Summary
Denna artikel beskriver en ny metod för att generera tumörantigen-specifika inducerad pluripotenta stamcells-härledda thymic emigranter (iTE) av en tredimensionell (3D) thymic kultur system. iTE är en homogen delmängd av T-celler nära besläktade med naiva T-celler med kapacitet för spridning, minnesbildning, och tumör dämpning.
Abstract
Arvet från pre-omarrangerade T cellreceptorer (TCRs) och deras epigenetiska föryngring göra inducerad pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda T-celler en lovande källa för adoptiv T cellterapi (ACT). Emellertid, klassiska in vitro-metoder för att producera regenererad t-celler från IPSC resultera i antingen innate-liknande eller obotligt differentierade t-celler, som är fenotypiskt och funktionellt skiljer sig från naiva t-celler. Nyligen, en roman tredimensionell (3D) thymic kultur system utvecklades för att generera en homogen delmängd av CD8αβ+ antigen-specifika T-celler med en naiv t cell-liknande funktionell fenotyp, inklusive kapacitet för spridning, minnesbildning , och tumörsuppression in vivo. Detta protokoll undviker avvikande utvecklings öden, vilket möjliggör generering av kliniskt relevanta iPSC-härledda T-celler, betecknade som iPSC-härledda thymic emigranter (iTE), samtidigt som det ger ett kraftfullt verktyg för att belysa de efterföljande funktioner som krävs för T cells mognad efter thymic Selection.
Introduction
Adoptiv T cellterapi (ACT) kan vara en effektiv behandling för vissa patienter med avancerad cancer. Tyvärr, många patienter upplever inte tumörregression, och överförda celler inte kvarstår efter infusion. Detta kan bero på kvaliteten på de infunderade T-cellerna. En ACT musmodell visade att jämfört med naiva eller mindre differentierade centralminne T-celler, terminellt differentierade effektorceller är mindre potent på grund av dålig in vivo beständighet1, en observation också stöds av kliniska data2, 3.
I ett försök att förbättra effekten av nuvarande Act, t-cell-härledda inducerade pluripotenta stamceller (t-IPSC) har studerats utförligt4,5. När T-celler omprogrammeras till T-iPSC och omdifferentieras till T-celler, ärvs den omarrangerade konfigurationen av TCR-gener av T-iPSC, och därefter de re-differentierade T-cellerna. Därför, kapaciteten hos T-iPSC att genomgå obegränsad in vitro-expansion tillåter effektiv reproduktion av omogna T-celler som transporterar neoantigen-specifika T cellreceptorer (TCR) när sådana celler är konstruerade från tumörantigen-specifika T-celler6 ,7. Emellertid, den exakta metoden för differentiering av T-iPSC i mogna T-celler, vilket skulle tillåta produktion av cancer antigen-specifika T-celler med en mindre differentierad fenotyp och bättre anti-tumör potens, återstår att belysa.
T-IPSC differentiering sysselsätter Co-kulturen i OP9 murina stromaceller över-uttrycker mänskliga notch ligand DLL1 är en väl etablerad metod för att producera T-celler in vitro-6,7. Hos möss och människor kan detta medkultursystem konsekvent differentiera IPSC och därmed sammanfatta utvecklings händelser från blastocyststadiet till den omogna T-cellen Lineage Stage6,7. Trots dessa bioteknologiska framsteg, den fysiologiska differentieringen efter CD4+CD8+ dubbel positiva (DP) skede är fortfarande svårt att uppnå. En av anledningarna är att in vivo CD4+CD8-och CD4-CD8+ enda positiva (SP) T- celler genereras i brässen, ett organ som ansvarar för mognad och urval av T-celler som har utländsk antigen-specificitet men inte automatisk reaktivitet8. Dessa selektiva processer definieras som positiva respektive negativa val. Emellertid, de flesta av de molekylära mekanismer som krävs för att mogna T-celler i brässen är fortfarande inte helt klarlagda, vilket gör det svårt att rekonstruera denna process in vitro-. I ett försök att övervinna detta fysiologiska hinder, flera grupper har stimulerat TCR komplexet med anti-CD3 antikroppar eller agonist peptider. Dessa in vitro-tekniker generera cellprodukter som uttrycker nyckel T cell markörer, som CD3, CD8αβ, TCRαβ, och CD62L, samtidigt behålla tumörantigen-specificitet. Tyvärr, T-celler som genereras av dessa extrathymic metoder utgör en bred heterogen population av celler som kännetecknas av ofullständig positivt urval, medfödda-liknande funktioner, TCR icke-specifik avlivning, oförmåga för minnesbildning, och icke-ihållande anti-tumöreffekter in vivo8,9,10,11. Dessa avvikelser har väckt farhågor om att sådana celler kan utlösa en mängd biverkningar, inklusive lymfom och både hud och ben avvikelser, om de används för terapeutiska tillämpningar12,13,14 .
För att återskapa fysiologiska signaler saknas i nuvarande in vitro differentiering system, var tumörantigen-specifika T-iPSC differentierade med hjälp av en skördad Thymus. Den klassiska fostrets tymus orgel kultur (ftoc) system, som utformades för att studera intra-thymic utveckling av t-celler, förbättrades med hjälp av en 3D-kultur system som framgångsrikt producerade t-celler som genomgått thymic utbildning. Dessa post-thymic T celler, som utsågs till iPSC-derived thymic emigranter (iTE), uppvisade naiva-liknande egenskaper15. iTE visade proliferation, minnesbildning, och adekvat anti-tumör effekter i en musmodell mot etablerade B16 melanomtumörer. Denna artikel beskriver i detalj protokollet av denna roman FTOC system med hjälp av en 3D-kultur system (figur 1).
Protocol
Alla djurförsök godkändes av National Cancer Institute (NCI) och utfördes i enlighet med NIH riktlinjer.
1. beredning av OP9/DLL1 celler för Medkultur med iPSC
- Kultur OP9/DLL1 celler i OP9 media (α-minsta essentiella medium [α-MEM] + 20% icke-värmeinaktiverat fetalt bovint serum [FBS] + 1x penicillin-streptomycin + askorbinsyra [50 ng/mL] och mono-tioglycerol [100 nM]) vid 37 ° c. När OP9/DLL1 celler når 80 – 95% confluency, tvätta en gång med 1x magnesium, kalcium, och fenol röd fri fosfatbuffrad saltlösning (hädanefter kallad PBS).
- Tillsätt 4 mL 0,05% trypsin och inkubera i 5 min vid 37 ° c. Tillsätt sedan 4 mL OP9 media, separera cell skiktet genom att Pipettera för att göra en enda cellsuspension.
- Överför cellsuspensionen till ett 50 mL koniskt rör genom en cell SIL med 100 μm. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c, aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 12 mL OP9-media.
- Platta 2 mL OP9/DLL1 cellsuspension på en ny 10 cm cell-kultur petriskål och tillsätt ytterligare 8 mL OP9 media. Upprepa passagen var 2 – 3 dagar.
Anmärkning: Kvaliteten på FBS och kultur villkor är avgörande för att bibehålla utbyggnaden av OP9/DLL1 celler utan att förlora sin förmåga att stödja iPSC differentiering. Därför, det rekommenderas att pre-utvärdera mycket FBS och passage konsekvent på 80% confluency för att förhindra celldifferentiering och senescence. Det är också viktigt att göra tillräckligt fryst lager av OP9/DLL1 celler och Tina ett nytt lager var 4 – 6 veckor.
2. in vitro-differentiering av iPSC till omogna T-celler
-
På dag 0, börja IPSC Co-Culture på OP9/DLL1 konfluenta rätter.
- Harvest iPSC som en enda cellsuspension av trypsinization (5 min i 0,05% trypsin vid 37 ° c), samla in cellerna, och centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna vid 1,0 x 105 IPSC per 10 ml OP9 media. Platta 1,0 x 105 IPSC på en konfluenta OP9/DLL1 10 cm skålen.
Anmärkning: OP9/DLL1 10 cm rätter används för iPSC differentiering när de når 90-100% confluency. Skillnader i confluency kan påverka effektiviteten av iPSC differentiering.
- På dag 3, aspirera gamla medier och Ersätt med 10 mL färskt OP9 media.
-
På dag 6, passage celler.
- Tvätta varje 10 cm konfluenta OP9 Dish med 10 ml PBS. Tillsätt 3 mL 0,05% trypsin per fat och inkubera i 3 – 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 4 mL OP9-media och samla in celler genom skonsam pipettering. Passera celler genom en 100 μm cell sil och centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera celler i 10 ml differentiering media (OP9 media med 5 ng/ml mus FLT3 ligand [FLT3L] och 5 ng/ml mus Il-7) och platta cellsuspension på en ny 10 cm OP9/DLL1 konfluenta skålen.
- På dag 9, aspirera gamla medier och ersätta med 10 mL av färska differentiering media.
-
På dag 11 när kardiomyocyter observeras i iPSC kolonier, mekaniskt lossa icke-adherenta celler genom pipettering och filtrera genom en 100 μm cell SIL. Snurra på 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 24 mL differentieringsmedia. Plattan IPSC i en konfluenta OP9/DLL1 6-brunn tallrik (4 ml/brunn).
-
På dag 15, samla alla icke-adherent celler och filtrera genom en 40 μm cell SIL.
- Snurra på 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Fortsätt att föra över icke-adherenta celler var 3 – 4 dagar genom att upprepa steg 2.5.1.
3.3D thymic orgel kultur för att generera iTE
- Harvest Mouse fetala thymic lober och distribuera endogena lymfocyter av deoxyguanosin (dGUO) behandling som tidigare beskrivits16.
- På dag 7 av dGUO behandling, ta fyra nya 10 cm rätter och fyll varje med 20 mL komplett media (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamin + 1x natrium pyruvat + 1x minimum viktigt medium med icke-essentiella aminosyror (MEM-NEAA) + 1x penicillin-streptomycin + [1:1000] 2-mercapto etanol).
- Överför alla nitrocellulosa membran med thymic loberna till 1 10 cm skålen. Lossa de enskilda loberna från membranet med pinps, så att de kan vara nedsänkt i media. Kassera membranen. Inkubera i 1 h vid RT.
- Överför den thymic loberna till en ny 10 cm skålen med kompletta medier och inkubera för 1 h vid RT. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Med hjälp av tång, fixa thymic loberna till skålen (en i taget), och med den andra handen gör en 100-200 μm djupt snitt i mitten och utvidga halva diametern på LOB för att underlätta T cell progenitorceller migration till LOB.
- Överför thymic loberna till en ny 10 cm skålen fylld med fullständig differentiering media (komplett Media + 5 ng/mL mus IL-7 + 5 ng/mL mus FLT3L + 5 ng/mL SCF).
- Alternativt, om du använder 3D-kultur plattor med lägre och övre nivå galler, fylla båda galler med steril PBS för att förhindra avdunstning och torkning av hängande droppar.
- Överför 30 μl komplett mediainnehåll Ande en dguo-behandlad thymic LOB från steg 3,6 till varje brunn av 3D-kulturplatta.
- Samla icke-anhängare T Lineage celler (iPSC-derived omogna T-celler) från OP9/DLL1 Co-Culture (dagar 16-21) (steg 2.6.2) och Omsuspendera vid 2 – 5 x 103 T Lineage celler per 20 μl media.
- Tillsätt 20 μL T Lineage cellsuspension till varje thymic LOB i 3D-kulturen plattan. Inkubera över natten vid 37 ° c med 5% CO2.
- Ställ den P200 Pipettera till 30 μL och aspirera media efter Pipettera flera gånger från varje brunn för att ta bort alla celler som omger thymic loberna. Kassera media och tillsätt 30 μL komplett material. Upprepa denna procedur 5 – 7 gånger för att ta bort eventuella extra omogen T-celler som inte migrerar till loberna. Ändra 25 – 30 μL Media dagligen därefter.
- Bekräfta bildandet av en Gloria av iPSC-härledda thymic emigranter (iTE) runt loberna börjar på dag 4-5 av ljusmikroskop.
- Samla in iTE dagligen genom att Pipettera media utan LOB störningar. Byt Media varje dag och fortsätt samlingen upp till cirka 12 dagar.
- Skördade iTE är redo att användas för molekylära analyser (figur 2, figur 3, figur 4och figur 5) eller in vivo-transplantations experiment.
4. beredning av antigen presenterande celler (APC)
- Offra en C57BL/6 mus genom cervikal dislokation och placera på en Lab soaker matta som beskrivs ovan.
- Ta bort mjälten och placera den på en 100 μm cell SIL. Komprimera mjälten på SIL med en 12 mL spruta kolven för att göra en enda cellsuspension.
- Överför cellsuspensionen genom en steril 40 μm cell SIL. Centrifugera suspensionen vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c för att pelleten cellerna.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 2 mL ammoniumkloridklorid-kalium (ACK) lyseringsbuffert för att utesluta röda blodkroppar (RBC). Inkubera i 5 minuter vid RT.
- Släck ACK lyseringsbufferten genom att tillsätta 10 mL PBS. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 10 mL komplett media och överför till en 10 cm steril petriskål.
- Bestråla splenocyter med 3500 rad med hjälp av en bestrålnings apparat (γ-strålning) för att förhindra cellproliferation.
- Omedelbart returnera de bestrålade cellerna till en 37 ° c inkubator och kultur över natten.
- Använd bestrålade celler som APC eller Freeze i cellbanker.
5. Pulsing APC med antigen
- Räkna levande bestrålade APC med hjälp av en Neubauer hemocytometern och trypan blå färgämne. Inkubera APC med peptider (hgp100) eller nukleoprotein i 30 min vid 37 ° c.
- Tvätta APC två gånger med 10 mL PBS för att avlägsna eventuell extra peptid.
- Räkna iTE och blanda med APC i en 1:1 förhållande i komplett media med 100 IE IL-2 och 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL av blandningen av celler (total koncentration: 1 x 106 celler/ml) i varje brunn av en ultra-låg bilaga U botten 96 väl tallrik och kultur för 48 h vid 37 ° c.
- Efter 48 h, överför celler till en ny platta med hjälp av en multikanalpipett och passage varje 2 – 3 dagar därefter.
-
På dag 3, analysera cytokin sekretion profil genom färgning cellerna med intracellulär antikropp och analysera genom flödescytometri (figur 3).
- Tillsätt 0,67 μL/mL proteintransport hämmare (t. ex. GolgiStop) och inkubera vid 37 ° c i 6 timmar för att öka den intracellulära ackumulationen av cytokiner. Tvätta med 10 mL PBS.
- Omsuspendera cellerna i 3 mL kall (4 ° c) PBS och tillsätt långsamt 1 mL kall 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning.
- Efter 10 min, snurra ner cellerna vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten och tvätta med 10 ml PBS.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL PBS + 1% FBS + 0,1% nonioniskt ytaktivt ämne och placera i 4 ° c i 10 – 15 min.
- Tillsätt antikroppar, skydda proverna från ljus och placera i 4 ° c i 30 min.
- Snurra ner cellerna vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten och tvätta med 10 ml PBS.
- Snurra ner cellerna vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c och Omsuspendera cellerna i 1 ml PBS. Celler är redo att analyseras i en flödescytometer.
Representative Results
Co-odlade fetala thymuses var sektioneras för att analysera om iPSC-derived T härstamning celler kan migrera till thymic loberna. Unseeded Control lober hade en vävnad arkitektur som kännetecknas av en astrocyt-liknande thymic epitelial Web17, utplacerade av endogena CD3+ celler. Å andra sidan, thymic lober seedade med IPSC-härledda omogna t celler återbefolkades med CD3+ mononukleära celler, vilket indikerar migration av IPSC-härledda omogna t-celler i loberna (figur 2a).
T-celler som migrerats till och mognat inom thymic mikromiljön därefter egressed som iTE. För att testa sin fenotypiska karakterisering, flödescytometrisk analys av C57BL6 tymocyter, PMEL IPSC-derived omogen T celler (extrathymic), och celler som egressed från thymic lober (iTE) utfördes. Extrathymic T-celler på OP9/DLL1 visade CD4+CD8+ (DP) t-celler och CD8αSP t-celler utan uttryck av den positiva markeringen markör MHC-i, medan iTE hade en klar population av CD8αSP MHC-i+ T-cell fenotyp, vilket indikerar deras lyckad passage genom positivt urval innan egressing från thymic lobes. iTE konsekvent uttrycka MHC-I och CD62L, som är markörer i samband med hög proliferativ kompetens, cytokin produktion, perifer överlevnad, och lymfoida homing18,19,20. Denna fenotyp är förenlig med m2 SP tymocyter som är den mest mogna populationen av enstaka positiva T-celler i tymus20, vilket tyder på att iTE har övergått genom ett normalt thymic utvecklingsprogram (figur 3). För att övervaka effektiviteten i iTE generation, celler som hade egressed från enskilda thymic lober isolerades. Dag 7 genererade thymic lober i genomsnitt 1 x 103 Live CD8SP CD 45,1+ CD3+ iTE per dag (figur 3B). En liknande hastighet av iTE produktion observeras från dag 6 till dag 12 av 3D thymic Co-Culture.
Antigen-beroende aktivering och utsöndring av cytokiner analyserades för att iaktta de funktionella egenskaperna hos thymically utbildade iPSC-härledda omogna T-celler. I närvaro av en irrelevant peptid (nukleoprotein), PMEL-iTE frigjorde inte betydande mängder av TNF-α, IL-2, eller IFN-γ. När PMEL-ITE stimulerades med den besläktat peptiden för PMEL T-celler (hgp100), släppte de robusta mängderna TNF-α och Il-2, samtidigt som de producerar låga halter av IFN-γ (figur 4), vilket indikerar att thymically utbildad iTE kan känna igen sin besläktat utsöndrar effektor cytokiner med en profil som liknar den naturliga nyligen thymic emigranter (RTE).
För att undersöka transkriptionella skillnader mellan iPSC-härledda T härstamning celler differentierade på OP9/DLL1 med eller utan thymic utbildning (dvs. iTE kontra extrathymic t-celler), RNA-SEQ analys utfördes på dessa två populationer och jämfördes till det av DP T härstamning celler differentierade med OP9/DLL1 (DP) och primära naiva CD8+ PMEL T celler. Uttrycket av 102 gener som spelar avgörande roller i T-cell Ontogeni, thymocyte aktivering, och minnesbildning analyserades15,20,21,22. En huvudsaklig komponent analys av dessa fyra studerade populationer visade att extrathymically genererade DP och CD8SP T celler klustrade tillsammans, medan iTE klustrade närmare naiva T-celler (figur 5). Kollektivt, dessa data visar att iTE har en fenotyp närmare naiva T-celler än do T härstamning celler som genereras av extrathymic metoder.
Figur 1 : Schematisk översikt över differentieringen av iPSC till iTE med hjälp av OP9/DLL1 och 3D thymic kultur. Protokollet omfattar tre separata differentierings steg. (Vänster) från IPSC celler till hematopoietiska Lineage celler på OP9/DLL1 (dag 0 till 6), (mitten) från hematopoietiska Lineage celler att omogna t celler på OP9/DLL1 med cytokiner (dag 6 till 16 – 21), och (höger) från omogen t celler (dag 16 – 21) till med hjälp av en 3D-thymic kultur system. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Immuno-histochemistry av thymic lober seedade med iPSC-härledda omogna T-celler. Topp: H & E färgning av en thymic LOB med och utan sådd av iPSC-härledda omogna T-celler. Från andra topp till botten: konfokala bilder av sektionerade loberna färgade med DAPI (Nucleus), CD3 (T cell), och sammanfoga. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : iTE Visa en post-thymic T cell fenotyp. A) FACS-analyser av tymocyter, extrathymic T-celler (OP9/DLL1 Co-Culture system) och PMEL-iTE. Levande celler var gated på congenic CD45+. CD8 SP populationer analyserades ytterligare för CD62L och MHC-I uttryck. (B) Genomsnittligt antal CD8SP CD 45,1 iTE producerat över natten per LOB 7 dagar efter försådd. Data samlades in från 12 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : att producera olika cytokiner genom antigenspecifik stimulering. FACS analyser av intracellulär produktion av cytokiner genom iTE. iTE var Co-odlade med APCS förladdad med irrelevant (nukleoprotein) eller besläktat (hgp100) peptid i tre dagar. Siffrorna som visas i övre högra kvadranter indikerar andelen iTE producerar cytokin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Hel transkriptome analys avslöjar en förskjutning i iTE genuttryck mot en naiv CD8 + T-cellsprogram. Princip komponent analys (PCA) av RNA-SEQ data från DP, extrathymic CD8 SP, iTE, och naiva T-celler. (Analys av 102 gener relaterade till thymic differentiering med hjälp av Public Database GSE105110) 15. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Med hjälp av T-iPSC att förnya tumörantigen-specifika T-celler kan övervinna många av de nuvarande hindren för ACT genom att generera unga celler med förbättrad uthållighet. Även om flera metoder med hjälp av OP9/DLL1 Co-Culture systemet har rapporterats att generera CD8 SP celler6,7,10,13 att uttrycka CD8 molekyler och tumörantigen-specifika TCRs, global gen uttrycksmönster och funktionell analys visar att dessa extrathymically regenererade CD8 SP celler skiljer från naiva T-celler (figur 4). Här beskriver vi en 3D thymic kultur system som kan generera IPSC-derived thymic emigranter (iTE) med hög trohet och homogenitet från murina T-IPSC. iTE likna naiva T-celler i globala gen uttrycksmönster och i funktionalitet, såsom minnesbildning och in vivo anti-tumör effekt mot etablerad tumör15.
Den klassiska FTOC systemet är ett sätt att recapitulate thymic urval in vitro-. Det har använts för att studera intra-thymic utveckling av tymocyter23, och det finns några rapporter om ftoc används för att generera RTE24. FTOC-systemet har dock flera begränsningar. För att hantera bristen på syre i en konstgjord orgel kultur, flera grupper har använt antingen en semi-torr membran baserad kultur23, eller hög syre nedsänkning kultur system25. Emellertid, inga nuvarande metoder kan ständigt generera en homogen population av post-thymic T celler. För att övervinna begränsningarna i den klassiska FTOC systemet, designade vi en 3D thymic kultur system som ger tekniska förbättringar jämfört med konventionella metoder15. Till exempel, med hjälp av vår 3D thymic kultur metod, maximal syre utbyte och avsaknaden av ytlobe mekanisk stress hålla thymic loberna i en mer fysiologisk miljö. Dessutom, långsiktig kultur tillåter mogna T-celler att utgående naturligt från thymic loberna. Slutligen, realtid observation och mikro-manipulation möjliggöra Media utbyte och en ständig samling av iTE utan att fysiskt störa thymic loberna. Sålunda, den 3D thymic kultur metod skaffar betydande teknisk förbättringarna likaledes så en aveny till studera thymically valde naiva T-cellerna så pass var inte tidigare tillgänglig.
Det finns flera viktiga punkter för den framgångsrika generationen av iTE använder denna 3D thymic kultur system. Kvaliteten på FBS och kultur villkor är avgörande för att bibehålla utbyggnaden av OP9/DLL1 celler utan att förlora sin förmåga att stödja iPSC differentiering. Därför rekommenderar vi förhandsutvärdering av FBS Lot samt genomgående passaging på 80% confluency för att förhindra celldifferentiering och senescence. Dessutom krävs en konfluenta OP9/DLL1 kultur för in vitro differentiering av IPSC i omogna T-celler, eftersom skillnader i sammanflödet kan påverka deras effektivitet. Slutligen är den embryonala åldern av thymic lober avgörande för generering av iTE. Vi rekommenderar att du använder E 14.5-15,5 thymic lobes.
Som med alla nya protokoll, denna metod har begränsningar och är föremål för förbättringar. Den kultur teknik som presenteras här genererar cirka 1000 iTE per thymic LOB per dag under en period av två veckor. Ökad iTE generation kan vara möjligt med ytterligare ändringar, inklusive optimering av syrekoncentration, media volym, och typ av 3D-kultur plattan. Tillägg eller avlägsnande av cytokiner, liksom förändringar i cytokin koncentration, kan också bidra till förbättrad iTE avkastning.
Med tanke på att 3D thymic kultur system som presenteras här kan generera thymic emigranter i ett helt ex vivo -system, denna teknik kan tillämpas på en mängd olika immunologiska och adoptiv cell överföring forskningsprojekt inklusive, men inte begränsat till T celldifferentiering, efter thymic T cell mognad, och generering av antigen-specifika T-celler från hematopoietiska stamceller. Även om denna metod inte är direkt tillämplig på mänskliga prover, iTE och 3D thymic kultur systemet har stor potential för att belysa de molekylära mekanismerna för positivt och negativt urval och kan underlätta skapandet av ett kultur system som gör det möjligt generering av kliniskt relevanta tumörantigen-specifika naiva-liknande T-celler för ACT.
Disclosures
Författarna Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen, och Nicholas P. Restifo är uppfinnare på avvaktan internationella patentansökan PCT/US2017/65986, arkiverat 13 december 2017, med rubriken "metoder för att förbereda en isolerad eller renad population av thymic emigrant celler och behandlingsmetoder med samma. "
Acknowledgments
Vi tackar Hiroshi Kawamoto och Kyoko Masuda för vänligt tillhandahållande av OP9/DLL1 cellinjer. Vi tackar Alan B. Hoofring och Erina Z. Han för grafisk hjälp. Denna forskning stöddes av intramural forskningsprogram av US National Cancer Institute (ZIA BC010763) och cancer Moonshot program för centrum för cell-baserad terapi vid NCI, NIH. Arbetet stöddes också av Milsteins familjestiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100 μm | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40 μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
References
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P.
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
- Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
- Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
- Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
- Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
- Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
- Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
- Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
- Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).
