Summary
यह लेख एक तीन आयामी (3 डी) थाइमिक संस्कृति प्रणाली द्वारा ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है। iTE टी कोशिकाओं का एक समरूप सबसेट बारीकी से प्रसार के लिए क्षमता के साथ भोले टी कोशिकाओं से संबंधित हैं, स्मृति गठन, और ट्यूमर दमन.
Abstract
पूर्व-व्यवस्थित टी सेल रिसेप्टर्स (टी.सी.आर.) और उनके एपिजेनेटिक कायाकल्प की विरासत प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) व्युत्पन्न टी कोशिकाओं दत्तक टी सेल थेरेपी (ACT) के लिए एक आशाजनक स्रोत बनाते हैं। हालांकि, iPSC से पुनर्जीवित टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए शास्त्रीय इन विट्रो विधियों में या तो सहज की तरह या अंत में विभेदित टी कोशिकाओं, जो phenoआमरूपऔर और कार्यात्मक भोले टी कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं में परिणाम. हाल ही में, एक उपन्यास तीन आयामी (3 डी) थाइमिक संस्कृति प्रणाली CD8 के एक समरूप सबसेट उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था- + एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ एक भोले टी सेल की तरह कार्यात्मक phenotype, प्रसार के लिए क्षमता सहित, स्मृति गठन , और विवो में ट्यूमर दमन. इस प्रोटोकॉल aberant विकास भाग्य से बचा जाता है, नैदानिक रूप से प्रासंगिक iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, iPSC व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) के रूप में नामित है, जबकि यह भी बाद के कार्यों को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने के लिए आवश्यक थाइमिक चयन के बाद टी सेल परिपक्वता के लिए.
Introduction
दत्तक टी सेल थेरेपी (ACT) उन्नत कैंसर के साथ कुछ रोगियों के लिए एक प्रभावी उपचार हो सकता है. दुर्भाग्य से, कई रोगियों ट्यूमर प्रतिगमन का अनुभव नहीं है, और स्थानांतरित कोशिकाओं जलसेक के बाद जारी रखने के लिए असफल। यह संचार टी कोशिकाओं की गुणवत्ता के कारण हो सकता है। एक अधिनियम माउस मॉडल से पता चला है कि भोले या कम विभेदित केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं की तुलना में, टर्मिनल विभेदित effector कोशिकाओं vivo हठ1में गरीब के कारण कम शक्तिशाली हैं , एक अवलोकन भी नैदानिक डेटा द्वारा समर्थित2, 3.
वर्तमान अधिनियम की प्रभावकारिता में सुधार करने के प्रयास में, टी सेल व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (टी-iPSC) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है4,5. जब टी कोशिकाओं T-iPSC में reprogrammed और टी कोशिकाओं में फिर से अलग कर रहे हैं, TCR जीन का पुनर्व्यवस्थित विन्यास टी-iPSC द्वारा विरासत में मिला है, और बाद में फिर से अलग टी कोशिकाओं. इसलिए, टी-आईपीएससी की क्षमता इन विट्रो विस्तार में असीमित से गुजरना करने के लिए अपरिपक्व टी कोशिकाओं के कुशल प्रजनन neoantigen-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स ले जाने की अनुमति देता है जब ऐसी कोशिकाओं ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं से इंजीनियर हैं6 ,7. हालांकि, परिपक्व टी कोशिकाओं में टी-आईपीएससी के भेदभाव के लिए सटीक विधि, जो कम विभेदित फीनोटाइप और बेहतर एंटी-ट्यूमर शक्ति के साथ कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के उत्पादन की अनुमति देगा, स्पष्ट किया जा करने के लिए रहता है।
टी-आईपीएससी विभेदन ओपी 9 में यूरीन स्ट्रॉमल कोशिकाओं के सह-संवर्धन को नियोजित करता है, जो मानव पायदान लिगंड डीएलएल 1 को अधिक व्यक्त करता है, यह इन विट्रो6,7में टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए एक सुस्थापित विधि है। चूहों और मनुष्यों में, यह सह-संस्कृति प्रणाली लगातार आईपीएससी में अंतर कर सकती है, जिससेविकास की घटनाओं को ब्लास्टोसिस्ट चरण से तब तक पुन: लागू किया जा सकता है जब तक कि अपरिपक्व टी सेल वंश चरण 6,7तक। इन जैव प्रौद्योगिकी प्रगति के बावजूद, CD4+CD8+ डबल सकारात्मक (डीपी) चरण के बाद शारीरिक भेदभाव अभी भी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. कारणों में से एक यह है कि विवो CD4+CD8में - और CD4-CD8+ एकल सकारात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं थाइमस में उत्पन्न कर रहे हैं, परिपक्वता और टी कोशिकाओं है कि विदेशी प्रतिजन विशिष्टता के चयन के लिए जिम्मेदार एक अंग लेकिन नहीं ऑटो प्रतिक्रिया8| इन चयनात्मक प्रक्रमों को क्रमशः धनात्मक तथा ऋणात्मक चयन के रूप में परिभाषित किया जाता है। हालांकि, थाइमस में टी कोशिकाओं को परिपक्व करने के लिए आवश्यक अधिकांश आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं, जिससे इन विट्रो में इस प्रक्रिया को फिर से बनाना मुश्किल हो गया है। इस शारीरिक बाधा को दूर करने के प्रयास में, कई समूहों ने एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी या एगोनिस्ट पेप्टाइड्स का उपयोग करके टीसीआर परिसर को प्रेरित किया है। इन इन इन इन इन सेल उत्पादों को उत्पन्न करते हैं जो कुंजी टी सेल मार्करों को व्यक्त करते हैं, जैसे CD3, CD8,TCR], और CD62L, जबकि अभी भी ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्टता को बनाए रखने. दुर्भाग्य से, टी कोशिकाओं इन extrathymic तरीकों से उत्पन्न अपूर्ण सकारात्मक चयन, सहज की तरह सुविधाओं, टीसीआर गैर विशिष्ट हत्या, स्मृति गठन के लिए असमर्थता, और की विशेषता कोशिकाओं की एक व्यापक विषमजात आबादी का गठन विवो8,9,10,11में गैर-निरंतर एंटी-ट्यूमर प्रभाव । इन असामान्यताओं चिंताओं उठाया है कि ऐसी कोशिकाओं के साइड इफेक्ट की एक किस्म को गति प्रदान कर सकते हैं, लिंफोमा और दोनों त्वचा और हड्डी असामान्यताएं सहित, अगर चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया12,13,14 .
इन विट्रो विभेदन प्रणालियों में वर्तमान में लापता शारीरिक संकेतों को विश्राम करने के लिए, ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी-आईपीएससी को काटा गया थाइमस का उपयोग करके विभेदित किया गया था। शास्त्रीय भ्रूण थाइमस अंग संस्कृति (FTOC) प्रणाली है, जो टी कोशिकाओं के अंतर-थाइमिक विकास का अध्ययन करने के लिए डिजाइन किया गया था, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली है जो सफलतापूर्वक टी कोशिकाओं है कि थाइमिक शिक्षा पूरा का उत्पादन का उपयोग करके सुधार किया गया था। इन पोस्ट-थाइमिक टी सेल, जिन्हें आईपीएसएससी व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (आईआईटीई) के रूप में नामित किया गया था, ने भोले-समान गुणों का प्रदर्शनकिया। iTE स्थापित B16 मेलेनोमा ट्यूमर के खिलाफ एक माउस मॉडल में प्रसार, स्मृति गठन, और पर्याप्त विरोधी ट्यूमर प्रभाव दिखाया. यह आलेख 3D संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके इस उपन्यास FTOC प्रणाली के प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है (चित्र1)।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनसीआई) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था और एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।
1. आईपीएससी के साथ सह-संस्कृति के लिए OP9/
- OP9 मीडिया में संस्कृति OP9/DLL1 कोशिकाओं ([न्यूनतम आवश्यक मध्यम [-एमईएम] + 20% गैर-हीट निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS] + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन + ascorbic एसिड [50 ng/mL] और मोनो-थियोग्लिसरोल [100 एनएम] 37 पर जब OP9/DLL1 कोशिकाओं 80-95% संगम तक पहुँचने, 1x मैग्नीशियम, कैल्शियम, और फीनॉल लाल मुक्त फॉस्फेट बफर नमकीन (बाद में पीबीएस के रूप में संदर्भित) के साथ एक बार धो लें.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन और इनक्यूबेट के 4 एमएल जोड़ें। फिर OP9 मीडिया के 4 एमएल जोड़ें, एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए पाइपिंग द्वारा सेल परत को अलग करें।
- 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को प्रेरित करें, और OP9 मीडिया के 12 एमएल में फिर से तैयार करें।
- एक नया 10 सेमी सेल संस्कृति पेट्री डिश पर OP9/DLL1 सेल निलंबन की प्लेट 2 एमएल और OP9 मीडिया के अतिरिक्त 8 एमएल जोड़ें। हर 2-3 दिनों में मार्ग दोहराएँ।
नोट: आईपीएससी विभेदन का समर्थन करने की क्षमता खोए बिना ओपी9/डीएलएल1 कोशिकाओं के विस्तार को बनाए रखने के लिए एफबीएस और संस्कृति की स्थिति की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इसलिए, सेल भेदभाव और जीर्णता को रोकने के लिए लगातार 80% संगम पर एफबीएस और मार्ग के बहुत से पूर्व मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। यह भी महत्वपूर्ण है कि OP9/DLL1 कोशिकाओं के पर्याप्त जमे हुए स्टॉक बनाने के लिए और एक नया स्टॉक हर 4-6 सप्ताह thaw.
2. अपरिपक्व टी कोशिकाओं में iPSC के Vitro भेदभाव में
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0 दिन, OP9/DLL1 confluent व्यंजन पर iPSC सह संस्कृति शुरू करते हैं.
- ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा एकल सेल निलंबन के रूप में फसल iPSC (5 मिनट में 0.05% trypsin 37 डिग्री सेल्सियस पर), कोशिकाओं को इकट्ठा, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण।
- ओ.पी.9 मीडिया के प्रति 10 एमएल पर 1.0 x 105 iPSC पर सुपरनेंट और पुन: निलंबित कोशिकाओं को प्रेरित करें। प्लेट 1.0 x 105 iPSC एक confluent OP9/DLL1 10 सेमी पकवान पर.
नोट: OP9/DLL1 10 सेमी व्यंजन iPSC भेदभाव के लिए उपयोग किया जाता है जब वे 90-100% संगम तक पहुँचने. संगम में अंतर iPSC भेदभाव की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं.
- तीसरे दिन, पुराने मीडिया aspirate और ताजा OP9 मीडिया के 10 एमएल के साथ बदलें.
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6 दिन, मार्ग कोशिकाओं.
- पीबीएस के 10 एमएल के साथ प्रत्येक 10 सेमी confluent OP9 पकवान धो लें. प्रति डिश 0.05% ट्रिप्सिन का 3 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- OP9 मीडिया के 4 एमएल जोड़ें और कोमल pipeting द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 100 डिग्री कोशिका छलनी और अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को गुजरती हैं। महादलित को त्याग दें।
- भेदभाव मीडिया के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (OP9 मीडिया के साथ 5 ng/mL माउस Flt3 ligand [FLT3L] और 5 ng/mL माउस आईएल-7) और एक नया 10 सेमी OP9/DLL1 confluent पकवान पर प्लेट सेल निलंबन.
- 9 दिन, पुराने मीडिया aspirate और ताजा भेदभाव मीडिया के 10 एमएल के साथ बदलें.
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11 दिन जब कार्डियोमायोसाइट्स को आईपीएससी कॉलोनियों में मनाया जाता है, तो यंत्रवत् रूप से बिना किसी संलग्न कोशिकाओं को पाइपिंग द्वारा अलग कर देते हैं और 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन।
- अतिनिष्ट और भेदभाव मीडिया के 24 एमएल में फिर से शुरू करना. एक confluent OP9/DLL1 6-well प्लेट (4 एमएल/
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15 दिन, सभी गैर-अनुकूल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन।
- चरण 2.5.1 दोहराकर प्रत्येक 3-4 दिनों में गैर-अनुकूल कक्षों को जारी रखें.
3. 3 डी Thymic अंग संस्कृति iTE उत्पन्न करने के लिए
- हार्वेस्ट माउस भ्रूण थाइमिक लोब और deoxyguanosine (dGUO) उपचार द्वारा अंतर्जात लिम्फोसाइटों की तैनाती के रूप में पहले वर्णित16.
- DGUO उपचार के 7 दिन, चार नए 10 सेमी व्यंजन लेने के लिए और पूरा मीडिया के 20 एमएल के साथ प्रत्येक को भरने (Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडिया 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamine + 1x सोडियम pyruvate + 1x गैर-aminos के साथ न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम-एनईए) + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन + [1:1000] 2-mercapto इथेनॉल).
- सभी नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली को थाइमिक लोब के साथ एक 10 सेमी डिश में स्थानांतरित करें। झिल्ली से अलग-अलग पालियों को बलके साथ हटा दें, जिससे वे मीडिया में डूब जासकें। झिल्ली को त्यागें। आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
- थाइमिक लोब को एक नए 10 सेमी डिश में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्ण मीडिया के साथ और आरटी पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को 2 और बार दोहराएं।
- बलप्स का उपयोग करके, थाइमिक लोब को डिश (एक समय में एक) को ठीक करें, और दूसरे हाथ से केंद्र में 100-200 0 मीटर गहरा चीरा बनाएं और पालि के आधे व्यास का विस्तार करें ताकि पालि में टी सेल जनक प्रवास को सुविधाजनक बनाया जा सके।
- एक नया 10 सेमी पूर्ण भेदभाव मीडिया से भरा पकवान में थाइमिक lobes स्थानांतरण (पूर्ण मीडिया + 5 ng/mL माउस आईएल-7 + 5 ng/mL माउस FLT3L + 5 ng/mL SCF).
- वैकल्पिक रूप से, अगर निचले और ऊपरी स्तर के ग्रिड के साथ 3 डी संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर, बाँझ पीबीएस के साथ दोनों ग्रिड भरने वाष्पीकरण और फांसी बूंदों के सुखाने को रोकने के लिए.
- 3 डी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में चरण 3.6 से एक dGuo-उपचार थाइमिक पालि युक्त पूर्ण मीडिया के 30 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण।
- OP9/DLL1 सह-संस्कृति (दिन 16-21) (चरण 2.6.2) से गैर-अनुकूल टी वंश कोशिकाओं (iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं) लीजिए और 2-5 x 103 टी वंश कोशिकाओं प्रति 20L मीडिया पर resuspend.
- 3 डी संस्कृति प्लेट में प्रत्येक थाइमिक पालि के लिए टी वंश सेल निलंबन के 20 डिग्री एल जोड़ें। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटकरें।
- P200 पाइपेट को 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और थाइमिक लोब के आस-पास की सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए प्रत्येक कुएं से कई बार पाइपिंग के बाद मीडिया को प्रेरित करें। मीडिया को छोड़ें और पूर्ण मीडिया के 30 $L जोड़ें. इस प्रक्रिया को दोहराएँ 5-7 बार किसी भी अतिरिक्त अपरिपक्व टी कोशिकाओं को हटाने के लिए जो lobes में स्थानांतरित नहीं करता है. इसके बाद प्रतिदिन मीडिया का 25-30 डिग्री सेल्सियस परिवर्तन करें।
- प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा दिन 4-5 से शुरू होने वाले खण्डों के चारों ओर iPSC व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) के एक हेलो के गठन की पुष्टि करें।
- पालि व्यवधान के बिना मीडिया पाइपिंग द्वारा दैनिक iTE लीजिए। प्रतिदिन मीडिया परिवर्तित करें और लगभग 12 दिनों तक संग्रह जारी रखें.
- फसली iTE आणविक विश्लेषणों के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं (चित्र 2, चित्र 3 , चित्र ााां त) और चित्र 5) या विवो प्रतिरोपण प्रयोगों में .
4. एंटीजन प्रस्तुत करने वाले प्रकोष्ठों की तैयारी (एपीसी)
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक C57BL/6 माउस बलिदान और ऊपर वर्णित के रूप में एक प्रयोगशाला soaker चटाई पर जगह है.
- तिल्ली निकालें और इसे 100 डिग्री सेल्सियस कोशिका छलनी पर रखें। एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक 12 एमएल सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके छलनी पर तिल्ली को संपीड़ित करें।
- एक बाँझ 40 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन स्थानांतरण. कोशिकाओं को गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
- लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को बाहर करने के लिए सुपरनेंट को प्रेरित करें और अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) lysis बफर के 2 एमएल में सेल गोली को फिर से शुरू करें। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- पीबीएस के 10 एमएल जोड़कर ACK lysis बफर को निचोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।
- सुपरनेंट को प्रेरित करें और पूर्ण मीडिया के 10 एमएल में सेल गोली को फिर से शुरू करें और 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- सेल प्रसार को रोकने के लिए एक विकिरण डिवाइस (जेड-विकिरण) का उपयोग कर 3500 रेड के साथ विकिरण splenocytes।
- तुरंत एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और संस्कृति रात भर के लिए विकिरणित कोशिकाओं को वापस.
- APC के रूप में विकिरणित कोशिकाओं का उपयोग करें या सेल बैंकर में फ्रीज.
5. Antigen के साथ एपीसी स्पंदन
- एक Neubuer hemocytometer और trypan नीले रंग का उपयोग कर लाइव विकिरणित APC गिनती. पेप्टाइड्स (hgp100) या 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए न्यूक्लिओप्रोटीन के साथ इनक्यूबेट एपीसी।
- किसी भी अतिरिक्त पेप्टाइड को हटाने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ दो बार एपीसी धोएं।
- ITE की गणना करें और 100 IU आईएल-2 और 5 एनजी/एमएल आईएल-7 के साथ पूर्ण मीडिया में 1:1 अनुपात में APC के साथ मिश्रण करें। एलिकोट 100 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं के मिश्रण के (कुल एकाग्रता: 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल) एक अल्ट्रा कम लगाव यू नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट और संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से में 48 एच पर 37 डिग्री सेल्सियस.
- 48 एच के बाद, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके एक नई प्लेट में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और उसके बाद हर 2-3 दिनों में पारित करें।
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तीसरे दिन, कोशिकाओं को इंट्राकोशिकीय एंटीबॉडी के साथ धुंधला करके साइटोकिन स्राव प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें (चित्र 3)।
- 0.67 डिग्री सेल्सियस प्रोटीन परिवहन अवरोधक (उदाहरण के लिए, GolgiStop) और 6 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें साइटोकिन्स के इंट्रासेल्यूलर संचय को बढ़ाने के लिए। पीबीएस के 10 एमएल के साथ धो लें।
- 3 एमएल ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और धीरे-धीरे 1 एमएल ठंड 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) समाधान जोड़ें।
- 10 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें, सुपरनेंट को त्यागें और पीबीएस के 10 एमएल से धो लें।
- 1 एमएल पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें + 1% एफबीएस + 0.1% nonionic सर्फैक्टेंट, और 10-15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में जगह है।
- एंटीबॉडी जोड़ें, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में प्रकाश और जगह से नमूने की रक्षा।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन, supernatant त्यागें, और पीबीएस के 10 एमएल के साथ धो लो।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें और पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: स्फूर्त करें। कोशिकाओं को एक प्रवाह साइटोमीटर में विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं.
Representative Results
सह-संस्कृत भ्रूण थाइम्यूस को यह विश्लेषण करने के लिए काट दिया गया था कि क्या आईपीएससी व्युत्पन्न टी वंश कोशिकाएं थाइमिक लोब में स्थानांतरित हो सकती हैं। गैर-सीड नियंत्रण खण्डों में एक ऊतक वास्तुकला थी जो एक एस्ट्रोसाइट की तरह थाइमिक उपकला वेब17की विशेषता थी, जो अंतर्जात CD3+ कोशिकाओं की तैनाती की गई थी। दूसरी ओर, iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त थाइमिक लोब्स सीडी 3+ मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के साथ पुन: आबाद किए गए थे, जो iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के प्रवास को खण्डों में इंगित करता है (चित्र 2ए)।
टी कोशिकाओं है कि में चले गए और थाइमिक microenvironment के भीतर परिपक्व बाद में iTE के रूप में egressed. उनके phenotypic लक्षण का परीक्षण करने के लिए, प्रवाह cytometric विश्लेषण C57BL6 थाइमोसाइट्स, Pmel iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं (extrathymic), और कोशिकाओं है कि थाइमिक lobes (iTE) से बाहर निकल गया प्रदर्शन किया गया था. OP9/DLL1 पर Extrathymic टी कोशिकाओं सीडी 4+CD8+ (डीपी) टी कोशिकाओं और सीडी 8 एसपी टी कोशिकाओं को सकारात्मक चयन मार्कर MHC-I की अभिव्यक्ति के बिना दिखाया, जबकि iTE CD8 की एक स्पष्ट आबादी थी -8SP MHC-I+ टी सेल phenotype, संकेत उनके थाइमिक lobes से बाहर निकलने से पहले सकारात्मक चयन के माध्यम से सफल मार्ग. iTE लगातार MHC-I और CD62L व्यक्त करते हैं, जो उच्च proliferative योग्यता, साइटोकीन उत्पादन, परिधीय अस्तित्व, और लिम्फोइड homing18,19,20के साथ जुड़े मार्कर हैं. यह फीनोटाइप म2 एसपी थाइमोसाइट्स के अनुरूप है जो थाइमस20में एकल धनात्मक टी कोशिकाओं की सबसे परिपक्व जनसंख्या है , जो यह सुझाव देती है कि iTE ने एक सामान्य थाइमिक विकास कार्यक्रम (चित्र 3) के माध्यम से संक्रमण किया है । iTE पीढ़ी की दक्षता पर नजर रखने के लिए, कोशिकाओं है कि व्यक्तिगत थाइमिक lobes से बाहर निकाल दिया था अलग थे. 7 दिन, थाइमिक lobes 1 x 103 लाइव CD8SP CD45.1+ CD3+ प्रति दिन iTE प्रति दिन की एक औसत उत्पन्न (चित्र 3बी). iTE उत्पादन की इसी तरह की दर 3 डी थाइमिक सह संस्कृति के 6 दिन से 12 दिन के लिए मनाया जाता है.
साइटोकिन्स के एंटीजन-निर्भर सक्रियण और स्राव का विश्लेषण किया गया थाकिइमली शिक्षित iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों का निरीक्षण करने के लिए। एक अप्रासंगिक पेप्टाइड (न्यूक्लिओप्रोटीन) की उपस्थिति में, Pmel-iTE TNF-जेड, आईएल-2, या IFN-जेड की महत्वपूर्ण मात्रा में जारी नहीं किया। जब Pmel टी कोशिकाओं (hgp100) के लिए cognate पेप्टाइड के साथ प्रेरित, Pmel-iTE TNF-जेड और आईएल -2 की मजबूत मात्रा जारी की है, जबकि भी IFN की कम मात्रा का उत्पादन - ( चित्र ाकांश4), यह दर्शाता है कि थाइमली शिक्षित iTE उनके cognate पेप्टाइड और पहचान कर सकते हैं प्राकृतिक हाल ही में थाइमिक उत्प्रवासियों (आरटीई) के समान प्रोफाइल के साथ प्रभावक साइटोकिन्स स्रावित करें।
IPSC व्युत्पन्न टी वंश कोशिकाओं के बीच प्रतिक्रिप्टिक मतभेद की जांच करने के लिए OP9/DLL1 पर या थाइमिक शिक्षा के बिना (यानी, ite बनाम extrathymic टी कोशिकाओं), आरएनए-सेक विश्लेषण इन दो आबादी पर किया गया था और तुलना में डीपी टी वंश कोशिकाओं के लिए OP9/DLL1 (डीपी) और प्राथमिक भोले CD8+ Pmel टी कोशिकाओं का उपयोग कर विभेदित. 102 जीनों की अभिव्यक्ति जो टी सेल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है , थाइमोसाइट सक्रियण , और स्मृति निर्माण का विश्लेषण15,20,21,22किया गया . उन चार अध्ययन की आबादी का एक प्रमुख घटक विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि extrathymically डीपी और CD8SP टी कोशिकाओं को एक साथ संकुल उत्पन्न, जबकि iTE भोले टी कोशिकाओं के करीब संकुल (चित्र5). सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि iTE एक phenotype भोली टी कोशिकाओं के करीब से टी वंश कोशिकाओं extrathymic तरीकों से उत्पन्न करते हैं.
चित्र 1 : OP9/DLL1 और 3 D थाइमिक संस्कृति का उपयोग कर iPSC के भेदभाव के बारे में योजना का अवलोकन। प्रोटोकॉल में तीन अलग-अलग भेदभाव के चरण शामिल हैं; (बाएं) iPSC कोशिकाओं से OP9/DLL1 पर हेमेटोपोइटिक वंश कोशिकाओं के लिए (दिन 0 से 6 ), (मध्य) hematopoietic वंश कोशिकाओं से अपरिपक्व टी कोशिकाओं के लिए OP9/DLL1 पर cytokines के साथ (दिन 6 से 16-21), और (दाएँ) अपरिपक्व टी कोशिकाओं से (दिन 16-21) एक 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर iTE. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : iPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के साथ बीज थाइमिक लोब के इम्यूनो-हिस्टोकेमिस्ट्री। ऊपर: IPSC व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के साथ और बिना एक थाइमिक पालि के एच एंड ई धुंधला। दूसरे ऊपर से नीचे तक: अनुभागीय lobes के confocal छवियों DAPI (न्यूक्लियस), CD3 (टी सेल), और मर्ज के साथ दाग. स्केल बार्स ] 100 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : iTE एक पोस्ट-थाइमिक टी सेल phenotype दिखा. (ए) थाइमोसाइट्स, एक्स्ट्राथाइमिक टी सेल (OP9/DLL1 सह-संस्कृति प्रणाली) और पीएमएल-iTE का FACS विश्लेषण करता है। लाइव कोशिकाओं को कोजनिक CD45+पर गेट किया गया था। CD8 सपा आबादी आगे CD62L और MHC-I अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया. (ख) सीडी8एसपी सीडी 45.1 आइटीई की औसत संख्या, पूर्व-बीज देने के 7 दिन बाद प्रति लोब का उत्पादन रात भर। डेटा 12 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : iTE प्रतिजन-विशिष्ट उत्तेजना द्वारा विभिन्न साइटोकिन्स का उत्पादन करता है। एफएसीएस आइटीई द्वारा साइटोकिन्स के इंट्रा-कोशिकीय उत्पादन का विश्लेषण करता है। iTE तीन दिनों के लिए अप्रासंगिक (न्यूक्लिओप्रोटीन) या cognate (hgp100) पेप्टाइड के साथ पूर्व लोड APCs के साथ सह-संस्कृत थे। ऊपरी दाएँ वृत्तों में दिखाई गई संख्याओं से साइटोकिन का उत्पादन करने वाले iTE के प्रतिशत का संकेत मिलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : पूरे-transcriptome विश्लेषण एक भोले CD8 की ओर iTE जीन अभिव्यक्ति में बदलाव का पता चलता है + टी सेल प्रोग्राम. डी पी से आरएनए-सेक डेटा के सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए), extrathymic CD8 SP, iTE, और भोले टी कोशिकाओं. (सार्वजनिक डेटाबेस GSE105110 का उपयोग कर थाइमिक भेदभाव से संबंधित 102 जीनों का विश्लेषण) 15इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
Discussion
ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के लिए टी-iPSC का उपयोग बेहतर दृढ़ता के साथ युवा कोशिकाओं पैदा करके अधिनियम की वर्तमान बाधाओं के कई दूर हो सकता है। हालांकि OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर कई तरीकों CD8 सपा कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए सूचित किया गया है6,7,10,13 कि व्यक्त CD8 अणुओं और ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट TCRs, वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और कार्यात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि इन extrathymically पुनर्जीवित CD8 सपा कोशिकाओं भोले टी कोशिकाओं से अलग हैं (चित्र 4). यहाँ, हम एक 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली है कि iPSC व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) murine टी-iPSC से उच्च निष्ठा और एकरूपता के साथ उत्पन्न कर सकते हैं का वर्णन. iTE वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में और कार्यक्षमता में भोले टी कोशिकाओं के समान है, इस तरह के स्मृति गठन के रूप में और स्थापित ट्यूमर के खिलाफ विवो विरोधी ट्यूमर प्रभाव में15.
शास्त्रीय FTOC प्रणाली इन विट्रो मेंथाइमिक चयन को पुन: दोहराने का एक तरीका है . इसका उपयोग थाइमोसाइट्स23के अंतर-थाइमिक विकास के अध्ययन के लिए किया गया है और एफ टी ओ सी के कुछ रिपोर्टें हैं जिनका उपयोग आरटीई24उत्पन्न करने के लिए किया जा रहा है . हालांकि, FTOC सिस्टम कई सीमाएँ हैं। कृत्रिम अंग संस्कृति में ऑक्सीजन की कमी से निपटने के लिए, कई समूहों ने या तो अर्ध शुष्क झिल्ली आधारित संस्कृति23या उच्च ऑक्सीजन पनडुब्बी संस्कृति प्रणालियों25का उपयोग किया है। हालांकि, कोई वर्तमान तरीकों लगातार पोस्ट-थाइमिक टी कोशिकाओं की एक समरूप आबादी उत्पन्न कर सकते हैं। शास्त्रीय FTOC प्रणाली की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली है कि पारंपरिक तरीकों15पर तकनीकी सुधार प्रदान करता है डिजाइन . उदाहरण के लिए, हमारे 3 डी थाइमिक संस्कृति विधि का उपयोग कर, अधिकतम ऑक्सीजन विनिमय और सतह-लोब यांत्रिक तनाव की अनुपस्थिति एक अधिक शारीरिक वातावरण में थाइमिक lobes रहते हैं. इसके अतिरिक्त, दीर्घकालिक संस्कृति परिपक्व टी कोशिकाओं को थाइमिक लोब से स्वाभाविक रूप से बाहर होने की अनुमति देती है। अंत में, वास्तविक समय अवलोकन और सूक्ष्म हेरफेर मीडिया विनिमय और शारीरिक रूप से थाइमिक lobes परेशान बिना iTE का एक निरंतर संग्रह सक्षम करें. इस प्रकार, 3 डी थाइमिक संस्कृति विधि महत्वपूर्ण तकनीकी सुधार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अवसर के लिए thymically चयनित भोले टी कोशिकाओं है कि पहले से उपलब्ध नहीं था अध्ययन प्रदान करता है.
इस 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर iTE की सफल पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। आईपीएससी विभेदन का समर्थन करने की क्षमता खोए बिना ओपी9/डीएलएल1 कोशिकाओं के विस्तार को बनाए रखने के लिए एफबीएस और संस्कृति की स्थितियों की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इसलिए, हम FBS बहुत के पूर्व मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लगातार 80% संगम पर passaging सेल भेदभाव और जीर्णता को रोकने के लिए सलाह देते हैं. इसके अतिरिक्त, एक confluent OP9/DLL1 संस्कृति अपरिपक्व टी कोशिकाओं में iPSC के विट्रो भेदभाव के लिए आवश्यक है, के रूप में संगम में मतभेद उनकी दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. अंत में, थाइमिक lobes के भ्रूण उम्र iTE की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है. हम E14.5 - 15.5 थाइमिक lobes का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
किसी भी नए प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इस विधि सीमाओं है और सुधार के अधीन है. यहाँ प्रस्तुत संस्कृति तकनीक दो सप्ताह की अवधि के लिए प्रति दिन लगभग 1000 iTE प्रति थाइमिक पालि उत्पन्न करता है. बढ़ी हुई iTE पीढ़ी आगे संशोधनों के साथ संभव हो सकता है, ऑक्सीजन एकाग्रता के अनुकूलन सहित, मीडिया की मात्रा, और 3 डी संस्कृति प्लेट के प्रकार. इसके अलावा या cytokines को हटाने, साथ ही cytokine एकाग्रता में परिवर्तन, भी सुधार iTE उपज में योगदान कर सकते हैं.
यह देखते हुए कि 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली यहाँ प्रस्तुत एक पूरी तरह से पूर्व vivo प्रणाली में थाइमिक उत्प्रवासियों उत्पन्न कर सकते हैं, इस तकनीक सहित प्रतिरक्षा और दत्तक सेल हस्तांतरण अनुसंधान परियोजनाओं की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन टी तक ही सीमित नहीं कोशिका विभेदन, पश्च-थाइमिक टी कोशिका परिपक्वता, और हेमेटोपोएटिक संतति या स्टेम कोशिकाओं से प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का उत्पादन। हालांकि इस विधि सीधे मानव नमूनों के लिए लागू नहीं है, आईटीई और 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली सकारात्मक और नकारात्मक चयन के आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए महान क्षमता पकड़ और एक संस्कृति प्रणाली है कि सक्षम बनाता है के निर्माण की सुविधा हो सकती है अधिनियम के लिए नैदानिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट भोले-जैसे टी कोशिकाओं की पीढ़ी।
Disclosures
लेखक राउल Vizcardo, निकोलस डी Klemen, और निकोलस पी Restifo लंबित अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन PCT/US2017/65986, दायर 13 दिसंबर, 2017, हकदार "Thymic उत्प्रवासी कोशिकाओं की एक अलग या शुद्ध आबादी की तैयारी के तरीकों पर आविष्कारक हैं और उपचार के तरीके एक ही का उपयोग कर।
Acknowledgments
हम कृपया OP9/DLL1 सेल लाइन प्रदान करने के लिए हिरोशी Kawamoto और Kyoko Masuda धन्यवाद. हम एलन बी Hoofring और Erina ] धन्यवाद. वह आलेखी सहायता के लिए। इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (ज़िया BC010763) और एनसीआई, NIH में सेल आधारित थेरेपी के लिए केंद्र के लिए कैंसर Moonshot कार्यक्रम. काम भी Milstein परिवार फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100 μm | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40 μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
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