Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Encellede RNA sekventering af Fluorescently mærket mus neuroner ved hjælp af manuel sortering og dobbelt In Vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58690
Automatic Translation
1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

Denne protokol beskriver den manuelle sortering procedure for at isolere enkelt fluorescently mærket neuroner efterfulgt af in vitro- transskription-baserede mRNA forstærkning til høj-dybde encellede RNA sekvensering.

Abstract

Encellede RNA sekventering (RNA-FF.) er nu en bredt implementeret værktøj for materialeprøvning genekspression. Kommercielt tilgængelige encellede RNA-sekventering platforme behandle alle inputceller ukritisk. Nogle gange bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) opstrøms at isolere et specifikt mærket befolkning af interesse. En begrænsning af FACS er behovet for høje antal input celler med betydeligt mærket fraktioner, som er upraktisk for indsamling og profilering sjældne eller tyndt mærket neuron befolkninger fra mus hjernen. Her, beskriver vi en metode til manuelt indsamling sparsomme fluorescently mærket enkelt neuroner fra frisk dissocieres mus hjernevæv. Denne proces giver mulighed for opfange single-mærket neuroner med høj renhed og efterfølgende integration med en in vitro- transskription-baseret forstærkning protokol, der bevarer endogene udskrift nøgletal. Vi beskriver en dobbelt lineær forstærkning metode, der bruger unikt molekyle identifikatorer ((UMIS) velkommen) til at generere enkelte mRNA tæller. To runder af forstærkning resulterer i en høj grad af gen påvisning pr. enkelt celle.

Introduction

Encellede RNA sekventering (RNA-seq) har forvandlet transkriptom undersøgelser. Mens store enkelt-celle RNAseq kan udføres ved hjælp af en række teknikker, som dråber1,2, mikrofluidik3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerede celletyper at udtrykke genetisk kodet fluorophores. For at isolere en Marker celle population, bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) ofte til at sortere mærket celler i en enkelt celle tilstand. FACS har dog nogle begrænsninger og kræver omhyggelig prøve behandlingstrin. Først, et stort antal input celler er typisk behov (ofte flere millioner celler pr. mL), med en betydelig brøkdel (> 15 – 20%) der indeholder mærket befolkningen. For det andet kan celle præparater kræve flere runder af tæthed gradient centrifugering skridt til at fjerne glial brøkdel, snavs og celle klumper, der ellers kan tilstoppe cellen dyse eller flow. For det tredje beskæftiger FACS normalt farvning og affarvning trin for live/døde farvning (fx 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium Iodid (PI) og Cytotracker farvestoffer), som tager op ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to-farve sortering (f.eks DAPI og grøn/rød fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis/RFP)), normalt to prøver og en kontrol er nødvendig, kræver en umærket prøven skal behandles ud over den ønskede mus stamme. For det femte er filtrering ofte udføres flere gange før og under prøven sortering for at proaktivt forhindre tilstoppede prøve linjer i en FACS maskine. Det sjette skal gang tildeles i mest almindeligt anvendte FACS opsætninger til at initialisere og stabilisere den flydende strøm og udføre droplet kalibrering. Syvende, kontrol prøver der typisk køres i rækkefølge før den faktiske prøvetagning til nedsat erstatning matricer, doublet afvisning, indstilling gates, etc. brugere enten udføre trin seks og syv selv god tid eller kræver det hjælp fra en tekniker parallelt. Endelig, post-FACS, der er ofte skridt til at sikre, at kun mærket enkelt celler er til stede i hver brønd; for eksempel, ved at kontrollere prøver i en høj-indhold screening Opsætning såsom en fast plade imager.

For at omgå trinene ovenfor og lette en forholdsvis hurtig, målrettet sekventering af en lille population af enkelt fluorescently mærket neuroner, beskriver vi en manuel sortering procedure efterfulgt af to runder af en yderst følsom in vitro forstærkning protokol, kaldet dobbelt in vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq). RNA forstærkning og cDNA bibliotek generation er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med visse ændringer der passer til mus interneurons, der har mindre cellulære mængder; Derudover har vi også fundet, at det er lige så nyttige for excitatoriske pyramideformet neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af IACUC på kolde forår Harbor laboratorium, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manuel sortering af Fluorescently mærket mus neuroner

  1. Trække glas microcapillaries (Se Tabel af materialer) til 10 – 15 µm exit diameter ved hjælp af en kapillær aftrækker med følgende indstillinger: varme: 508, pull: Tom, vel: Tom, tid: Tom.
  2. Vedhæfte 120 – 150 cm fleksible silikoneslanger (~0.8 mm indvendig diameter) til en 0,2 µm polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran sprøjte filter og en to-vejs slanger ventil ved hjælp af egnede slange stik.
  3. Forberede 500 mL af kølet (4 ° C) kunstige cerebrospinalvæske (ACSF, tabel 1), og oxygenatorer af boblende 5% kuldioxid afbalanceret ilt gennem en airstone i 15 min eller indtil løsningen rydder helt.
  4. Forberede 100 mL af ACSF med en cocktail af aktivitet blokkere i et 150 mL bægerglas (tabel 1).
  5. Forberede 100 mL af ACSF med 1 mg/mL Streptococcus brøkdel IV protease i et 150 mL bægerglas (tabel 1).
  6. Forberede 100 mL af ACSF med 1% føtal bovint serum (FBS) løsning i et 150 mL bægerglas og oxygenat med 5% kuldioxid afbalanceret ilt gennem en airstone.
  7. Dissekere hjernen fra en aflivede mus ved at åbne kraniet med en lille saks og uddrager den friske hjerne ved hjælp af fine pincet uden at beskadige cortex.
    Bemærk: Mus af enhver stamme, alder og køn kan bruges som ønsket. Ikke fryse hjernen eller udføre manuel sortering på musene injiceret med virus eller andre farlige/smitstoffer.
  8. Hold hjernen i kølet og iltet ACSF, forlader en airstone knyttet til 5% CO2-balance ilt under hele varigheden af den skæring.
  9. Placer hjernen på vibratome chuck og skær koronale eller sagittal sektioner på 300 µm tykkelse. Indsamle så mange dele som nødvendig for at opnå et minimum af ~ 10-50 mærket celler op til flere hundrede celler. Sætte skiver på en bomuld småmaskede redskaber skive indehaveren, placeret inde i et bægerglas, så de er badet i iltet ACSF.
  10. Flytte friske skiver i et bægerglas, der indeholder ACSF med aktiviteten blokkere og blokere for 15-20 min. ved stuetemperatur. Holde boblende ilt ved hjælp af airstone.
  11. Flytte udsnittene til et bægerglas, der indeholder ACSF med protease løsning til at udføre mild fordøjelsen ved stuetemperatur: 20 – 30 min til P4-14 dyr eller op til 45-60 min. til P28-56 dyr. Holde boblende ilt.
  12. Udviske ACSF med protease ved at flytte skiver tilbage over i bægerglasset, der indeholder ACSF med aktiviteten blokkere løsning for 5-10 min ved stuetemperatur. Holde boblende ilt.
  13. Flytte enkelte dele til en 100 mm petriskål indeholdende ACSF med 1% FBS ved stuetemperatur. At have et minimum af 10 – 50 celler (op til et par hundrede) under en fluorescerende dissektion anvendelsesområde, microdissect områder og lag af interesse. Udføre microdissection med et par fine pincet eller ved at knytte 22-28 G injektion nåle på træ indehavere (spyd).
  14. Ved hjælp af Pasteurs pipette, flytte microdissected stykker til en 2 mL mikrofuge rør indeholdende 1% ~0.8 mL FBS i ACSF løsning.
  15. Hakkede dissekeret vævet i mikrofuge røret ved stuetemperatur. Gøre tre langstilkede Pasteur pipetter med faldende exit diametre af rullende dem over en åben flamme. Udføre ~ 10 slag med hver pipette, startende med de største og slutter med den mindste.
  16. Undvære de dissocierede celler ind i en 100 mm petriskål indeholdende iltet ACSF (petriskål kan tynde skiver belagt med 5 mm 1% agar eller klar silikone sammensatte på 1:10 forhold, hvis det ønskes). Holde ved stuetemperatur.
  17. Vent ~ 5-7 min til celler gradvist afvikle, så observere normal god landbrugspraksis/RFP signal under et mikroskop for dissektion.
    Bemærk: Enkelt celler, snavs og små klumper vil være synlige i lysfelt (BF).
  18. Vælge 10 – 15 normal god landbrugspraksis/RFP celler ad gangen ved hjælp af en kapillær pipette (fra trin 1.1) knyttet til fleksible silikoneslanger (0,4-0,8 mm indre diameter) og dispensere cellerne i en 100 mm petriskål indeholdende frisk iltet ACSF.
  19. Ved at blokere udgangen af slangen ventil med tungen, skal du placere kapillar tæt på celle af interesse. Fange celler ved hjælp af kapillaritet ved lindre blokken, og hurtigt blok igen for at forhindre, at overskydende væske ind pipetten. Dispensere celler på en 100 mm petriskål med frisk iltet ACSF af forsigtigt blæser, mens observere kapillær spidsen under fluorescens optik af dissektion mikroskop. Målet at indsamle ~ 100 – 150 celler samlede.
  20. Gentag trin 1.19 én eller to gange mere (afhængigt af snavs) og overføre alt af ~ 50 – 75 celler til en ny 100 mm petriskål, og sørg for, at forurenende stoffer såsom rester er minimal i lysfelt differential interferens kontrast (DIC) optik.
  21. Endelig, ved hjælp af en frisk microcapillary pipette hver gang, vælge en enkelt celle i mere end 0,5 µL volumen og udvise det ind i en enkelt 0,2 mL mikrofuge rør (eller en strimmel af otte 0,2 mL mikrofuge rør) indeholder 1 µL af prøven samling buffer med primere N10B1-N10B96 (tabel 2). Bryde pipette tip i mikrofuge røret til at sikre, at cellen forbliver i samling bufferen. Kassér pipetter.
  22. Frys cellerne ved at lægge rør på tøris og lagre dem langsigtede i et-80 ° C fryser indtil de er klar til at blive behandlet for RNA forstærkning.

2. første runde RNA forstærkning

Bemærk: Den følgende procedure er for enkelt strimmel af otte 0,2 mL mikrofuge rør. Skalere reaktioner efter behov.

  1. Syntetisere den første del af cDNA (første runde).
    1. Varmen strimler fra trin 1,22 på 70 ˚C i 5 min. efterfulgt af 4 ˚C for 5 min; Gentag to gange.
    2. Samle på isen reverse transkriptase (RT) master mix/first-strand syntese master mix ved hjælp af følgende ingredienser (Se Tabel af materialer): 10 x first-strand buffer (2 µL), dNTP mix (4 µL), RNase inhibitor (1 µL) og enzymet (1 µL).
    3. Kort centrifugeres strip på en bordplade centrifuge til at indsamle alt nederst. Holde på is.
    4. Tilføj 1 µL af RT master mix/first-strand syntese master mix til ovenstående rør (samlet volumen på 1 µL af prøvebuffer fra celle samling + 1 µL af RT = 2 µL/tube). Bland godt af pipettering. Kort spin for at indsamle hele indholdet i bunden og holde det på is.
    5. Inkuber den ovenstående tube/s på 42 ° C i 2 timer i ovn luft. Sætte rørene på is straks at opsige reaktionen og gå videre til anden-strand syntese trin.
  2. Syntetisere den anden streng af cDNA (første runde).
    1. Gøre anden strand master mix (80 µL) på is i følgende rækkefølge i en 1,5 mL tube: nukleasen-gratis vand (63 µL), 10 x anden strand buffer (10 µL), dNTP mix (4 µL), DNA polymerase (2 µL) og RNaseH (1 µL). Bland ingredienserne godt af vortexing, så spin at indsamle nederst og holde på is.
    2. Start den termiske cycler, køre følgende program til pre cool enheden, være klar til at starte trin 2.2.3 (låg varme = off; 16 ° C i 2 timer, 4 ° C hold), og pause ved 16 ° C.
    3. Tilføje en 80 µL/striben (eller 10 µL/tube) af anden strand master mix til hver tube strip og holde på is. Overføre strimlen til den termiske cycler og genoptage det 16 ° C skridt indledt ovenfor. Inkuber strip i 2 timer ved 16 ° C.
    4. Efter den anden-strand syntese trin, skal du placere rør på isen for at gå videre til det næste trin, cDNA rensning.
  3. Rense dobbelt strandede cDNA (første runde).
    Bemærk: Alle centrifugations er udført på ~ 8.000 x g ved stuetemperatur. Aldrig overstige 16.000 x g for at undgå skader på filter cartridge.
    1. Begynde at varme 100 µL nukleasen-gratis vand til 50-55 ° C til senere brug i en tør varme blok. Aldrig overstige 58 ° C for at undgå delvis denaturering af cDNA.
    2. Tilføje 250 µL cDNA binding buffer til en 1,5 mL tube. Indskrive nemlig bundfald i bufferen, så varm stødpudeopløsning til 37 ° C i 10 min igen opløses bundfald.
    3. Overføre cDNAs fra en enkelt 8-tube strip til cDNA binding buffer. Kombiner celler i dette trin for videre downstream processer (8 celler i 1 tube). Blandes grundigt ved pipettering 2 - 3 gange og klippede 3 - 4 gange. Spin at indsamle indhold i bunden.
    4. Sætte cDNA filterpatron til vask rør (fra en in vitro- transskription (IVT) kit) fast. Tilføj den ovennævnte blanding til midten af filteret. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil det er gennem filteret. Kassér gennemstrømnings- og erstatte vask tube.
    5. Tilføje 500 µL af wash buffer fra IVT kit til kolonnen.
      Bemærk: Sørg for, at ethanol er blevet tilføjet til vaskebuffer tidligere.
    6. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil det er gennem filteret. Kassér gennemstrømning og centrifugeres igen ved 8.000 x g for ~ 1 min. at tømme patronen.
    7. Overføre cDNA-filter til en cDNA eluering tube (1,5 mL nukleasen-gratis tube). Anvende 8,5 µL pre varmede nukleasen-gratis vand til midten af filteret. Vente 2 min og centrifugeres ved 8.000 x g i ~1.5 min.
    8. Elueres igen med 8,5 µL pre varmede nukleasen-gratis vand og gå straks til den første runde IVT.
      Bemærk: Dobbelt-strenget cDNA gendannelsesdiskenheden bliver ~ 16 µL.
  4. Udføre en in vitro- transskription (IVT) reaktion forstærkede RNA (Carl) produktionen fra cDNA (første runde).
    1. Indstil hybridisering luft ovn til 37 ° C.
    2. Forberede den master mix for IVT på is i følgende rækkefølge: 16 µL af den eluted dobbelt-strenget cDNA fra trin 2.3.8, tilføje 4 µL af T7 ATP løsning (75 mM); 4 µL af T7 CTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 GTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 UTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 10 x reaktion buffer; og 4 µL af T7 enzym mix. Bland godt, spin, og holde på is.
    3. Tilføje 24 µL af IVT master mix til hver tube indeholder 16 µL cDNA. Bland indholdet af pipettering forsigtigt og grundigt. Inkuber rør ved 37 ° C til 14 h.
      Bemærk: Inkubation i < 12t alvorligt påvirker udbytte.
    4. Tilsættes 60 µL af ikke-diethyletheren pyrocarbonate (ikke-DEPC) behandlet RNase-fri vand for at øge lydstyrken til 100 µL og IVT reaktionen standses.
  5. Rense Carl.
    Bemærk: Alle centrifugations er udført på ~ 8.000 x g ved stuetemperatur. Aldrig overstige 16.000 x g for at undgå skader på filter cartridge.
    1. Begynde at varme ~ 200 µL nukleasen-gratis vand til 50-55 ° C til senere brug i en tør varme blok eller PCR-maskine. Aldrig overstige 58 ° C for at undgå delvis denaturering af Carl.
    2. Overføre Carl til en 1,5 mL nukleasen-gratis tube. Tilføje 350 µL af Carl binding buffer til hver prøve, Carl. Tilsæt 250 µL af 100% ethanol hver tube og mix af 3 gange af pipettering (ikke vortex at blande og spin).
    3. Overfør blandingen straks til RNA oprensning kolonne ved at tilføje det forsigtigt til midten af filter cartridge. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil blandingen er gået helt gennem filteret. Kassér gennemstrømnings- og genbruge affald collection tube
      Bemærk: RNA starter bundfældes ved tilsætning af ethanol.
    4. Tilføje 650 µL af wash buffer til hver filterpatron. Der centrifugeres i ~ 1 min på 8.000 x g eller indtil hele bufferen er gået. Kassér gennemstrømnings- og dreje filtre for en ekstra ~ 1 min. at fjerne spor af wash buffer.
    5. Overføre filteret til en frisk Carl collection tube. Tilføj 100 µL forvarmet (50-55 ° C) nukleasen-gratis vand til midten af filteret. Vente 2 min, derefter centrifugeres i ~1.5 min. på 8.000 x g, eller indtil det er gået ind i collection tube.

3. anden runde forstærkning

  1. Syntetisere den første streng cDNA (anden runde).
    1. Overførsel Carl fra skridt 2.5.5 en 200 µL mikrofuge tube og vakuum koncentrere de 100 µL elutant til 10 µL. bruger ingen varme, køre vakuum koncentratoren for 65 min. sammenligne med 10 µL vand i et 200 µL rør til at anslå den reducerede mængde.
    2. Forvarm hybridisering luft ovnen til 42 ° C.
    3. Tilføje 2 µL af tilfældige hexamer primere fra IVT kit til Carl, vortex kortvarigt, og spin for at indsamle indholdet.
    4. Inkubér mikrofuge røret på 70 ° C i 10 min i en termisk cycler, derefter placere den på is.
    5. Forbered de følgende RT master mix: 2 µL af 10 x første strand syntese buffer, 4 µL af dNTP mix, 1 µL af RNase inhibitor og 1 µL af ArrayScript enzym. Blandes godt i en 200 µL mikrofuge rør af forsigtigt vortexing, derefter spin for at indsamle indholdet og Anbring på is.
    6. Tilføje 8 µL af RT master mix (første strand) til hver mikrofuge tube. Sted rør i et 42 ° C air inkubator for 2 h.
    7. Tilføj 1 µL af RNaseH til de ovenstående reaktion. Bland godt af pipettering 2 - 3 gange og klippede 3 - 4 gange, og spin til at indsamle indholdet. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. på en PCR-maskine. Efter inkubation, Fortsæt til anden-strand syntese trin straks.
  2. Syntetisere den anden streng af cDNA (anden runde).
    1. Tilføje 3 µL af T7-RA5 primer (på 25 ng/µL arbejdsfortynding, tabel 2) og 2 µL af RNase-fri vand til hver cDNA prøve. Bland godt, og spin for at indsamle indholdet.
    2. Der inkuberes ved 70 ° C i 10 min i en termisk cycler. Sted reaktion på is.
    3. Forberede RT master mix (anden strand) på is: 58 µL nukleasen-gratis vand, 10 µL af 10 x anden strand buffer, 4 µL af dNTP mix og 2 µL af DNA polymerase. Bland godt ved vortexing og spin til at indsamle indholdet. Holde på is.
    4. Tilføje 74 µL af den ovennævnte blanding til hver tube fra trin 3.2.2. Bland godt af pipettering 2 – 3 gange og klippede 3 - 4 gange, derefter spin for at indsamle indholdet. Holde på is og holde.
    5. Pre køle den termiske cycler til 16 ° C ved at slå låget varme. Sted rør i den termiske cycler i 2 timer ved 16 ° C.
    6. Efter den anden-strand syntese skridt, placere rør på isen for at gå til trinnet cDNA rensning, eller fryse ved-20 ° C.
      Bemærk: cDNA rensning anbefales før frysning.
  3. Udføre cDNA rensning (anden runde).
    Bemærk: Alle centrifugations er udført på ~ 8.000 x g ved stuetemperatur. Aldrig overstige 16.000 x g for at undgå skader på filter cartridge.
    1. Begynde at varme nukleasen-gratis vand til 50-55 ° C til senere brug i en tør varme blok. Aldrig overstige 58 ° C for at undgå delvis denaturering af cDNA.
    2. Overføre cDNA til en 1,5 mL nukleasen-gratis tube. Tilføje 250 µL cDNA binding buffer til hver tube. Indskrive nemlig bundfald i bufferen og varm stødpudeopløsning til 37 ° C i 10 min igen opløses. Blandes grundigt ved pipettering 2 – 3 gange og klippede 3 - 4 gange. Spin til at indsamle indholdet.
    3. Fast sætte cDNA filterpatron i vask-rør. Tilføj den ovennævnte blanding til midten af filteret. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil det er gennem filteret. Kassér gennemstrømnings- og erstatte vask tube.
    4. Tilsættes 500 µL af wash buffer. Sørg for ethanol er blevet tilføjet til vaskebuffer tidligere. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil det er gennem filteret.
    5. Kassér gennemstrømnings- og centrifugeres igen ved 8.000 x g for ~ 1 min. at tømme patronen. Overføre cDNA-filter til en cDNA eluering tube.
    6. Anvende 8,5 µL pre varmede nukleasen-gratis vand til midten af filteret. Vente 2 min og centrifugeres ved 8.000 x g i ~1.5 min. Elute igen med yderligere 8,5 µL pre varmede nukleasen-gratis vand.
      Bemærk: Dobbelt-strenget cDNA gendannelsesdiskenheden bliver ~ 16 µL.
    7. Gå straks til den anden runde IVT eller fryse cDNA ved-20 ° C natten over.
  4. Udføre en anden runde af Carl produktion af IVT.
    1. Indstil hybridisering luft ovn til 37 ° C (36 ° C setpunkt).
    2. Forberede den master mix for IVT på is i følgende rækkefølge: 16 µL af den eluted dobbelt-strenget cDNA fra trin 3.3.7, tilføje 4 µL af T7 ATP løsning (75 mM); 4 µL af T7 CTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 GTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 UTP løsning (75 mM); 4 µL af T7 10 x reaktion buffer; og 4 µL af T7 enzym mix. Bland godt, spin kortvarigt for at indsamle indholdet og holde på is.
    3. Tilføje 24 µL af IVT master mix til hver tube indeholder 16 µL cDNA. Bland indholdet af pipettering forsigtigt og grundigt. Inkuber rør ved 37 ° C til 14 h.
      Bemærk: Inkubation i < 12t alvorligt påvirker udbytte.
    4. Tilsættes 60 µL af ikke-DEPC behandlet RNase-fri vand for at øge lydstyrken til 100 µL og IVT reaktionen standses.
  5. Udføre Carl rensning (anden runde).
    Bemærk: Alle centrifugations er udført på ~ 8.000 x g ved stuetemperatur. Aldrig overstige 16.000 x g for at undgå skader på filter cartridge.
    1. Begynde at varme ~ 200 µL nukleasen-gratis vand til 50-55 ° C til senere brug i en tør varme blok eller PCR-maskine. Aldrig overstige 58 ° C for at undgå delvis denaturering af Carl.
    2. Overføre Carl til en 1,5 mL nukleasen-gratis tube. Tilføje 350 µL af Carl binding buffer til hver prøve, Carl. Tilsæt 250 µL ACS grade 100% ethanol hver tube og bland 3 gange af pipettering (ikke vortex at blande og spin).
      Bemærk: RNA starter bundfældes ved tilsætning af ethanol.
    3. Overfør blandingen straks til RNA oprensning kolonne ved at tilføje det forsigtigt til midten af filter cartridge. Der centrifugeres ved 8.000 x g ~ 1 min. eller indtil blandingen er gået helt gennem filteret. Kassér gennemstrømnings- og genbruge affald collection tube.
    4. Tilføje 650 µL af wash buffer til hver filterpatron. Der centrifugeres i ~ 1 min på 8.000 x g eller indtil hele bufferen er gået. Kassér gennemstrømnings- og dreje filtre for en ekstra ~ 1 min. at fjerne spor af wash buffer.
    5. Overføre filtrene til en frisk Carl collection tube. Tilføj 100 µL forvarmet nukleasen-gratis vand til midten af filteret. Vente 2 min, derefter centrifugeres i ~1.5 min. på 8.000 x g, eller indtil det er gået.
    6. Alikvot 2 µL i et rør for spektrofotometeret (på 260 nm bølgelængde) og bioanalyzer spredt analyser til at kontrollere for Carl udbytte og kvalitet.
      Bemærk: Koncentration skal være mindst 5 ng/µL; ellers afvise prøven. Prøven kan opbevares i ~ 1 år ved-80 ° C. Undgå at fryse-optøning prøverne.
    7. Check prøver ved hjælp af en bioanalyzer til at visualisere ordentlig spredning af Carl produkter efter producentens protokol (figur 2).

4. forstærket RNA fragmentering og oprydning

  1. Bland følgende på is (samlede volumen 40 µL, kombinere 2 rør af Carl ikke-overlappende prøve stregkoder): 36 µL af Carl (200 ng alt) og 4 µL af RNA fragmentering buffer. Inkuber blanding på 94 ° C til 90 s.
  2. Straks flytte blandingen til is og tilføje 4 µL af RNA fragmentering stop buffer. Regulér lydstyrken til 100 µL ved at tilføje 56 µL nukleasen-gratis vand.
  3. Tilføje 350 µL af RLT buffer fra RNA oprensning kit (Se Tabel af materialer) og bland godt ved pipettering. Tilsæt 250 µL af EtOH, bland godt af pipettering og overføre prøven til kolonnen RNA oprensning spin. Spin for 15 s på 8.000 x g.
  4. Overfør kolonnen til nye collection tube og tilsættes 500 µL af ÅV buffer. Spin for 15 s på 8.000 x g. kassere gennemstrømnings-. Tilføje 500 µL 80% EtOH og spin for 2 min på 8.000 x g.
  5. Overfør kolonnen til en ny samling tube, åbne låget af kolonne og spin i 5 min på fuld hastighed.
  6. Overfør kolonnen til et nyt indsamling rør og elueres med 16 µL nukleasen-gratis vand, spinning på fuld hastighed i 1 minut.

5. bibliotek forberedelse

Bemærk: IVTs kan samles på dette tidspunkt, hvis der ikke er nogen overlapning i stregkoder anvendes. Fosfatase behandling tid er 40 min. Poly-nukleotid kinase behandling tid er 1 h.

  1. 16 µL af fragmenterede Carl i en 0,7 mL PCR rør, tilføje 4 µL af den følgende blanding: 2 µL af 10 x fosfatase buffer, 1 µL af Antarktis fosfatase og 1 µL af rekombinant ribonuklease-inhibitor (f.eks.RNaseOUT). Inkuber i et termisk cycler med følgende protokol: 37 ° C i 30 min, 65 ° C i 5 min, og hold på 4 ° C.
  2. 0,7 mL PCR rør fra trin 5.1, tilføje 30 µL af den følgende blanding: 17 µL nukleasen-gratis vand, 5 µL af 10 x fosfatase buffer, 5 µL af ATP (10 mM), 1 µL af rekombinant ribonuklease-inhibitor og 2 µL af PNK. Inkuber i den termiske cycler ved 37 ° C i 60 min, så hold ved 4 ° C.
  3. Udføre en kolonne oprydning af fosfatase og PNK-behandlede Carl.
    1. Justere lydstyrken til 100 µL ved at tilføje 50 µL nukleasen-gratis vand. Tilføje 350 µL af RLT buffer og bland godt. Tilsæt 250 µL af EtOH, bland godt af pipettering og overføre prøven til kolonnen RNA oprensning spin.
    2. Spin for 15 s på 8.000 x g. Overfør kolonnen til et nyt indsamling rør og tilsættes 500 µL af ÅV buffer.
    3. Spin for 15 s på 8.000 x g. kassere gennemstrømnings- og tilsættes 500 µL 80% EtOH.
    4. Spin for 2 min på 8.000 x g. overførsel kolonnen til en ny samling tube, åbne låget af kolonne og spin i 5 min på fuld hastighed.
    5. Overfør kolonnen til et nyt indsamling rør og elueres med 14 µL nukleasen-gratis vand, spinning på fuld hastighed i 1 minut til at inddrive en ~ 10 µL mængden af materiale. Kassér kolonnen. Reducere lydstyrken til 5 µL ved hjælp af et vakuum koncentrator for ~ 10 min.
  4. Ligate en 3' adapter ved hjælp af en kommerciel kit (Se Tabel af materialer).
    1. Fortynd 3' adapteren (RA3) fra TrueSeq kit 3 folder med nukleasen-gratis vand og opbevares i alikvoter ved-20 ° C.
    2. 5 µL af fosfatase og PNK-behandlede RNA, tilføje 1 µL fortyndede 3' adapter. Der inkuberes ved 70 ° C i 2 min, og derefter straks placere røret på isen for at forhindre sekundær struktur dannelse.
    3. Tilføj 4 µL af den følgende blanding: 2 µL af 5 x HM ligatur buffer (HML), 1 µL af RNase inhibitor og 1 µL af T4 RNA ligase 2 (afkortet). Inkuber i røret på den forvarmet termisk cycler ved 28 ° C i 1 time (uopvarmede eller låg er åben).
    4. Med den reaktion rør tilbage på den termiske cycler, tilføje 1 µL stopopløsning (STP) og forsigtigt afpipetteres hele diskenheden op og ned 6 – 8 gange at blandes grundigt. Fortsætte med at udruge reaktion røret på den termiske cycler ved 28 ° C i 15 min, derefter placere røret på is.
    5. Tilføje 3 µL nukleasen-gratis vand til at opnå en samlet maengde paa 12 µL. Brug 6 µL og gemme de resterende 6 µL ved-80 ° C.
  5. Udføre en omvendt transkription reaktion.
    1. Kombinere følgende i en PCR rør: 6 µL af adapter-forbundet RNA og 1 µL af RNA RT primer (RTP). Inkuber røret på 70 ° C i 2 min., så straks lægge røret på is.
    2. Tilføje 5,5 µL af den følgende blanding: 2 µL af 5 x første strand buffer, 0,5 µL af 12.5 mM dNTP mix, 1 µL af 100 mM DTT, 1 µL af RNase inhibitor og 1 µL af reverse transkriptase. Inkuber røret i forvarmet termisk cycler ved 50 ° C i 1 h, derefter placere røret på is (prøver kan opbevares ved-20 ° C).
  6. Udføre PCR-amplifikation med 11-15 cykler at berige 5', 3'-primer sammenskrevne produkt.
    1. Til hver reverse transkription reaktion, tilføje 35,5 µL af den følgende blanding: 8,5 µL af ultra rent vand, 25 µL PCR mix (PML) og 2 µL af RNA PCR primer (RP1). Til hver reaktion, tilføje 2 µL af en unikt indekseret RNA PCR primer (RPIX, X = 1 til 24).
    2. Forstærker rør i den termiske cycler ved hjælp af følgende PCR cykling betingelser: 98 ° C til 30 s; 12-15 cyklusser af 98 ° C til 10 s; 60 ° C på 30 s; 72 ° C i 30 s; 72 ° C i 10 min. hold derefter ved 4 ° C.

6. PCR produkt oprydning og størrelse udvælgelse

  1. Prewarm AmpureXP magnetiske perler ved stuetemperatur. Vortex perler indtil de er godt spredte, derefter tilsættes 50 µL til 50 µL PCR reaktion (1:1 PCR produkt: perler). Bland indholdet til ti gange blandes grundigt.
  2. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. sted på en magnetisk stå i mindst 5 min., indtil væsken vises tydeligt. Fjern og kassér 95 µL af supernatanten.
  3. Tilføje 200 µL af frisklavede 80% EtOH. Inkuber i mindst 30 s, så fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre perlerne. Gentag dette endnu en gang.
  4. Lufttørre perler i 15 min eller indtil fuldstændig tør. Resuspend med 32,5 µL af resuspension buffer. Tilsæt de hele volumen op og ned 10 gange til blandes grundigt.
  5. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. sted på en magnetisk stå i 5 min, indtil væsken vises tydeligt. Overføre 30 µL af supernatanten til en ny tube. Tilføj 20 µL nukleasen-gratis vand til at opnå en 50 µL samlede volumen.
  6. Udføre størrelse udvælgelse af PCR-produkter med faste fase reversible immobilisering (SPRI) magnetiske perler.
    1. Tilføje 0,7 x volumen (35 µL) af Sprinkler perler til røret udarbejdet i skridt 6,5 og bland grundigt af pipettering. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    2. Røret anbringes på en magnetisk stå og vente i 5 min eller indtil perlerne separat. Fjern supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre perlerne.
    3. Tilføje 200 µL af frisklavede 85% EtOH. Vente 30 s, så fjern EtOH. Lufttørre perler i 10 min.
  7. Tilføj 20 µL nukleasen-gratis vand. Læg tuben tilbage på magneten, vente i 5 min, og afpipetteres off den flydende del uden at forstyrre eller rørende perlerne. Gemme DNA ved-20 ° C.

7. bestemmelse af bibliotek mængde og kvalitet

  1. Tjek koncentrationen af DNA med et spektrofotometer ved 260 nm bølgelængde (forventede koncentration er mindst ~ 5 – 10 ng/µL).
  2. Køre 1 µL af hver prøve på en bioanalyzer ved hjælp af en højfølsom DNA-chip til at undersøge størrelsen distribution (forventet peak er på 300 – 400 bp (Se figur 3)).

8. eksempelrapport til afsendelse

  1. Kombinere ikke-overlappende sekventering PCR stregkoder (1:1 ratio). For eksempel, kombinerer PCR produkter af prøver med RPI-1 og RPI-2, RPI-3 og RPI-4 sammen i lige nanogram beløb hver, ifølge RNA sekventering core's samlede input prøve beløb krav anbefalinger.
  2. Efter sammensmeltningen, justere den samlede koncentration til 5 ng/µL og mindst en 10 µL volumen eller som anbefalet af sekventering facilitet kerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, GABAergic neuroner blev manuelt sorteret (figur 1) og RNA blev forstærket, derefter gøres til en cDNA bibliotek (figur 2) og sekventeret på høj dybde8. De forstærkede RNA (Carl) produkter varierede mellem 200 – 4.000 bp i størrelse, med et peak distribution lidt over 500 bp (figur 3A). Perle-renset cDNA bibliotek blev yderligere størrelse-begrænset af en anden runde af rensning ved hjælp af perler, der elimineres mindre fragmenter er mindre end 200 bp (figur 3B og 3 C) og med en top på ~ 350 bp. At have kortere fragmenter vil føre til tomme læser (ingen mRNA indsætter, eneste adapter og primer sekvenser), der henviser til, at længere fragmenter vil optage mere plads på flow celler, reducere alt læse output. Ved sekventering opnåede vi rutinemæssigt en 4.8 x 105 median eller 6,9 x 105 gennemsnitlige tilknyttede læser per celle (figur 4A). Efter dublerede RNA fjernelse af at bruge (UMIS) velkommen, havde hver enkelt celle en 1,0 x 105 median eller 1,4 x 105 gennemsnitlige unikke læsninger per celle (figur 4B). I hver enkelt celle eksterne RNA kontrol consortium (ERCC), blev spike-i RNA brugt som en intern kontrol, som det absolutte antal molekyler, der er føjet til prøven kan beregnes. Der var et lineært forhold af input til observerede tæller, med en hældning af 0.92 og justerede R2 = 0,94 (figur 4 c). Vi opdaget i gennemsnit ~ 10.000 gener pr. enkelt neuron (lige fra ~ 7.500 til 12.000 gener/celle), med > 95% af indre celler afsløre > 6.000 gener (figur 4D-4F). Dette tal sammenligner positivt imod offentliggjorte data fra lignende mus hjerne-afledte enkelt neuroner (fx 1.865-4,760 gener i Zeisel et al. 9, 7,250 gener i Tasic et al. 10og 8.000 gener i Okaty et al. 11). læsere er rettet til Poulin et al. 12 for en detaljeret sammenligning.

Figure 1
Figur 1 : Arbejdsgang for manuel sortering af neuroner efterfulgt af DIVA-FF. Friske mus hjerner blev indsamlet og skiver, og det pågældende område, var microdissected. Enkelt neuroner udtrykker fluorescerende proteiner blev indsamlet manuelt og forstærket med to runder af lineær forstærkning ved in vitro- transskription. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Skematisk workflow af DIVA-Seq med to runder af forstærkning samtidig indarbejde unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) eller planteforædling-tags. Prøve stregkode (SBC) gør det muligt for hver enkelt celle kan identificeres ved dens 9-nukleotid kode (Blågrøn). UMI er en strækning af tilfældige nukleotider 10 bp i længde, der er forskellige for hver primer anvendes. Under trinnet Bioinformatik vil to tilknyttede afskrifter har den samme UMI sekvens blive talt kun én gang, således at fjerne forstærkning dubletter og giver mulighed for absolut udskrift optælling. RA5 og RA3 er sekventering primere, og T7-RA5 primer er nødvendig for at føje T7 sekvenser tilbage til første runde Carl produkter, så T7 RNA-polymerase kan genbinde og udføre en anden runde af lineær forstærkning af in vitro- transskription. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Eksempel bioanalyzer parceller. (A) Carl størrelse distributioner bør være mellem 200-4.000 bp med et højdepunkt på omkring 500 bp. x-aksen har vilkårlige fluorescens enhed [FU]. (B) størrelse distribution af cDNA bibliotek produkter efter perle oprydning. (C) størrelse fordeling efter 0,7 x SPRI størrelse udvælgelse (trin 6.6) med en top omkring 350 bp.

Figure 4
Figur 4 : Eksempel sekvens læse distributioner og gen opdagelse fra manuelt sorteret neuroner efter DIVA-FF.8 . (A) i alt tilknyttet læse distribution. (B) samlede unikke læser distribution. (C) ERCC læser Vis lineær sammenhæng over 4 størrelsesordener. (D) gener opdaget vs læse tæller viser, at > 95% enkelt celler har > 6000 gener/celle. (E) gener opdaget blandt 6 interneuron typer er sammenlignelige. (F) fordeling af gener opdaget per celle, GEO tiltrædelse #GSE92522. Dette tal er blevet tilpasset fra Paul et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer Varen Koncentration Beløb (µL)
Prøvebuffer samling Rekombinant ribonuklease-inhibitor 55
ERCC 1:50K fortyndet 110
Nukleasen gratis vand 605
Alikvot 43.75 µL af ovenfor i 16 rør (2 strimler af 8; 200 µL PCR rør); tilføje efter pr tube
T7-UMI-primere (f.eks. N10B1-N10B16) 1 ng/µL 6,25 µL/rør
Endelige mængden i hver tube 50 µL (hver tube kan opdeles i 25 µL delprøver og frosset ved-80 ° C)
Løsninger: Varen Koncentration Beløb
ACSF: for at gøre 5 L opløses NaCl 126 mM 36,8 g
KCl 3 mM 1,15 g
NaH2PO4 1,25 mM 0,75 g
NaHCO3 20 mM 8,4 g
500 ml af ACSF, boble ilt for 10-15 min og derefter tilføje efter frisk hver gang:
D-glukose 20 mM 1,8 g
MgSO4 2 mM 0,5 mL 4 M lager
CaCl2 2 mM 0,5 mL 4 M lager
Holde ACSF iltet gennem out
Løsninger: Varen Koncentration
Aktivitet blocker cocktail: gøre et 100 x lager
100 mL ACSF tilføje
APV 0,05 mM
CNQX 0,02 mM
TTX 0.0001 mM (0,1 µM)
Løsninger: Varen Beløb
Protease opgaveløsning (100 mL) Protease fra Streptomyces griseus 100 mg
Føtal bovint serum: kommercielle kilde, alikvot i 500 µL til hver brug.

Tabel 1: Liste over løsninger og buffere.

Tabel 2: liste over primere og sekvenser. N10B1-N10B96 er første strand primere og T7-RA5 er den anden runde primer. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den manuelle sortering protokol er velegnet til en overvåget RNA sekventering af neuron befolkningsgrupper, som er enten sparsomt mærket i hjernen, mus eller repræsenterer en sjælden celle befolkning, som ellers ikke er muligt at studere ved hjælp af aktuelle høj overførselshastighed celle sortering og forstærkning metoder. Celler udsat for FACS normalt gennemgå kappe og prøve linje pres i rækken af ~ 9-14 psi, afhængigt af dyse størrelse og ønskede begivenhed priser. Derudover ved at blive skubbet ud fra dysen, kan cellerne lande hårdt på overfladen af collection tube eller brønde belagt med prøvebuffer forårsager indvirkning stress. Under manuel sortering, anvendes sådanne høje pres aldrig, som cellerne er suget ind i pipetten af kapillaritet og udvist af forsigtigt blæser dem ud og simpelthen bryde tips af glas pipetter. DIVA-Seq-protokollen er nyttig for RNA forstærkning fra celler med små cellulære diskenheder (< 8 µL) og lav starter materiale og konsekvent udbyttet stort antal påviselige gener (8-10 K), som, når kombineret med dyb sekventering, giver mulighed for detaljerede rekonstruktioner af en sammenhængende molekylære billede af cellulære funktioner underliggende celle identitet8,13,14. På grund af renhed af celle samling trin, høj påvisningsfølsomhed gen og evnen til at udføre absolutte molekyle tæller, er denne metode nyttig til at studere cellulær stater og sygdom Patofysiologi med stor dybde og præcision.

Mens udbyttet af forstærkede RNA og graden af genet opdagelse er forholdsvis høj i denne protokol, bidrage visse proceduremæssige foranstaltninger til at bevare konsistensen. Under anden-strand syntese, forsamling skal gøres på is, de termiske cycler skal være præ afkølede før overførsel til enheden og reaktionen skal gøres strengt ved 16 ° C (eller lidt nedenfor) for at undgå dannelsen af Hårnåle, der kan reducere Carl udbytte. Det anbefales også ikke at overstige 2 h ved 16 ° C under anden-strand syntese, og det er vigtigt at gå til cDNA rensning trin så hurtigt som muligt. Under trin IVT reducere inkubation i mindre end 12 h Carl udbytte, overstiger 14 h IVT tid kan medføre nogle Carl nedbrydning.

Vi ikke udføre en sammenlignende undersøgelse med de samme input prøve fra kuldsøskende underkastes FACS og manuel sortering ved hjælp af DIVA-Seq; dermed, vi påstår ikke, at nogen bestemt gen kategori er misregulated i FACS og ikke i manuel sortering. Både FACS og manuel sortering vil sandsynligvis indføre en vis grad af gen expression artefakter. For differential gen expression situationer, bør enhver sådan effekt i teorien udligner hinanden, som det vil være manifesteret i både kontrol- og prøve grupper. For nylig, en cocktail af transskription hæmmere er benyttet til at forhindre aktivering af umiddelbar tidlige genekspression, og sådanne foranstaltninger kan også integreres til denne protokol15.

Den manuelle sortering proces er blid og hurtigere (som regel 90-160 min.) i forhold til FACS (undtagen prøve forberedelse gange) der kræver tæthed gradient centrifugering, farvning med levedygtighed, cytotracker farvestoffer, og efter sortering visualisering. Manuel sortering, underkaste cellerne ikke til høje kappe pres og indvirkning stress ved sortering på brønde. Det giver også næsten konstant adgang til iltet ACSF og samlet giver en gæstfri og mindre stressende sortering miljø, som kan være afgørende for celler, der er følsomme over for stress som hurtig spiking celler med høje metaboliske krav. I DIVA-Seq i øjeblikket kan op til 96 celler være multipleksede for at gemme reagens omkostninger og give absolut mRNA tælle med høj gen tæller pr. celle.

Der er dog ulemper til denne metode; for eksempel, manuel sortering behov pålidelige fluorescently mærket celler som en start befolkning. Det er i sagens natur en lav-overførselshastighed proces, med hver sortering session giver 32-64 celler på sit maksimum, som er betydeligt lavere end i FACS. Manuel sortering også kræver finmotorik og nogle praksis at manipulere glas pipetter under et mikroskop for dissektion og fange enkelt celler i microcapillary pipetter. DIVA-Seq forstærkning er 3'-partisk; Derfor, det kan ikke bruges til hele transkriptom forstærkning og er heller ikke egnet til splice isoform påvisning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01-Z.J.H.), CSHL Robertson neurovidenskab fond (til Z.J.H.) og en NARSAD Post-Doctoral Fellowship (til A.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Tags

Neurovidenskab spørgsmål 140 manuel sortering neuron encellede RNA sekventering DIVA-FF. in vitro transskription lineær forstærkning unikke molekylære id (UMI)
Encellede RNA sekventering af Fluorescently mærket mus neuroner ved hjælp af manuel sortering og dobbelt <em>In Vitro</em> transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell… More

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter