Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.
La herencia de los receptores de linfocitos T pre-reorganizados (TPR) y su rejuvenecimiento epigenético hacen que las células T derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) sean una fuente prometedora para la terapia adoptiva de células T (ACT). Sin embargo, los métodos in vitro clásicos para producir células T regeneradas a partir de iPSC dan como resultado células T innatas o diferenciadas terminalmente, que son fenotípicamente y funcionalmente distintas de las células T ingenuas. Recientemente, se desarrolló un nuevo sistema de cultivo trímico tridimensional (3D) para generar un subconjunto homogéneo de células T específicas del antígeno CD8+ con un fenotipo funcional similar a la célula T ingenuo, incluyendo la capacidad de proliferación, formación de la memoria , y la supresión tumoral in vivo. Este protocolo evita los aberrantes destinos de desarrollo, permitiendo la generación de células T derivadas del iPSC clínicamente relevantes, designadas como emigrantes timicos derivados de iPSC (iTE), al tiempo que proporciona una potente herramienta para dilucidar las funciones posteriores necesarias para la maduración de células T después de la selección timica.
La terapia adoptiva de células T (ACT) puede ser un tratamiento eficaz para algunos pacientes con cáncer avanzado. Desafortunadamente, muchos pacientes no experimentan regresión tumoral, y las células transferidas no persisten después de la perfusión. Esto puede deberse a la calidad de las células T infundidas. Un modelo de ratón ACT mostró que en comparación con las células T de memoria central ingenuas o menos diferenciadas, las células efectoras diferenciadas terminalmente son menos potentes debido a la persistencia in vivo deficiente1, una observación también apoyada por datos clínicos2, 3.
En un esfuerzo por mejorar la eficacia de la ACT actual, las células madre pluripotentes inducidas por células T (T-iPSC) se han estudiado extensamente4,5. Cuando las células T se reprograman en T-iPSC y se vuelven a diferenciar en células T, la configuración reorganizada de los genes TCR es heredada por T-iPSC, y posteriormente las células T rediferenciadas. Por lo tanto, la capacidad de T-iPSC para someterse a una expansión in vitro ilimitada permite la reproducción eficiente de células T inmaduras que transportan los receptores de linfocitos T específicos de neoantígenos (TCR) cuando dichas células están diseñadas a partir de células T específicas de antígeno tumor6 ,7. Sin embargo, el método preciso para la diferenciación de T-iPSC en células T maduras, lo que permitiría la producción de células T específicas del antígeno canceroso con un fenotipo menos diferenciado y una mejor potencia antitumoral, sigue siendo aclarado.
La diferenciación T-iPSC que emplea el cocultivo de células estromales de OP9 que sobreexpresan el ligando de muesca humano DLL1 es un método bien establecido para producir células T in vitro6,7. En ratones y humanos, este sistema de cocultivo puede diferenciar consistentemente iPSC, recapitulando así los eventos de desarrollo desde la etapa del blastocisto hasta la etapa de linaje inmaduro de células T6,7. A pesar de estos avances biotecnológicos, la diferenciación fisiológica después de la etapa CD4+CD8+ doble positivo (DP) sigue siendo difícil de lograr. Una de las razones es que in vivo CD4+CD8– y CD4–CD8+ células T únicas positivas (SP) se generan en el timo, un órgano responsable de la maduración y selección de células T que tienen especificidad antógeno extraño pero no la reactividad automática8. Estos procesos selectivos se definen como selección positiva y negativa, respectivamente. Sin embargo, la mayoría de los mecanismos moleculares necesarios para madurar las células T en el timo todavía no se entienden completamente, lo que dificulta la reconstrucción de este proceso in vitro. En un intento de superar este obstáculo fisiológico, varios grupos han estimulado el complejo TCR utilizando anticuerpos anti-CD3 o péptidos agonistas. Estas técnicas in vitro generan productos celulares que expresan marcadores clave de células T, como CD3, CD8, TTC y CD62L, sin dejar de conservar la especificidad del antígeno tumoral. Desafortunadamente, las células T generadas por estos métodos extraitmicos constituyen una amplia población heterogénea de células caracterizada por una selección positiva incompleta, características innatas, matanza no específica de TCR, incapacidad para la formación de la memoria y efectos antitumorales no persistentes in vivo8,9,10,11. Estas anomalías han suscitado preocupaciones de que estas células puedan desencadenar una variedad de efectos secundarios, incluyendo linfoma y anormalidades cutáneas y óseas, si se utilizan para aplicaciones terapéuticas12,13,14 .
Para recrear las señales fisiológicas que faltan en los sistemas actuales de diferenciación in vitro, se diferenciaron T-iPSC específicos del antígeno tumoral utilizando un timo cosechado. El sistema clásico de cultivo de órganos de timo fetal (FTOC), que fue diseñado para estudiar el desarrollo intra-timico de las células T, se mejoró mediante el uso de un sistema de cultivo 3D que produjo con éxito células T que completaron la educación timica. Estas células T post-tímicas, que fueron designadas como emigrantes timicos derivados de iPSC (iTE), exhibieron propiedades ingenuas15. iTE mostró proliferación, formación de la memoria, y efectos antitumorales adecuados en un modelo de ratón contra tumores de melanoma B16 establecidos. Este artículo describe en detalle el protocolo de este nuevo sistema FTOC utilizando un sistema de cultivo 3D (Figura 1).
El uso de T-iPSC para regenerar células T específicas del antígeno tumoral puede superar muchos de los obstáculos actuales de ACT mediante la generación de células jóvenes con una mejor persistencia. Aunque se han notificado varios métodos que utilizan el sistema de cocultivo OP9/DLL1 para generar células CD8 SP6,7,10,13 que expresan moléculas cd8 y TPR específicos de antígeno tumoral, gen global los patrones de expresión y el análisis funcional muestran que estas células CD8 SP regeneradas extraimiánicamente son diferentes de las células T ingenuas (Figura4). Aquí, describimos un sistema de cultivo timico 3D que puede generar emigrantes timicos derivados de iPSC (iTE) con alta fidelidad y homogeneidad de la murino T-iPSC. iTE se asemeja a células T ingenuas en el patrón global de expresión génica y en la funcionalidad, como la formación de la memoria y el efecto antitumoral in vivo contra el tumor establecido15.
El sistema CTOC clásico es una forma de recapitular la selección timmica invitro. Se ha utilizado para el estudio del desarrollo intra-timico de timiocitos23,y hay algunos informes de FTOC que se utiliza para generar RTE24. Sin embargo, el sistema FTOC tiene varias limitaciones. Para hacer frente a la falta de oxígeno en un cultivo de órganos artificiales, varios grupos han utilizado un cultivo basado en membrana semi-seca23,o sistemas de cultivo de inmersión de alto oxígeno25. Sin embargo, ningún método actual puede generar constantemente una población homogénea de células T post-timicas. Para superar las limitaciones del sistema Clásico FTOC, diseñamos un sistema de cultivo timico 3D que proporciona mejoras técnicas sobre los métodos convencionales15. Por ejemplo, utilizando nuestro método de cultivo timático 3D, el intercambio máximo de oxígeno y la ausencia de estrés mecánico del lóbulo superficial mantienen los lóbulos timáticos en un entorno más fisiológico. Además, el cultivo a largo plazo permite que las células T maduras saquen naturalmente de los lóbulos timáticos. Por último, la observación en tiempo real y la micromanipulación permiten el intercambio de medios y una colección constante de iTE sin alterar físicamente los lóbulos timicos. Por lo tanto, el método de cultivo timático 3D proporciona mejoras técnicas significativas, así como una vía para estudiar células T naé seleccionadas con timmática que no estaban disponibles anteriormente.
Hay varios puntos clave para la exitosa generación de iTE utilizando este sistema de cultivo timico 3D. La calidad del FBS y las condiciones de cultivo es fundamental para mantener la expansión de las células OP9/DLL1 sin perder su capacidad de admitir la diferenciación iPSC. Por lo tanto, recomendamos la preevaluación del lote FBS, así como el paso constante en 80% de confluencia para evitar la diferenciación celular y la senescencia. Además, se requiere un cultivo OP9/DLL1 confluente para la diferenciación in vitro de iPSC en células T inmaduras, ya que las diferencias en la confluencia pueden afectar su eficiencia. Por último, la era embrionaria de los lóbulos timicos es crucial para la generación de iTE. Recomendamos el uso de los lóbulos timicos E14.5 – 15.5.
Al igual que con cualquier nuevo protocolo, este método tiene limitaciones y está sujeto a mejoras. La técnica de cultivo presentada aquí genera aproximadamente 1000 iTE por lóbulo timico por día durante un período de dos semanas. El aumento de la generación de iTE puede ser posible con más modificaciones, incluyendo la optimización de la concentración de oxígeno, el volumen de medios y el tipo de placa de cultivo 3D. La adición o eliminación de citoquinas, así como los cambios en la concentración de citoquinas, también pueden contribuir a mejorar el rendimiento de iTE.
Dado que el sistema de cultivo timico 3D presentado aquí puede generar emigrantes timicos en un sistema completamente ex vivo, esta técnica se puede aplicar a una variedad de proyectos de investigación de transferencia celular inmunológica y adoptiva, incluyendo, pero no limitado a T diferenciación celular, maduración de células T post-timicas y generación de células T específicas de antígenos a partir de progenitores hematopoyéticos o células madre. Aunque este método no es directamente aplicable a las muestras humanas, iTE y el sistema de cultivo timico 3D tienen un gran potencial para esclarecer los mecanismos moleculares de selección positiva y negativa y pueden facilitar la creación de un sistema de cultivo que permita la generación de células T ingenuas específicas del antígeno tumoral clínicamente relevantes para ACT.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Hiroshi Kawamoto y Kyoko Masuda por proporcionar amablemente la línea celular OP9/DLL1. Agradecemos a Alan B. Hoofring y Erina Z. El para la asistencia gráfica. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos (ZIA BC010763) y el programa Cancer Moonshot para el Centro de Terapia Basada en Células en el NCI, NIH. El trabajo también fue apoyado por la Milstein Family Foundation.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
FBS | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
MEM powder | Gibco | 61100061 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Cell Culture Vessels and others | |||
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
Experimental Cell lines | |||
CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Experimental mouse models | |||
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
Antibodies | |||
Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |