RNA-baserte omprogrammering av menneskelig primære fibroblaster til indusert Pluripotent stamceller

Summary

Her beskriver vi en klinisk relevant, høy effektivitet, mater-fri metode for å omprogrammere menneskelig primære fibroblaster i indusert pluripotent stilk celler med endrede mRNAs koding omprogrammering faktorer og moden microRNA-367/302 etterligner. Også inkludert er metoder for å vurdere omprogrammering effektivitet, utvide klonal iPSC koloniene, og Bekreft uttrykk for pluripotency markøren TRA-1-60.

Abstract

Indusert pluripotent stamceller (iPSCs) har vist seg for å være et verdifullt verktøy å studere menneskelig utvikling og sykdom. Fremme fremmarsj iPSCs som en regenererende terapeutiske krever en sikker, robust, og nødvendig omprogrammering protokollen. Her presenterer vi en klinisk relevante, trinnvise protokoll for ekstremt høy effektivitet omprogrammering av menneskelig dermal fibroblaster til iPSCs med en ikke integrert tilnærming. Kjernen i protokollen består av å uttrykke pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) fra i vitro transkribert messenger RNAs syntetiserte med endret nukleotider (modifisert mRNAs). De reprogramming endret mRNAs er transfekterte i primære fibroblaster hver 48t sammen med eldre embryonale stamcelleforskningen-spesifikke microRNA-367/302 imiterer i to uker. De resulterende iPSC koloniene kan så isolert og direkte utvidet i arkmateren uten betingelser. For å maksimere effektivitet og konsistensen av våre reprogramming protokollen over fibroblast prøver, vi har optimalisert ulike parametere inkludert RNA transfection diett, timing av transfections og oppdrettsforholdene seeding tettheter. Viktigere, genererer våre metoden høy kvalitet iPSCs fleste fibroblast kilder, inkludert vanskelig-å-ha syke, alderen eller senescent.

Introduction

Omprogrammere somatiske celler til indusert pluripotent stamceller (iPSCs) krever utvidet uttrykk for et sett transkripsjonsfaktorer som er viktige i å opprettholde pluripotency^1,2. Produksjon iPSCs for klinisk bruk, er det viktig at mutational byrden på innsettingsceller er minimert under behandlingen og effektiviteten av iPSC generasjon er opprettholdt på et relativt høyt nivå over pasientprøvene. Men lider fleste omprogrammering metoder, inkludert integrasjon-fri protokoller, av svært lav omprogrammering effektivitet, som grense klinisk nytten av disse tilnærminger³. Lav reprogramming effektiviteten kan også fremme selektiv omprogrammere celler med eksisterende mutasjoner, øke mutational byrden i resulterende iPSCs. I tillegg lider alle DNA-baserte reprogramming metoder, for eksempel lentivirus og episomal-baserte tilnærminger, sikkerhet bekymring at DNA tilfeldig kan integrere i genomet og opprette muligheten for skadelig insertional mutagenese og uønsket ( potensielt kreftfremkallende) uttrykk for pluripotency gener i nedstrøms vev derivater⁴.

En lovende tilnærming til å oppnå effektiv induksjon av pluripotency i somatiske celler og redusere mutational byrden i resulterende iPSCs er å bruke syntetisk avkortet messenger RNAs som inneholder modifisert nucleobases (modifisert mRNAs) omprogrammere⁵. Effektiviteten av endrede mRNA omprogrammering tilnærminger kan styrkes ytterligere ved å legge til embryonale stamcelleforskningen (ESC)-spesifikke microRNAs (miRNAs)-367/302s³, som har vist seg å omprogrammere somatiske celler med økt effektivitet^{6 ,7}. Men selv med tillegg av miRNAs-367/302s mislykkes den endrede mRNA reprogramming tilnærmingen ofte under søknad til fersk isolert pasienten celler³. Til adressen inkonsekvens i denne endrede mRNA tilnærming, har vi nylig rapportert en optimalisert, integrasjon-gratis strategi som induserer pluripotency i menneskelig primære fibroblaster med høy suksessrate og benytter begge endret mRNAs koding omprogrammere faktorer og modne miRNA-367/302 etterligner⁸. I vår metode inneholder den reprogramming endret mRNA cocktail en modifisert versjon av OCT4 smeltet sammen med MyoD transactivation domene (kalt M₃O)⁹ og fem andre reprogramming faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A og NANOG). Kombinere den endrede mRNA koding pluripotency faktorene med miRNA syntes imiterer å ha en synergistisk effekt på reprogramming effektivitet i denne protokollen. Ytterligere optimaliseringer av RNA transfection diett, celle såing, og dyrking forholdene var også nødvendig å øke omprogrammering effektiviteten av tilnærming til en svært høy level⁸.

I motsetning til mange andre protokoller krever vår reprogramming tilnærming vanligvis bare noen få tusen input fibroblaster. I tillegg innebære mange vanlige ikke-integrere strategies bruke episomal plasmider, Sendai virus eller selvreproduserende RNA omfattende passaging å fortynne reprogramming vektoren i genererte iPSCs. Derimot endret mRNA og modne miRNA imiterer har kort halveringstid og eliminert raskt fra celler. Samlet er kumulative celle kultur tiden mellom samle pasientprøvene og generering av brukbare iPSCs minimal i denne tilnærmingen, effektivt begrense mutasjon akkumulering i resulterende iPSCs og forbedre kostnadseffektivitet.

Her presenterer vi detaljerte trinnvise protokollen for å oppnå høy virkningsgrad omprogrammering av voksen menneskelig fibroblaster til iPSCs med våre kombinasjon endret mRNA/miRNA-basert tilnærming⁸. Denne RNA-baserte reprogramming protokollen gir en enkel, kostnadseffektiv og robust metode for å generere integrasjon-gratis iPSCs for forskning og potensial klinisk bruk. Videre er det gjelder omprogrammering av en rekke fibroblast linjer inkludert vanskelig-å-ha, sykdomsassosierte, alderen og senescent fibroblaster. En skjematisk av protokollen omprogrammere menneskelig fibroblaster er vist i figur 1. Protokollen beskriver spesielt en metode for å omprogrammere tre brønner av menneskelige voksne primære fibroblaster i en 6-og format-plate. To brønner gir vanligvis et tilstrekkelig antall høykvalitets iPSC kolonier. I mange tilfeller eneste er godt nødvendig, og tredje også kan brukes til analyse av omprogrammering effektivitet. Om nødvendig kan antall brønner besteget.

Protocol

Arbeid under RNase-gratis forhold og bruk steril teknikk når mulig. Utfør alle celle kultur-relaterte manipulasjoner i en biologiske sikkerhetskabinett kabinett med aseptiske teknikker. Følg institusjonelle biosikkerhet standarder for arbeidet med menneskelige celler.

1. reagenser og utstyr for utarbeidelse av omprogrammering innvielse

1. Forberede endret mRNA cocktail koding reprogramming faktorene.
   1. Følg de tidligere publiserte protokollen¹⁰ å utføre i vitro transkripsjon, capping, og dephosphorylation prosedyrer for hver endret mRNA koding individuelle omprogrammering faktor. Etter siste rensing trinn, elute den endrede mRNA med nuclease-fritt vann, supplere renset endret mRNA løsningen med 1 U/µL RNase hemmer, quantitate den endrede mRNAs bruker et spektrofotometer og lagre-80 ° c for inntil 6 måneder. Forberede Quidel av hver endret mRNA å fryse-Tin sykluser.
      Merk: Lignende protokoller for endret mRNA produksjon har vært rapportert andre steder^5,8,11. Maler for i vitro transkripsjon kan genereres ved PCR forsterkning fra tilsvarende plasmider maler bruker primere oppført i Tabell av materialer i henhold til de tidligere publiserte protokollen¹⁰. Plasmider maler for hver reprogramming faktor (M₃O⁹, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) og mWasabi (kontroll for transfection) er tilgjengelig fra Addgene, en non-profit plasmider oppbevaringssted.
   2. Bland sammen alle de endrede mRNAs i molar forholdet 3:1:1:1:1:1 (M₃O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) og inkluderer 10% mWasabi endret mRNA som en kontroll for transfection effektiviteten. Justere konsentrasjonen av den fullstendig modifiserte mRNA omprogrammering blanding til en siste konsentrasjon av 100 ng/µL ved å legge nuclease-fritt vann med 1 U/µL RNase hemmer. Forberede syv 33 µL dele hele endret mRNA cocktail. Lagre de blandede reprogramming dele på-80 ° C.
      Merk: For hver transfection, 1000 ng av endrede mRNA cocktail legges per brønn (dvs. totalt 3000 ng 3 brønner). Hver 33 µL aliquot er skalert slik transfect 3 brønner av en 6-vel format plate og inkluderer 3 µL av overflødig konto for pipettering feil. Forbereder syv 33 µL dele er tilstrekkelig til å fullføre en full fibroblast omprogrammering 3 brønner i en 6-og format-plate.
2. Forberede cocktail med reprogramming miRNA imiterer.
   1. Oppløse lyofiliserte miRNA forfalsker (Syn-har-miR-302a - 3p, Syn-har-miR-302b - 3p, Syn-har-miR - 302c - 3p, Syn-har-miR-302d-3 p, Syn-har-miR-367-3 p) til en 5 pmol/µL (5 µM) siste konsentrasjon i nuclease-fritt vann med 1 U/µL av RNase hemmer. Forberede Quidel av hver miRNA etterligne og lagre-80 ° c for langtidslagring.
   2. Bland alle miRNA imiterer i 1:1:1:1:1 molar forholdet til en siste konsentrasjon av 5 pmol/µL (5 µM). Forberede syv 14 µL dele miRNA etterligner blanding. Lagre de blandede dele på-80 ° C.
      Merk: For hver transfection, 20 pmol av miRNA imiterer blandingen er lagt per brønn (dvs. totalt 60 pmol 3 brønner). Hver 14 µL aliquot er skalert slik transfect 3 brønner av en 6-vel format plate og inkluderer 2 µL av overflødig konto for pipettering feil. Forbereder syv 14 µL dele er tilstrekkelig til å fullføre en full fibroblast omprogrammering 3 brønner i en 6-og format-plate.
3. Forberede transfection bufferen.
   1. Forvarm en 500 mL flaske og en 100 mL flaske med fersk redusert serum middels til romtemperatur (RT) for ca 2 timer. Ikke bruk et vannbad.
   2. Overføre en pH-meter til en biosafety kabinett. Vask meter glass elektrode med nuclease-fritt vann. Kalibrere pH-meter i henhold til produsentens instruksjoner. Vask elektroden igjen med nuclease-fritt vann.
   3. Overføre både flasker av redusert serum medium til biosikkerhet kabinett. Bruk 500 mL RT flasken for å justere pH.
   4. Måle base pH i redusert serum mediet ved å sette inn pH meter glass elektrode i bufferen. Vent til 1 min før du leser pH på meter.
   5. Legg 3-4 mL 1 M NaOH til 500 mL redusert serum medium, Lukk flasken og bland godt. Vent på opptil 5 minutter før åpne flasken for pH-måling. PH meter elektrode inn bufferen og vent til lesing på pH-meter stabiliserer.
   6. Fortsett å legge til små mengder 1 M NaOH til pH i redusert serum medium når 8.15-8.17. Kalibrere pH-meter flere ganger under prosessen. Hvis på noe tidspunkt pH blir høyere enn 8.18, redusere det ved å legge friske redusert serum medium fra forvarmes 100 mL flaske (trinn 1.3.1).
      Merk: pH i bufferen som redusert serum medium-baserte hva er avgjørende. Omprogrammere blir vellykket hvis pH i bufferen som hva er omtrent 8,2 ± 0,05, men kan mislykkes hvis pH er høyere enn 8,25. Derfor anbefales det å slutte å legge NaOH når den bufferens pH når 8.15-8.17. Dette vil sikre at siste pH i bufferen som hva er omtrent 8,2-8.22 etter sterilisering.
   7. Filteret sterilisere transfection bufferen med en 0.22 µm vakuum filtreringssystem. Aliquot sterilisert bufferen til 5 eller 15 mL rør med minimal luftrommet.
   8. Lagre dele transfection bufferen for inntil 3 måneder på 4 ° C. Måle pH i dele med jevne mellomrom. Kast dele Dersom pH er høyere enn 8,25. Begrense aliquot bruken til 2 transfections bare siden eksponering transfection bufferstørrelsen til atmosfærisk luft øker pH i bufferen.
4. Forberede fibroblast ekspansjon mediet (FEM): minimum viktig medium med 10% fosterets bovin serum (FBS), 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 1 x glutamin tilskudd, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 x penn/strep/fungizone. Lagre FEM på 4 ° C.
5. Forberede reprogramming mediet: DMEM/F12 (ingen HEPES) med 20% knockout serum erstatning (KOSR), 0,5 x ikke-essensielle aminosyrer, 0,5 x glutamin tilskudd, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg/mL askorbinsyre, 1 x penn/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF , og 200 ng/mL B18R. Forberede middels på initiering av omprogrammering uten bFGF og B18R, og lagre den på 4 ° C. Ikke bruk det utover 1 måneden etter forberedelse. Legge til bFGF og B18R rett før bruk i en aliquot til dagens bruk.
6. Klargjør plating medium ved å tilsette 5% inaktivert (HI) FBS til reprogramming medium som inneholder 20% KOSR uten bFGF og B18R fra trinn 1.5. Forberede middels frisk ved tilsiktet bruk. Legge til bFGF og B18R umiddelbart før bruk dag 0 med reprogramming.
7. Kalibrere vev kultur inkubatorer før du iverksetter omprogrammering i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av en håndholdt digital CO₂ analysator. Bruk en lav-O₂ inkubator reprogramming trinnene for å sikre vellykket iPSC generasjon.

2. dyrking fibroblaster omprogrammere

1. Forberede fibroblaster før oppstart av omprogrammering (dag -2).
   1. Lag en ny 10 cm vev kultur plate med 5 mL av 0,1%. Trykk eller snurr den for å sikre at hele overflaten er belagt. Inkuber i 15 min på 37 ° C. Sug opp gelatin og tilsett 10 mL av FEM. Sett til side. Tillat ikke belagt overflaten av platen tørke før du legger til FEM.
   2. Nøye Sug opp fibroblaster brukt mediet. Skyll cellene gang med 5 mL av DPBS å fjerne gjenværende serum. Legge 3 mL trypsin-EDTA. Forsiktig rock platen for å sikre fullstendig dekning over cellene.
   3. Sug opp overflødig væske, forlater ~ 500 µL av trypsin. Ikke over Sug opp, siden dette kan tørke og drepe fibroblaster. Inkuber fibroblaster med trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C.
   4. Fjern platen settefiskanlegg og fast, men forsiktig trykker på siden av tallerkenen å dislodge cellene. Merk celler under microscope. Hvis cellene er frittstående og flytende, Fortsett. Hvis cellene er fremdeles knyttet, ruge for en annen 3 min.
   5. Raskt skylling/samle frittliggende cellene bruke 5 mL av FEM for å nøytralisere trypsin-EDTA. Flytte fibroblast suspensjon i en 15 mL konisk rør. Kontroller at cellene er godt blandet.
   6. Bland forsiktig celle suspensjon å bryte store klumper av celler, så telle dem på en hemocytometer. Overføre 2.5 x 10⁵ celler til gelatin-belagt 10 cm parabolen utarbeidet i trinn 2.1.1. Inkuber cellene over natten i 37 ° C, 5% CO₂ fuktet vanlig vev kultur inkubator.
      Merk: Cellen tetthet er avgjørende for å oppnå høy omprogrammering effektivitet, som det er viktig at fibroblaster er sunn og raskt dele. Kontaktflate 2.5 x 10⁵ celler gir en 40-60% confluency 2 dager senere for de fleste fibroblast prøver. Justere tilsvarende for syke eller senescent celler oppnå ønsket 40-60% confluency 48 timer senere.
   7. Erstatt medium med 10 mL av fersk FEM neste dag (dag -1).
2. Plate fibroblaster for å starte omprogrammering (dag 0).
   1. Kontroller at fibroblaster må omprogrammeres på 40-60% confluency (figur 2, dagen 0). Hvis cellene er over- eller under confluent, passasje av fibroblaster som beskrevet i trinn 2.1 og justere plating tetthet tilsvarende. Kultur for en annen 2 dager.
   2. Overføre 4 mL av DPBS inn i et 15 mL konisk rør. Legg 100 µL av rekombinant humant (rh) laminin-521. Pipetter opp og ned for å bland godt.
   3. Legg 1 ml per brønn av fortynnet rhLaminin-521 i 3 brønner av en 6-vel plate. Inkuber belagt platen ved 37 ° C i 2 timer.
   4. Varme 6 mL av FEM og mL 4 plating middels til 37 ° C. Supplere plating mediet med bFGF til en siste konsentrasjon 100 ng/ml og B18R til en siste konsentrasjon av 200 ng/mL.
   5. Nøye Sug opp brukt mediet fibroblaster (trinn 2.2.1). Skyll cellene med 5 mL av DPBS og legge 3 mL trypsin-EDTA. Forsiktig rock platen for å dekke cellene med trypsin-EDTA.
   6. Sug opp overflødig væske, forlater ~ 500 µL av trypsin, som gjort i trinn 2.1.3. Inkuber fibroblaster med trypsin-EDTA i 3 minutter på 37 ° C. Fjern platen settefiskanlegg og fast, men forsiktig trykker på siden av tallerkenen å dislodge celler. Merk celler under microscope. Hvis cellene er frittstående og flytende, Fortsett. Hvis cellene er fremdeles knyttet, ruge for en annen 3 min.
   7. Skyll/samle frittliggende cellene bruke 5 mL av FEM for å nøytralisere trypsin-EDTA. Flytte fibroblast suspensjon i en 15 mL konisk rør. Kontroller at cellene er godt blandet og telle dem på en hemocytometer. Pipetter 12.000 celler i 4 mL prewarmed plating medium fra trinn 2.2.4.
      Merk: Ikke sentrifuge cellene når som helst. Antall belagt celler kan justeres opp eller ned som kreves for langsom - eller raskt voksende linjer, henholdsvis.
   8. Fjern belagt platen settefiskanlegg og Sug opp utvannet rhLaminin-521 fra belagt brønnene. Ikke la overflaten av tørke. Forsiktig resuspend celler i plating medium. Pipetter 1 mL av cellen suspensjon i hver belagt godt (dvs. 3000 celler per brønn).
   9. Plass belagt cellene i en tri-gass vev kultur inkubator med O₂ satt til 5% (lav-O₂). Når platen er satt, forsiktig men grundig spre celler av vekslende mellom en opp/ned og venstre/høyre bevegelse. Gjenta bevegelser 2 ganger. Inkuber cellene over natten. Ikke swirl plate å blande.
   10. Pipetter 4 mL omprogrammering middels slik 15 mL koniske og plasser den i lav-O₂ inkubator med en løsnet cap til equilibrate over natten. Ikke Legg bFGF og B18R til det fulgte dag.

3. initiering av Reprogramming (dag 1)

Merk: Når den omprogrammering startes, daglig vedlikehold kreves for ca 1 måned. Pass på å planlegge deretter. Alle påfølgende celle incubations må utføres under lav-O₂ forhold i 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ fuktet tri-gass vev kultur inkubator.

1. Erstatte plating mediet minst 1 h før transfection.
   1. Fjerne equilibrated reprogramming mediet settefiskanlegg lav-O₂ . Legge til bFGF en siste konsentrasjon av 100 ng/mL og B18R til en siste konsentrasjon av 200 ng/mL. Bland godt.
   2. Fortsetter med 1 godt samtidig, bruk en 1 mL pipette fjerne brukte medium og erstatte den med 1 mL av omprogrammering medium supplert med bFGF og B18R. Gjenta dette for hver brønn. Ikke bruk vakuum aspirasjon, som overdrevet tørker cellene fører til stress og reduserer omprogrammering effektivitet. Flytte platen med celler tilbake i lav-O₂ inkubator.
2. Transfect fibroblaster med 5 µL av RNAiMax transfection reagensen per 1 µg av endrede mRNA og 1 µL av transfection reagensen per 6 pmol av miRNA etterligner per transfection.
   Merk: Optimale resultater er oppnådd når transfections gå for 16-20 h. Hva reagensen er utvannet 10 x; den 100 ng/µL endret mRNA cocktail er utvannet 5 x; og de 5 pmol/µL miRNA imiterer blandingen er fortynnet 8,33 x med transfection bufferen før complexation. Se tabell 1 for et sammendrag av hva.
   1. Mens forbereder transfection mikser, minimere berøres av reagenser RNase ved å følge standard laboratoriepraksis.
   2. Equilibrate en aliquot transfection bufferstørrelsen (trinn 1.3) for ca 1 h på RT. Ikke bruk en 37 ° C vannbad eller inkubator for å varme opp transfection bufferen.
   3. Fjerne en enkelt aliquot av modifisert mRNAs (33 µL) og miRNA etterligner (14 µL) fra-80 ° C og varme dem til RT for ca 3-5 minutter, til tint. Ikke tine dele på 37 ° C. Spin dem ned kort i en microfuge.
   4. Varm transfection reagensen til RT for ca 3-5 minutter. Ikke bruk en 37 ° C vannbad eller inkubator. Invertere lukket røret 2 – 3 ganger å blande reagensen. Spinne det ned kort i en microfuge.
   5. Overføre 279 µL RT transfection bufferstørrelsen til en RNase uten microcentrifuge tube. Legge til 31 µL av transfection reagensen som skal oppnå et endelig antall 310 µL. Mix grundig av pipettering. Gjør ikke vortex. Inkuber røret på RT for 1 min.
      Merk: Dette volumet av utvannet transfection reagensen er tilstrekkelig til komplekse både endret mRNA og miRNA etterligner dele fra trinn 3.2.3.
   6. Legge til 132 µL RT transfection bufferstørrelsen 33 µL aliquot av endrede mRNA. Pipetter forsiktig for å blande: siste bindet er 165 µL.
   7. Legg 102.6 µL RT transfection bufferstørrelsen til 14 µL aliquot av miRNA imiterer. Pipetter forsiktig for å blande: siste bindet er 116.6 µL.
   8. Legge til 165 µL av utvannet transfection reagensen fra trinn 3.2.5 til den utvannet endret mRNA fra trinn 3.2.6. Pipetter å blande: siste bindet er 330 µL.
   9. Legge til 116.6 µL av utvannet transfection reagensen fra trinn 3.2.5 utvannet miRNA imiterer mix fra trinn 3.2.7. Bland godt (siste bindet er 233.2 µL). Inkuber i 15 min på RT tillate transfection buffer til med den endrede mRNAs og miRNA etterligner.
   10. Fjerne platen med celler fra lav-O₂ inkubator. Legg 100 µL (1 µg) av den kompleksbundet endret mRNA transfection blanding i hver brønn, dropwise over brønnen. Spre transfection komplekser av forsiktig men grundig agitating platen med en opp/ned og venstre/høyre bevegelse. Ikke swirl plate å blande.
   11. Legg 66.7 µL (20 pmol) av kompleksbundet miRNA imiterer transfection blandingen i hver brønn, dropwise over brønnen. Spre transfection komplekser av forsiktig men grundig agitating platen med en opp/ned og venstre/høyre bevegelse. Ikke swirl plate å blande.
   12. Plass transfekterte cellene i tri-gass inkubator med O₂ satt til 5% (lav-O₂). Når platen er satt, spre transfection komplekser igjen ved forsiktig men grundig agitating platen med en opp/ned og venstre/høyre bevegelse.
   13. Pipetter 4 mL omprogrammering medium i en 15 mL konisk rør og plasser den i lav-O₂ inkubator løsnet cap til equilibrate over natten. Ikke Legg bFGF og B18R til det fulgte dag.

Rør 1 - RNAiMax fortynning (1 mix)
Reagens	Konsentrasjon	Volum
Hva Buffer		279 ΜL
RNAiMax (legge 2)	10 x	31 ΜL
		Totalt: 310 µL
		(Inkuber 1 min ved romtemperatur)
Rør 2 - modifisert mRNA blande (2 mix)
Reagens	Konsentrasjon	Volum
modifisert mRNA blanding	100 ng/µL (5 x)	33 ΜL
Hva Buffer		132 ΜL
		Totalt: 165 µL
		(legge like volum av fortynnet RNAiMax Tube 1)
Rør 3 - miRNA imiterer blande (3 mix)
Reagens	Konsentrasjon	Volum
miRNA etterligner blanding	5 pmol/µL (8.33 x)	14 ΜL
Hva Buffer		102.6 ΜL
		Totalt: 116.6 µL
		(legge like volum av fortynnet RNAiMax Tube 1)

Tabell 1: Forberedelse transfection mix.

4. skifte Reprogramming Medium mellom Transfections (dager 2, 4, 6, 8, 10 og 12)

1. Erstatt medium 16-20 h etter hva som beskrevet i 3.1.1–3.1.2. Legge til bFGF en siste konsentrasjon av 100 ng/mL og B18R til en siste konsentrasjon av 200 ng/mL i omprogrammering middels dele.
2. Overvåke mWasabi uttrykk daglig for å bekrefte hva kvalitet benytter et mikroskop konfigurert til å visualisere EGFP.
   Merk: mWasabi uttrykk skal være minimal tydelig på dag 2 og økning i lysstyrke med hver ekstra transfection.

5. andre-daglige Transfections (dager 3, 5, 7, 9, 11 og 13)

1. Utføre hva som beskrevet i trinn 3.2. Endre ikke mediet på dager med hva.
2. Forberede en 4 mL aliquot av reprogrammering medium og plasser den i lav-O₂ inkubator til equilibrate for mellomstore endringen dagen. Ikke Legg bFGF og B18R til det fulgte dag.

6. prosedyrer utføres etter siste Transfection

1. Utføre daglig middels endringer fra dag 14 gjennom ca dag 17. Varme 7 mL av omprogrammering middels til 37 ° C. Legge til bFGF en siste konsentrasjon 100 ng/ml.
   Merk: B18R er ikke lenger nødvendig etter den siste transfection. Utover dag 14 er det ikke lenger nødvendig å equilibrate mediet overnatting i lav-O₂ inkubator.
2. Fjerne mediet fra alle brønner med en serologisk pipette. Fortsett å unngå å bruke aspirasjon. Legg 2 mL omprogrammering medium med bFGF per brønn.
3. På dager 17 og 18, analysere omprogrammeres brønnene under en invertert eller dissecting mikroskop. Hvis kolonier dannes i umiddelbar nærhet til hverandre på grunn av høy effektivitet med reprogramming og kan ikke isoleres manuelt, kan du skille koloniene ved å utføre en valgfri passaging omprogrammeres brønner som beskrevet i trinn 7 under. Hvis koloniene er sparsom og godt atskilt, manuelt velge kloner direkte fra den omprogrammeres godt som beskrevet i trinn 8 og subkultur iPSCs ifølge standardprotokoller.

7. valgfri prosedyre: Passaging celler fra omprogrammeres brønner med EDTA

1. Klargjør 0,5 mM EDTA i DPBS (EDTA) ved å fortynne 0,5 M EDTA lager løsningen. Filteret sterilisere EDTA bruker 0.22 µm vakuum filtreringssystem.
2. Forberede mater-fri pluripotent stamceller (PSC) medium (f.eks mTeSR1) i henhold til produsentens instruksjoner. Forvarm 32 mL PSC middels til 37 ° C.
3. Coat alle brønner med to 6-vel-format plater med hESC-kvalifiserte ekstracellulær matrix (EFM) følg produsentens instruksjoner. Forsegle plater med parafin film og Inkuber dem 1t på RT.
4. Sug opp ECM løsningen fra forvarmes platene og erstatte den med 2 mL PSC medium per brønn. Ikke la overflaten av tørke. Sett dem til side.
5. Sug opp reprogramming mediet 2 omprogrammeres brønner på en dag når koloniene er store og tydelig formet (vanligvis dag 18). Skyll når med 1 mL av EDTA og leveringstanken.
6. Legg 1 mL av EDTA per brønn. Inkuber for 4 min på 37 ° C.
7. Forsiktig fjerne platen settefiskanlegg, og plasser den i fravær av smittefarlige stoffer skap.
   Merk: på dette punktet, celler kan være meget løst overholdt og lett forskyves.
8. Nøye Sug opp EDTA fra begge brønner. Legge 3 mL forvarmes PSC medium til hver godt behandlet med EDTA. Bruk en celle-skraper å forsiktig men grundig fjerne celler fra begge brønner.
9. Bruk en serologisk Pipetter forsiktig Pipetter celle suspensjon og bryte opp store klumper. Ikke Pipetter til alle cellen klumper er borte. Bevare iPSC klynger.
   Merk: Plating store klumper vil ikke påvirke iPSC kolonien utvekst. Hvis det er overdrevent stor celle klumper, bare unngå overfører dem til neste rett.
10. Bruker en serologisk pipette, jevnt distribuere celler fra hver EDTA-behandlet godt av pipettering 0,5 mL i hver brønn av ECM-belagt 6-vel plate.
    Merk: Kombinerer ikke celler fra omprogrammeres brønnene (dvs. omprogrammeres vel 1 bør være jevnt fordelt inn i første 6-vel plate og omprogrammeres vel 2 bør jevnt fordelt over 6-vel platen).
11. Flytte belagt cellene tilbake i lav-O₂ inkubator. Jevnt distribuere celler, riste hver plate frem og tilbake og til siden. Ikke virvel. Erstatte PSC mediet daglig.

8. plukking iPSC kolonier

1. Forvarm 15 mL PSC middels til 37 ° C. Coat alle wells fra en enkelt 6-vel plate med hESC-kvalifiserte ECM følge instruksjonene fra produsenten. Forsegle platene med parafin film og Inkuber dem 1t på RT.
2. Sug opp kultur medium fra brønner brukes til å samle iPSCs. Skyll når med 1 mL av EDTA og leveringstanken. Legg 1 mL av EDTA per brønn. Inkuber for 4 min på 37° C. Mens cellene er incubating, Sug opp ECM løsningen fra forvarmes platene og erstatte med 2 mL PSC medium per brønn. Avsette platene.
3. Fjern platen med iPSCs å bli plukket fra inkubator og plassere den i fravær av smittefarlige stoffer skap.
   Merk: på dette punktet, celler kan være meget løst overholdt og lett forskyves.
4. Nøye Sug opp EDTA. Veldig forsiktig legge 3 mL forvarmes PSC medium, ta vare ikke for å dislodge iPSC kolonier.
5. Flytte platen til en invertert eller dissecting omfang bedre visualisere kolonier. Forberede en 1 mL pipette med sterilt tips. Trykk ned stempelet fullt, så bruk pipette spissen å forsiktig skrape en koloni mens sakte tegning væske i spissen for å samle kolonien. Tegn som liten medium som mulig mens plukke iPSC kolonien.
6. For å overføre kolonien, Pipetter opp og ned 3-4 ganger i en enkelt brønn av ECM-belagt plate fra trinn 8.2. Gjenta til 6 koloniene er plukket og overført til individuelle brønner. Velg mer enn 2 kolonier fra enhver enkelt brønn hvis en valgfri passaging beskrevet i trinn 7 er utført.
7. Bruke en standard menneskelige stamceller-protokollen til å fryse ned alle gjenværende brønner. Tine og re tallerkenen frosne aksjer hvis flere kolonier må plukkes senere.

9. karakterisering av iPSCs

1. Utføre TRA-1-60 flekker for analyse av omprogrammering effektivitet (dag 18).
   Merk: 2 av 3 omprogrammeres brønner er passaged for fremtidige kolonien plukking. De resterende også kan brukes til TRA-1-60 farging. Denne fremgangsmåten kan utføres på laboratoriet benk toppen.
   1. Vask den omprogrammeres godt med 1 mL av PBS. Fastsette celler med iskald metanol på 20 ° C i 5 min.
   2. Sug opp metanol. Tørre brønnen i ca 2 min. være forsiktig med å over tørr. Cellene har tørket nok når de blir en gjennomsiktig/Matt farge.
   3. Vask de vel 3 gangene med 1 mL av PBS i 5 min med mild risting. Under vasker, forberede 3 mL 3% Hydrogenperoksid i PBS.
   4. Sug opp PBS. Legg 2 mL utvannet peroxide løsningen. Inkuber i 15 min på RT med mild risting. Forberede 4 mL av blokkering løsningen: 10% storfe-serum albumin (BSA) i PBS.
   5. Sug opp peroxide løsningen. Vask godt 2 ganger med 1 mL av PBS i 5 min.
   6. Sug opp PBS og legge 2 mL blokkerer løsning i brønnen. Inkuber 1t på RT.
   7. Vask de vel 3 gangene med 1 mL av PBS i 5 min med mild risting.
   8. Fortynne primære anti-TRA-1-60 antistoff på 1: 100 i blokkering løsningen med 0,05% Natriumazid. Forberede 1 mL av antistoff fortynning for 1 godt av en 6-vel format rett. Legge til antistoff fortynning brønnen og vikle platen med parafilm å unngå fordampning. Ruge over natten ved 4 ° C med mild risting.
      Merk: Eventuelt inkubasjon med primære antistoffer kan gjøres 1t på RT med mild risting. Den primære antistoff fortynning kan gjenbrukes opp til 5 ganger.
   9. Inkubasjon med det primære antistoffet vaskes de vel 3 gangene med 1 mL av PBS i 5 min med mild risting.
   10. Fortynne sekundære anti-musen HRP-konjugerte antistoffer på 1:200 i blokkering løsningen. Inkuber brønnen med sekundær antistoff fortynning 2 h på RT med mild risting.
   11. Sug opp den sekundære antistoff fortynning og vaske de vel 3 gangene med 1 mL av PBS i 5 min med mild risting.
   12. Under den tredje vasken, forberede substratløsningen følger produsentens instruksjoner. Sug opp PBS etter siste vask. Legg 1 mL av substratløsningen og ruge til ønsket farge utvikler (ca 10 min).
   13. Sug opp substratløsningen. Skyll godt med vann til 5 min mens forsiktig risting.
   14. Telle koloniene, om ønskelig. Omprogrammere effektivitet = (antall kolonier) / (antall belagt fibroblaster) x 100%.
   15. For langtidslagring, Sug opp vann fra farget platen og air-dry over natten på RT. Seal tørket platen med parafilm og lagre ved 4 ° C i opptil to år å vurdere omprogrammering effektivitet senere.

Representative Results

Vanligvis tar det ca 5-6 uker fra initiering av fibroblast omprogrammering til frysing av første ampullene i iPSCs (figur 1). Reprogramming protokollen kan generelt kategoriseres i to faser. Fase 1 inneholder fibroblast kultur og syv transfections, med reprogramming RNA cocktail utført hver 48 h. fase 2 inneholder isolasjon, utvidelse og karakterisering av iPSC koloniene.

Før du starter protokollen, bør det sikres at fibroblaster må omprogrammeres er av god kvalitet. Sunn fibroblaster vises spindel-formet, bipolar, og refractile med en dobling tid på ca 24 h. Dag 0, skal 250.000 celler belagt i en 10 cm parabol på dag -2 vokse til 40-60% confluency (figur 1, dagen 0) og gi ca 6 – 10 x 10⁵ celler. Celler voksende på en lavere hastighet kan kompenseres for ved plating på en høyere tetthet på dag -2 og på dagen 0 omprogrammere.

Fibroblaster skal vises veldig sparsom følgende plating inn i en brønn på en 6-vel format rett omprogrammere (figur 2, dag 1). Tjuefire timer etter den første transfection, vil fibroblaster miste fasongen spindel og vedta en mer avrundet morfologi (figur 2, dag 2), som er bevart gjennom resten av reprogrammering. Grønne fluorescens fra mWasabi mRNA bør være minimal observerbare på dag 2 og stadig øke i lysstyrke å være synlig ved dag 4. Muligheten til å oppdage mWasabi fluorescens kan avhenge av omfanget følsomhet og oppsett. Cellen tetthet vil gradvis og konsekvent øke gjennom de tre første transfections (dager 1-6), med en tilsynelatende burst utbredelsen foregår mellom dager 7 og 8. Cellene skal vises i stor grad confluent av dag 10 (figur 2, dag 10). Første iPSC koloniene kan vises så tidlig som i dag 11 (figur 2, dag 11); kolonier kan imidlertid ikke være observerbare før i dag 18. Vanligvis dager 15 – 18: det vil være stor og åpenbare iPSC kolonier som klart skiller seg fra omliggende, ufullstendig omprogrammeres fibroblaster (figur 2, dag 15 og Figur 3, dag 17). Immunostaining for pluripotency markøren TRA-1-60 kan utføres for å vurdere omprogrammering effektivitet (Figur 3, dag 17, TRA-1-60). I vår erfaring, de fleste fibroblast linjer gi hundrevis av koloniene per omprogrammeres godt (Figur 3, innfelt B).

Suboptimal plating er den vanligste årsaken til redusert effektivitet med reprogramming i våre protokollen og er ofte assosiert med fibroblaster som er syke, senescent eller høy-passasjen. Hvis plating tetthet er for lav, vil det være stor acellular golde oppdateringer på slutten av omprogrammering (figur 4C) og iPSC koloniene nødvendigvis ikke (Figur 4 d). Omprogrammeres celler bør være svært confluent dag 14 (sammenligne figur 4A og 4B til figur 2, dag 14). Tilsvarende hvis cellene er belagt for tett eller sprer for fort, er omprogrammering effektivitet dramatisk redusert.

For å opprettholde homogenitet av pasient-avledede iPSCs, er det viktig å utvide linjer fra en enkelt koloni. Siden omprogrammering effektivitet er svært høy i våre protokollen, kan nabokommunene iPSC kolonier danne i nærheten og vokse til hver en annen (Figur 3dager 15-17). Dette gjør det noen ganger vanskelig å skille mekanisk en enkelt koloni for klonal ekspansjon. Vi har funnet at det er nyttig for første passering en omprogrammeres godt og fortynne den over et større kultur-området. En god ratio består av jevnt splitte en omprogrammeres 6-vel-format plate godt over en hel 6-vel tallerken.

Etter fortynning passering, iPSCs vokse som kolonier og er lett skilles fra fibroblaster (figur 5, dag 18). I utgangspunktet iPSC kolonier kan pakkes løst, og individuelle celler har en relativt stor cytoplasmatiske område. I løpet av 4-7 dager, iPSCs spre seg og danner en karakteristisk tett-pakket koloni med definerte kanter. Individuelle celler i kolonien har en stor kjernefysiske andel med fremtredende nucleoli (figur 5, dag 22). Det skal være mange koloniene som i hver brønn, og bare de klassiske iPSC morfologi skal plukkes for ekspansjon.

Figur 1 : Omprogrammering av menneskelig fibroblaster til indusert pluripotent stamceller (iPSCs). En skjematisk protokoll for omprogrammering av menneskelig fibroblaster presenteres. Fibroblaster er første passaged på en lav tetthet i et godt av en 6-vel format parabol, etterfulgt av syv transfections på 48 timer intervaller. Mediet er erstattet 16-20 h etter hver transfection. Omprogrammeres iPSCs er første passaged på ca dag 18 og klonal colonies plukkes dag 26. Vanligvis kan fibroblast-avledet iPSC linjer fryses for langtidslagring dag 38. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Representant daglig bilder under hver dag med reprogramming. Fibroblaster bør være ca 40-60% confluent ved passering å starte omprogrammering (dag 0, celler er belagt i 10 cm parabol). Den første transfection (T1) skjer på dag 1, og cellene skal vises veldig sparsom på dette punktet. Neste dag (dag 2), bør en mer avrundet morfologi bli tydelig. Cellene vil fortsette å øke i tetthet gjennom protokollen med iPSC klynger begynner å vises så tidlig som i dag 11 (sirkler i rødt). Dag 15 blir iPSC kolonier stor med diskret grenser. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Kolonien formasjon etter transfections med reprogramming endret mRNAs og miRNA etterligner. Lav-forstørrelse bilder ble tatt av en representant omprogrammering på dager 15-17. Etter den endelige transfection, vil omprogrammeres iPSCs danne klare kolonier med definerte grenser som ekspandere i størrelse og kondensere for å bli tydelig atskilt fra ufullstendig omprogrammeres omkringliggende fibroblaster. Immunostaining for pluripotency markøren TRA-1-60 indikerer tilstedeværelse av iPSCs (A innfelte) og kan brukes for beregning av omprogrammering effektivitet ved å telle alle koloniene i en enkelt brønn (innfelt B, eksempler countable kolonier sirklet i grønt). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Representant bilder av sub-optimale plating omprogrammere. (A, B) Eksempler på fibroblaster som er for sparsom dag 14 med reprogramming (sammenligne med figur 2, dag 14). (C) lav forstørrelse bildet på dag 17 med reprogramming med en stor, golde patch sirkler i rødt. (D) samme brønnen var fast og farget TRA-1-60 å bekrefte samlede fattige omprogrammering effektivitet på grunn av lav celle tetthet. Skalere barer = 200 µm (A, B) og 1 mm (C, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 : Representant bilder av iPSCs etter første passasje. Når du har fullført transfections med reprogramming modifisert mRNAs og miRNA etterlikner, omprogrammeres celler er passaged dager 17-20. iPSCs har en vekst fordel i PSC medium og kjøre forbi raskt noen fibroblaster som var ufullstendig omprogrammeres. Først vil iPSCs danne kolonier forekomme løs med dårlig definerte grenser. I flere dager, cellene raskt spre seg og ta på karakteristiske morfologi av tett pakket cellene med høy kjernen til cytoplasma forholdet, tett klynger til kolonier med forskjellige kantlinjer. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver en klinisk relevante, ikke integrert, RNA-basert metode som tillater omprogrammering av normal og sykdomsassosierte menneskelige fibroblast linjer i iPSCs på en ultra-høy effektivitet. Hittil har hver menneskelig fibroblast linje vi har forsøkt å omprogrammere med beskrevet protokollen gitt et tilfredsstillende antall høykvalitets iPSCs for nedstrøms programmer. Resulterende iPSCs kan umiddelbart overført og utvidet i mater-fri kultur forhold.

Kvaliteten på fibroblaster omprogrammere:

Omprogrammere suksess er sterkt avhengig av kvaliteten på starter fibroblaster. Ideelt sett bør omprogrammering startes med de laveste passasje fibroblaster for å oppnå den høyeste effektiviteten. Omprogrammere effektivitet er best med fibroblaster av passasje 2-4. Omprogrammere kan fortsatt arbeide med høy-passasjen (passasje 5-8), selv senescent fibroblaster, men med redusert effektivitet. Noen ganger lav-passasjen fibroblaster er utilgjengelig eller pasientprøvene har en genetisk mutasjon som hindrer sunn vekst. I dette tilfellet kan optimalisering av første plating være nødvendig. Omprogrammere kompromittert fibroblast linjer er vanligvis forbundet med økt celledød under RNA transfections. Resultatet vises cellene i den omprogrammering godt å være sparsommelig med dager 10-14 med reprogramming. Store acellular områder vil også vises i brønnen. Hvis dette er tilfelle, må reprogramming protokollen skal re startet med høyere første startnummeret av fibroblaster. Kontaktflate 3000 inn celler per brønn av en 6-vel format rett fungerer konsekvent for de fleste voksne fibroblast linjer. Imidlertid kan øke plating tallet 5 000 – 10 000 (50.000 for senescent linjer) bidra til å forbedre omprogrammering av sykdomsassosierte prøver, som er rapportert i våre tidligere publikasjoner⁸. Derimot kan celler nå confluency for tidlig også være motstandsdyktig mot omprogrammering. Hvis cellene gjennomgår transfections med reprogramming RNAs sprer for fort (som er tilfellet med primære neonatal fibroblaster), starte omprogrammering med 500 fibroblaster per brønn av en 6-vel format parabolen⁸.

Håndtering av transfection bufferen:

PH i transfection bufferen (redusert serum middels justert til pH i 8.2) er viktig for å oppnå optimal transfection effektiviteten kreves for dette omprogrammering protokollen. Derfor anbefales flere forholdsregler angående håndtering av transfection bufferen. Vi har funnet at selv kort eksponering for transfection bufferen atmosfærisk luft påvirker pH i bufferen. Derfor skal hva bufferen aliquoted i en skrukork beholder med minimal luftrommet (vi bruker 5 eller 15 mL skrukork konisk rør). Til ytterligere minimere luft eksponering, bruke hver transfection buffer aliquot for maksimalt to transfections. Til slutt, siden temperatur virkninger pH er det avgjørende at transfection bufferen er equilibrated å RT for montering av transfection komplekser. Det anbefales å ikke varm transfection buffer til 37 ° C.

Passaging av iPSCs:

Mens mange tidligere utgitt protokoller anbefaler plukke personlige iPSC kolonier på slutten av omprogrammering, dette kan være vanskelig å oppnå når effektiviteten av omprogrammering er svært høy eller hvis koloniene klynge sammen, som ofte er tilfelle i vår protokollen. IPSC kolonier ligger i umiddelbar nærhet til hverandre, anbefaler vi derfor først passaging cellene å spre omprogrammeres iPSCs før manuelt plukke kolonier. Det er flere fordeler med dette tidlig passering grepet. Spre ut koloniene gir mer plass til å vokse, gir mye større koloniene for plukking enn ellers kan oppnås i den opprinnelige brønnen. Dette forbedrer suksessrate i å etablere en iPSC linje fra en plukket klone. Vi finner også at flere kultur tiden med fibroblaster, om enn på en utvannet forhold, synes å forbedre den gjennomsnittlige kvaliteten på plukket iPSC kolonier. Ufullstendig omprogrammeres fibroblaster kan gi støtte paracrine faktorer, som fortsetter å etablere iPSCs og lette direkte overgangen i arkmateren uten celle kultur forhold. Fibroblaster har tilfeldig en selektiv vekst ulempe sammenlignet iPSCs når kultivert i mTeSR1. Derfor er forurensende fibroblast celle befolkningen raskt utvannet til ubetydelige mengder innen 3-4 ganger.

ROCK-hemmere som Y-27632 brukes ofte for rutinemessig kultur for menneskelig iPSCs. Vi har funnet at hyppige og/eller utvidet kultur noen iPSC linjer med Y-27632 får skadelige effekt på kvaliteten. Når du bruker en klynge passaging metoden, er som med EDTA, Y-27632 ikke nødvendig å opprettholde iPSC levedyktighet etter deling. Vi har helt eliminert supplere medier med Y-27632 for alle iPSC isolasjon, utvidelse eller rutinemessig kultur.

Protokollen begrensninger:

En begrensning til beskrevet RNA-baserte reprogramming tilnærming er innledende kostnader og kompleksitet knyttet til utarbeidelse av reprogramming reagenser. Selv om forberedende prosedyrer for å generere mRNA reagenser alle rutine og har vært tidligere beskrevet (PCR, i vitro transkripsjon, DNase behandling, capping, dephosphorylation, rensing), er kumulativt produksjon av mRNA reagenser en relativt lengre og ikke-triviell prosess. Den andre store utfordringen til denne protokollen er behovet for å transfect celler hver 48 h, øke arbeidskraft reprogramming protokollen. Disse hensynene kan være uoverkommelige hvis omprogrammering av bare noen pasientprøvene. Men hvis den primære vurderingen er generering av klinisk relevante iPSCs eller oppnå svært høy omprogrammering effektivitet, er beskrevet RNA-baserte reprogramming tilnærmingen ideelt.

Oppsummert hengsler beskrevet høyeffektive RNA-baserte reprogramming metoden på optimalisert transfection effektiviteten av hvilken somatisk cell må omprogrammeres som beskrevet i våre tidligere publikasjoner⁸. RNA transfection protokollen presentert i denne studien er svært innstilt for menneskelig primære fibroblaster men potensielt kan skreddersys til andre celletyper å forbedre omprogrammering effektiviteten av ulike somatiske celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid templates for PCR
pcDNA3.3_KLF4	Addgene	26815
pcDNA3.3_SOX2	Addgene	26817
pcDNA3.3_c-MYC	Addgene	26818
pcDNA3.3_LIN28A	Addgene	26819
pCR-Blunt_hM3O	Addgene	112638
pCR-Blunt_hNANOG	Addgene	112639
pCR-Blunt_mWasabi	Addgene	112640
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics
Forward Primer	Integrated DNA Technologies	TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale)	Integrated DNA Technologies	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolabs	S1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix	Agilent	600850-51
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate	Trilink Biotechnologies	N-1014
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
DNase I	NEB	M0303S
MEGAscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	AM1334
Pseudouridine-5'-Triphosphate	Trilink Biotechnologies	N-1019
Riboguard RNase Inhibitor	Lucigen	RG90910K
RNA Clean & Concentrator	ZymoResearch	R1019
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000684
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000715
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000717
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000718
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000719
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)	Fisher	AM9937	Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics
Fibroblast culture and reprogramming
0.1% Gelatin in H2O	StemCell technologies	#07903
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System	EMD Millipore	SCGVU05RE	Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
6-well plates (tissue culture treated)	Corning	3516
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Fetal Bovine Serum	Fisher	26-140-079
FGF Basic	ThermoFisher Scientific	phg0263
GlutaMax Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061	Glutamine supplement used for the prepration of media
Heat Inactivated FBS	Gibco Technologies	10438026
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828010
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778500	The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent
MEM	ThermoFisher Scientific	11095080
MEM Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140050
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985070	Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL
10 M NaOH	Sigma-Aldrich	72068	Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)	Fisher	AM9932	Use to dilute NaOH and wash a pH meter
Pen/Strep/Fungizone	GE Healthcare	SV30079.01
rhLaminin-521	ThermoFisher Scientific	A29248	Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies	14190144
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red	Life Technologies	2520056
Vaccinia Virus B18R (CF)	ThermoFisher Scientific	34-8185-86
iPSC culture
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs
EDTA, 0.5 M stock solution	K&D Medical	RGF-3130	Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts
Antibodies and Detection
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated)	Abcam	ab97046
Tra-1-60 (mouse anti human)	Stemgent	09-0010
Hydrogen Peroxide (30%)	LabChem	LC154301	Dilute to 3% with PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703100
Phosphate-buffered salin (PBS)	Hyclone	SH30258.02	Supplied as 10x, dilute to 1x
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4800
Special Equipment
Description			Notes
Biological safety cabinet
Regular humidified tissue culture incubator			Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C.
Tri-gas humidified tissue culture incubator			Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure.
pH Meter			Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible.
Inverted microscope			Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency.