفقودة في أنظمة التمايز الحالية في المختبر، تم تمييز T-iPSC مستضد الورم محددة باستخدام الغدة الصعترية حصادها. تم تحسين نظام ثقافة الجهاز الغدي الصعتري الجنيني الكلاسيكي (FTOC)، الذي تم تصميمه لدراسة التطور داخل خلايا T، باستخدام نظام ثقافة ثلاثي الدّي الذي نجح في إنتاج خلايا T التي أكملت تعليم الغدة الصعترية. هذه الخلايا T ما بعد الثهيميك، والتي تم تعيينها على أنها المهاجرين الثيمية المستمدة من iPSC (iTE)، عرضت خصائص تشبه السذاجة15. وأظهرت iTE الانتشار، وتشكيل الذاكرة، والآثار الكافية المضادة للورم في نموذج الماوس ضد أورام الورم الميلانيني B16 المنشأة. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول هذا النظام FTOC رواية باستخدام نظام ثقافة ثلاثية الجوانب (الشكل1).
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للمعهد الوطني للسرطان (NCI) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة.
1- إعداد خلايا OP9/DLL1 للثقافة المشتركة مع iPSC
- ثقافة OP9/DLL1 الخلايا في وسائل الإعلام OP9 (α-الحد الأدنى المتوسطة الأساسية [α-MEM] + 20٪ غير الحرارة غير تنشيط مصل البقر الجنيني [FBS] + 1X البنسلين-العقديات + حمض الاسكوربيك [50 نانوغرام / مل] وأحادية ثيوغليسيرول [100 نانومتر]) في 37 درجة مئوية. عندما تصل خلايا OP9/DLL1 إلى 80-95% من الملاءمة، اغسل مرة واحدة مع 1x المغنيسيوم والكالسيوم والفينول الأحمر الفوسفات الحر المخزنة المالحة (يشار إليها فيما يلي باسم PBS).
- إضافة 4 مل من 0.05٪ تريبسين وحضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية. ثم إضافة 4 مل من وسائل الإعلام OP9، وفصل طبقة الخلية عن طريق الأنابيب لجعل تعليق خلية واحدة.
- نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة خلية 100 م. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، يستنشق supernatant، وإعادة تعليق في 12 مل من وسائل الإعلام OP9.
- لوحة 2 مل من OP9/DLL1 تعليق الخلية على جديد 10 سم خلية الثقافة طبق بيتري وإضافة إضافية 8 مل من وسائل الإعلام OP9. كرر المرور كل 2-3 أيام.
ملاحظة: جودة FBS وظروف الثقافة هامة للحفاظ على توسيع خلايا OP9/DLL1 دون فقدان قدرتها على دعم تمايز iPSC. ولذلك، فمن المستحسن أن تقييم مسبق لكثير من FBS والمرور باستمرار في الملاءمة 80٪ لمنع تمايز الخلايا والحساسية. من المهم أيضًا جعل مخزون مجمد كافٍ من خلايا OP9/DLL1 وذوبان مخزون جديد كل 4-6 أسابيع.
2. في المختبر التمايز من iPSC في الخلايا T غير ناضجة
-
في اليوم 0، ابدأ iPSC الثقافة المشتركة على الأطباق OP9/DLL1 confluent.
- حصاد iPSC كتعليق خلية واحدة عن طريق trypsinization (5 دقائق في 0.05٪ تريبسين في 37 درجة مئوية)، وجمع الخلايا، والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- قم بإستقان الخلايا الفائقة وإعادة تعليقها بمعدل 1.0 × 105 iPSC لكل 10 مل من وسائط OP9. اللوحة 1.0 × 105 iPSC على طبق OP9/DLL1 10 سم.
ملاحظة: يتم استخدام أطباق OP9/DLL1 10 سم للتمايز iPSC عندما تصل إلى 90-100٪ من الملاءمة. ويمكن أن تؤثر الاختلافات في الملاءمة على كفاءة التمايز بين اللجنة.
- في اليوم 3، يستنشق وسائل الإعلام القديمة واستبدال مع 10 مل من وسائل الإعلام OP9 جديدة.
-
في اليوم السادس، خلايا المرور.
- اغسل كل طبق OP9 10 سم مع 10 مل من PBS. أضف 3 مل من 0.05% تريبسين للطبق الواحد وحضانة لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إضافة 4 مل من وسائل الإعلام OP9 وجمع الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف. تمر الخلايا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل المناوة.
- إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام التمايز (وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل الماوس Flt3 ligand [FLT3L] و 5 نانوغرام / مل الماوس IL-7) وتعليق خلية لوحة على طبق جديد 10 سم OP9 /DLL1 confluent.
- في اليوم 9، يستنشق وسائل الإعلام القديمة واستبدال مع 10 مل من وسائل الإعلام التمايز جديدة.
-
في اليوم 11 عندما يتم ملاحظة خلايا القلب في مستعمرات iPSC، فصل الخلايا غير الملتصقة ميكانيكيا عن طريق الأنابيب وتصفية من خلال مصفاة خلية 100 م. تدور في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- يستنشق ال [سوبرنتنت] ويعلق في 24 [مل] من تمايز أوساط. لوحة iPSC في OP9/DLL1 6-جيدا لوحة (4 مل / جيدا).
-
في اليوم 15، جمع جميع الخلايا غير الملتصقة وتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
- تدور في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- استمر في تمرير الخلايا غير الملتصقة كل 3-4 أيام عن طريق تكرار الخطوة 2.5.1.
3. 3D ثقافة الجهاز الثيميك لتوليد iTE
- حصاد الفصوص الغدية الجنينية الماوس ونشر الخلايا الليمفاوية الذاتية عن طريق deoxyguanosine (dGUO) العلاج كما سبق وصفه16.
- في اليوم 7 من العلاج dGUO، تأخذ أربعة أطباق جديدة 10 سم وملء كل مع 20 مل من وسائل الإعلام الكاملة (روسويل بارك التذكارية معهد وسائل الإعلام 1640 [RPMI 1640] + 10٪ FBS + 1X L-ألانل-L-الجلوتامين + 1X بيروفات الصوديوم + 1X الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية مع الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM-NEAA) + 1X البنسلين-العقديات + [1:1000] 2-ميركابتو الإيثانول).
- نقل جميع أغشية النيتروسيلولومع فصوص الغدة الصعترية في طبق واحد 10 سم. فصل الفصوص الفردية من الغشاء مع ملقط، مما يسمح لهم أن تكون مغمورة في وسائل الإعلام. تجاهل الأغشية. حضانة لمدة ساعة واحدة في RT.
- نقل فصوص الغدة الدرقية إلى طبق جديد 10 سم مع وسائل الإعلام كاملة وحضانة لمدة ساعة واحدة في RT. كرر هذه الخطوة 2 مرات أخرى.
- باستخدام الملقط، قم بإصلاح الفصوص الثيميك إلى الطبق (واحد في كل مرة)، ومن ناحية أخرى قم بعمل شق عميق 100-200 ميكرومتر في الوسط ومد نصف قطر الفص لتسهيل هجرة ذرية الخلية T إلى الفص.
- نقل فصوص الغدة الدرقية إلى طبق جديد 10 سم مليئة وسائل الإعلام التمايز الكامل (وسائل الإعلام كاملة + 5 نانوغرام / مل الماوس IL-7 + 5 نانوغرام / مل الماوس FLT3L + 5 نانوغرام / مل SCF).
- اختياريا، إذا كنت تستخدم لوحات الثقافة 3D مع شبكات المستوى السفلي والعلوي، وملء كل من الشبكات مع PBS معقمة لمنع التبخر وتجفيف قطرات شنقا.
- نقل 30 ميكرولتر من وسائل الإعلام الكاملة التي تحتوي على فص الثياميك المعالج dGuo واحد من الخطوة 3.6 إلى كل بئر من لوحة الثقافة 3D.
- جمع خلايا النسب T غير الملتصقة (الخلايا T غير ناضجة المستمدة من iPSC) من OP9/DLL1 الثقافة المشتركة (أيام 16-21) (الخطوة 2.6.2) وإعادة تعليق في 2-5 × 103 خلايا النسب T لكل 20 وسائل الإعلام .
- أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا الانسابية T إلى كل فص الثياميك في لوحة الثقافة ثلاثية المدة. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- تعيين الأنابيب P200 إلى 30 درجة مئوية وأسطاب وسائل الإعلام بعد الأنابيب عدة مرات من كل بئر لإزالة جميع الخلايا المحيطة الفصوص الغدية. تجاهل الوسائط وإضافة 30 ميكرولتر من الوسائط الكاملة. كرر هذا الإجراء 5-7 مرات لإزالة أي خلايا T غير ناضجة إضافية التي لا تهاجر إلى الفصوص. تغيير 25-30 درجة مئوية من وسائل الإعلام يوميا بعد ذلك.
- تأكد من تشكيل هالة من المهاجرين الثيوماليين المشتقة من iPSC (iTE) حول الفصوص التي تبدأ في اليوم 4-5 عن طريق الفحص المجهري الخفيف.
- جمع iTE يوميا عن طريق وسائل الإعلام pipetting دون انقطاع الفص. تغيير وسائل الإعلام كل يوم ومواصلة جمع ما يصل إلى ما يقرب من 12 يوما.
- iTE المقطوعة جاهزة للاستخدام في التحليلات الجزيئية (الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4،والشكل 5)أو في تجارب زراعة الجسم الحي.
4. إعداد الخلايا تقديم مستضد (APC)
- التضحية بفأر C57BL/6 عن طريق خلع عنق الرحم ووضعها على حصيرة غارقة مختبر كما هو موضح أعلاه.
- إزالة الطحال ووضعها على مصفاة خلية 100 ميكرومتر. ضغط الطحال على مصفاة باستخدام مغطس حقنة 12 مل لجعل تعليق خلية واحدة.
- نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 م. الطرد المركزي التعليق في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية لبيليه الخلايا.
- يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الليسات العازلة لاستبعاد خلايا الدم الحمراء (RBC). حضانة لمدة 5 دقائق في RT.
- تبريد المخزن المؤقت lysis ACK عن طريق إضافة 10 مل من PBS. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام كاملة ونقلإلى طبق بيتري معقمة 10 سم.
- الخلايا الشحمية المشعة مع 3500 راد باستخدام جهاز التشعيع (γ-radiation) لمنع انتشار الخلايا.
- إعادة الخلايا المشعة على الفور إلى حاضنة 37 درجة مئوية والثقافة بين عشية وضحاها.
- استخدام الخلايا المشععة كناقل ة أو تجميد في خلية المصرفي.
5. نبض APC مع مستضد
- عد APC المشعة الحية باستخدام مقياس الهيموكيتوميمتر نيوباور وصبغة الأزرق تريبان. حضانة APC مع الببتيدات (hgp100) أو البروتين النووي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل APC مرتين مع 10 مل من PBS لإزالة أي الببتيد اضافية.
- عد iTE وخلط مع APC في نسبة 1:1 في وسائل الإعلام الكاملة مع 100 وحدة IU IL-2 و 5 نانوغرام/مل IL-7. Aliquot 100 درجة مئوية من خليط من الخلايا (التركيز الكلي: 1 × 106 خلايا / مل) في كل بئر من مرفق منخفضة جدا U أسفل 96 لوحة جيدا والثقافة لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
- بعد 48 ساعة، نقل الخلايا إلى لوحة جديدة باستخدام ماصة متعددة القنوات ومرور كل 2-3 أيام بعد ذلك.
-
في اليوم 3، تحليل الملف الشخصي إفراز السيتوكين عن طريق تلطيخ الخلايا مع الأجسامالمضادة داخل الخلايا وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).
- إضافة 0.67 درجة مئوية / مل من مثبطات نقل البروتين (على سبيل المثال، GolgiStop) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة لتعزيز تراكم السيتوكينات داخل الخلايا. غسل مع 10 مل من PBS.
- إعادة تعليق الخلايا في 3 مل من البرد (4 درجة مئوية) PBS وإضافة ببطء 1 مل من الباردة 4٪ بارافورمالهايد (PFA) الحل.
- بعد 10 دقائق، تدور أسفل الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant وغسل مع 10 مل من PBS.
- إعادة تعليق الخلايا في 1 مل PBS + 1٪ FBS + 0.1٪ السطحي غير الأيونية، ووضعها في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- إضافة الأجسام المضادة، وحماية العينات من الضوء ووضعها في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تدور أسفل الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant، وغسل مع 10 مل من PBS.
- تدور أسفل الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS. الخلايا جاهزة للتحليل في مقياس التدفق.
Representative Results
تم تقسيم الثيموس الجنيني ة المستوّلة لتحليل ما إذا كانت خلايا سلالة T المشتقة من iPSC يمكن أن تهاجر إلى فصوص الغدة الصعترية. وكان فصوص التحكم غير المصنفة بنية الأنسجة التي تتميز بشبكة ويب الظهارية الثيميك مثل الخلايا النجمية17, نشر CD3 الذاتية+ الخلايا. من ناحية أخرى، تم إعادة ملء فصوص الثيمية التى تبذر هامدة مع الخلايا T غير الناضجة المشتقة من iPSC بخلايا CD3+ الخلايا أحادية النووية، مما يشير إلى هجرة الخلايا T غير الناضجة المشتقة من iPSC إلى الفصوص (الشكل 2A).
الخلايا T التي انتقلت إلى ونضجت داخل البيئة الدقيقة الثيمية في وقت لاحق الخروج كما iTE. لاختبار توصيفها الفينوتي، تم إجراء تحليل مقياس التدفق للخلايا الصعترية C57BL6، والخلايا T غير الناضجة المشتقة من Pmel iPSC (extrathymic)، والخلايا التي تم الخروج من الفصوص الثياميك (iTE). وأظهرت الخلايا T Extrathymic على OP9 /DLL1 CD4+CD8+ (DP) T الخلايا والخلايا T CD8αSP دون التعبير عن علامة الاختيار الإيجابية MHC-I، في حين كان iTE عدد السكان واضحة من CD8αSP MHC-I+ T فينولتيبي، مما يدل على مرور ناجح من خلال اختيار إيجابي قبل الخروج من فصوص الغدة الصعترية. iTE باستمرار التعبير MHC-I و CD62L، والتي هي علامات المرتبطة بكفاءة عالية التكاثر، وإنتاج السيتوكين، والبقاء على قيد الحياة الطرفية، واللمفاوية homing18،19،20. هذا النمط الظاهري يتسق مع الخلايا الصعترية M2 SP التي هي السكان الأكثر نضجا من الخلايا T إيجابية واحدة في الغدة الصعترية20، مما يشير إلى أن iTE قد انتقلت من خلال برنامج النمو الغدي العادي (الشكل 3). لرصد كفاءة توليد iTE، تم عزل الخلايا التي كانت قد تجاوزت من فصوص الغدة الصعترية الفردية. في اليوم السابع، ولدت فصوص الثياميك في المتوسط 1 × 103 CD8SP CD45.1 الحية+ CD3+ iTE في اليوم الواحد (الشكل3B). ويلاحظ معدل مماثل لإنتاج iTE من اليوم 6 إلى اليوم 12 من 3D الثيقية الثقافة المشتركة.
تم تحليل التنشيط وإفراز السيتوكينات المعتمدة على المستضد لمراقبة الخصائص الوظيفية للخلايا T غير الناضجة المشتقة من الـ iPSC المتعلمة من الناحية الصعترية. في وجود الببتيد غير ذي صلة (البروتين النووي)، لم تطلق Pmel-iTE كميات كبيرة من TNF-α، IL-2، أو IFN-γ. عندما حفزت مع الببتيد cognate لخلايا T Pmel (hgp100)، أصدرت Pmel-iTE كميات قوية من TNF-α و IL-2، في حين تنتج أيضا كميات منخفضة من IFN-γ (الشكل4)،مما يشير إلى أن iTE المتعلمة الثلنفية يمكن التعرف على الببتيد كونيات و تفرز تأثير cytokines مع لمحة تشبه تلك التي من المهاجرين الثهيميك الطبيعية الأخيرة (RTE).
لدراسة الاختلافات النسخية بين خلايا النسب T المشتقة من iPSC المتمايزة على OP9/DLL1 مع أو بدون تعليم الثيميك (أي iTE مقابل الخلايا T خارج الثية)، تم إجراء تحليل RNA-seq على هاتين المجموعتين ومقارنتها إلى أن خلايا النسب DP T تميز باستخدام OP9/DLL1 (DP) وCD8 السذاجة الأساسية+ خلايا T Pmel. تم تحليل التعبير عن 102 الجينات التي تلعب أدوارا حاسمة في الخلايا T ontogeny، تنشيط الغدة الدرقية، وتشكيل الذاكرة15،20،21،22. وأظهر تحليل مكون رئيسي لهذه المجموعات السكانية الأربعة المدروسة أن خلايا DP وCD8SP T التي تم إنشاؤهابشكل إضافي مجمعة معًا، في حين تجمعت iTE بالقرب من الخلايا الساذجة T (الشكل 5). بشكل جماعي، تبين هذه البيانات أن iTE لديها النمط الظاهري أقرب إلى الخلايا T السذاجة من خلايا النسب T التي تم إنشاؤها بواسطة أساليب خارج الثيميك.
الشكل 1 : نظرة عامة تخطيطية للتمايز iPSC إلى iTE باستخدام OP9/DLL1 و ثقافة الغدة الصعترية ثلاثية الد. وينطوي البروتوكول على ثلاث خطوات تمايز منفصلة؛ (يسار) من خلايا iPSC إلى خلايا النسب المكونة للدم على OP9/DLL1 (اليوم 0 إلى 6)، (الأوسط) من خلايا النسب المكونة للدم إلى الخلايا T غير الناضجة على OP9/DLL1 مع السيتوكينات (اليوم 6 إلى 16-21)، و (يمين) من الخلايا T غير الناضجة (اليوم 16-21) إلى iTE باستخدام نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثية الدّالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الكيمياء المناعية للفصوص الثيميك المصنفة مع الخلايا T غير الناضجة المشتقة من iPSC. أعلى: H & E تلطيخ الفص الثياميك مع وبدون البذر من الخلايا T غير ناضجة المستمدة من iPSC. من أعلى إلى أسفل الثاني: صور confocal من الفصوص المقطعة ملطخة DAPI (نواة)، CD3 (خلية T)، ودمج. قضبان مقياس = 100 درجة.
الشكل 3 : iTE تظهر النمط الظاهري للخلايا T بعد الغدة الدرقية. (أ) تحليلات FACS من الخلايا الصعترية، الخلايا T خارج الثيميك (OP9/DLL1 نظام الثقافة المشتركة) وPmel-iTE. تم بوابات الخلايا الحية على CD45+congenic . تم تحليل مجموعات CD8 SP بشكل أكبر للتعبير CD62L و MHC-I. (ب) متوسط عدد CD8SP CD45.1 iTE المنتجة بين عشية وضحاها لكل فص 7 أيام بعد البذر المسبق. وتم جمع البيانات من 12 تجربة مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : iTE إنتاج السيتوكينات المختلفة عن طريق التحفيز مستضد محددة. تحليلات FACS لإنتاج السيتوكينات داخل الخلايا من قبل iTE. وقد شارك في زراعة iTE مع APCs محملة مسبقا مع غير ذي صلة (نيوكليوبروتين) أو كونيات (hgp100) الببتيد لمدة ثلاثة أيام. تشير الأرقام الموضحة في الربع الأيمن العلوي إلى النسب المئوية لـ iTE المنتجة للسيتوكين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : تحليل النسخ الكامل يكشف عن تحول في التعبير الجيني iTE نحو CD8 ساذجة + برنامج الخلايا T. تحليل المكون الرئيسي (PCA) لبيانات RNA-seq من DP وCD8 SP وiTE والخلايا T السذاجة. (تحليل 102 الجينات المتعلقة بالتمايز الثيميك باستخدام قاعدة البيانات العامة GSE105110) 15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
استخدام T-iPSC لتجديد الخلايا T مستضد الورم محددة قد التغلب على العديد من العقبات الحالية من ACT عن طريق توليد الخلايا الشابة مع تحسين الثبات. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن عدة طرق باستخدام نظام الثقافة المشتركة OP9/DLL1 لتوليد خلايا SP CD86و7و10و13 التي تعبر عن جزيئات CD8 وTCRs مستضد الورم، الجينات العالمية تظهر أنماط التعبير والتحليل الوظيفي أن هذه الخلايا CD8 SP المجددة بشكل إضافي تختلف عن الخلايا T السذاجة (الشكل 4). هنا، نقوم بوصف نظام الثقافة الثهيميك ثلاثية الدّيّة الذي يمكن أن يولد المهاجرين الثهيميك المشتقة من iPSC (iTE) مع الإخلاص العالي والتجانس من murine T-iPSC. iTE تشبه الخلايا T السذاجة في نمط التعبير الجيني العالمي وفي الأداء الوظيفي، مثل تكوين الذاكرة وفي الجسم الحي تأثير مضاد للورم ضد الورم المعمول به15.
نظام FTOC الكلاسيكي هو وسيلة لتلخيص اختيار الغدة الصعترية في المختبر. وقد تم استخدامه لدراسة التطور داخل الغدة الدرقية من الخلايا الصعترية23، وهناك عدد قليل من التقارير من FTOC تستخدم لتوليد RTE24. ومع ذلك، فإن نظام لجنة البراءات والمياه والمياه والمياه لديها عدة قيود. للتعامل مع نقص الأكسجين في ثقافة الجهاز الاصطناعي، وقد استخدمت عدة مجموعات إما ثقافة شبه جافة الغشاء القائم23،أو ارتفاع نظم ثقافة غمر الأكسجين25. ومع ذلك، لا توجد طرق الحالية يمكن أن تولد باستمرار مجموعة متجانسة من الخلايا T ما بعد الغدة الدرقية. للتغلب على قيود نظام FTOC الكلاسيكي، قمنا بتصميم نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثية المفعول الذي يوفر تحسينات تقنية على الطرق التقليدية15. على سبيل المثال، باستخدام طريقة زراعة الثيميك ثلاثية الابعاد، تبادل الأكسجين الأقصى وعدم وجود الإجهاد الميكانيكي للفص السطحي يحافظ على الفصوص الثيميك في بيئة أكثر فسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الثقافة على المدى الطويل بنضج خلايا T للخروج بشكل طبيعي من الفصوص الثيميك. وأخيرا، فإن المراقبة في الوقت الحقيقي والتلاعب الجزئي تمكين تبادل وسائل الإعلام ومجموعة مستمرة من iTE دون إزعاج جسديا الفصوص الغدية. وهكذا، فإن طريقة الثقافة الثيميك ثلاثية المفعول توفر تحسينات تقنية كبيرة، فضلا عن وسيلة لدراسة الخلايا T الساذجة المختارة من قبل التي لم تكن متاحة من قبل.
هناك العديد من النقاط الرئيسية للجيل الناجح من iTE باستخدام هذا النظام ثقافة الغدة الصعترية 3D. جودة FBS وظروف الثقافة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توسيع خلايا OP9/DLL1 دون فقدان قدرتها على دعم تمايز iPSC. ولذلك، نوصي قبل التقييم من الكثير FBS، فضلا عن تمرير باستمرار في الملاءمة 80٪ لمنع تمايز الخلايا والحساسية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب ثقافة OP9/DLL1 confluent للتمايز في المختبر من iPSC في الخلايا T غير ناضجة، كما يمكن أن تؤثر الاختلافات في الملاءمة على كفاءتها. وأخيراً، فإن العمر الجنيني للفصوص الثيميك أمر بالغ الأهمية لتوليد iTE. نوصي باستخدام E14.5 - 15.5 فصوص الغدة الصعترية.
كما هو الحال مع أي بروتوكول جديد، هذه الطريقة لها قيود وتخضع للتحسين. تقنية الثقافة المعروضة هنا تولد حوالي 1000 iTE لكل فص الثيميك في اليوم الواحد لمدة أسبوعين. قد يكون من الممكن زيادة توليد iTE مع مزيد من التعديلات، بما في ذلك تحسين تركيز الأكسجين، وحجم وسائل الإعلام، ونوع لوحة الثقافة ثلاثية الأقراص. إضافة أو إزالة السيتوكينات، فضلا عن التغيرات في تركيز السيتوكين، قد تسهم أيضا في تحسين العائد iTE.
وبالنظر إلى أن نظام الثقافة الثهيميك 3D المعروضة هنا يمكن أن تولد المهاجرين الغدة الصعترية في نظام الجسم الحي السابق تماما، ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مشاريع البحوث نقل الخلايا المناعية والتبني بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر T تمايز الخلايا، ونضج الخلايا T بعد الغدة الصعترية، وتوليد الخلايا T مستضد محددة من السلف المكونة للدم أو الخلايا الجذعية. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تنطبق مباشرة على العينات البشرية، iTE ونظام الثقافة الثيميك 3D تحمل إمكانات كبيرة لتوضيح الآليات الجزيئية للاختيار الإيجابي والسلبي، ويمكن أن تسهل إنشاء نظام الثقافة التي تمكن توليد الخلايا T ذات الصلة سريريا الورم مستضد محددة السذاجة مثل لACT.
Disclosures
المؤلفون راؤول فيزكاردو، نيكولاس د. كليمن، ونيكولاس ب. ريستيفو مخترعون في طلب براءة اختراع دولي معلق PCT/US2017/65986، قدم في 13 ديسمبر 2017، بعنوان "طرق إعداد السكان المعزولين أو المنقيين من خلايا المهاجرين الثيمية وطرق العلاج باستخدام نفس الشيء.
Acknowledgments
نشكر هيروشي كاواموتو وكيوكو ماسودا على تقديم خط الخلية OP9/DLL1. نشكر آلان ب. هوفرينغ وإيرينا زي. هو للمساعدة الرسومية. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من المعهد الوطني للسرطان في الولايات المتحدة (ZIA BC010763) وبرنامج سرطان مونشوت لمركز العلاج القائم على الخلايا في NCI، المعاهد القومية للصحة. كما حظيت هذه الأعمال بدعم من مؤسسة عائلة ميلشتاين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100 μm | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40 μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
References
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P.
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
- Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
- Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
- Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
- Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
- Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
- Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
- Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
- Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).
