Summary
Målet med denne protokollen er å isolere epidermal keratinocytter fra rygg huden til voksne mus for en rekke nedstrøms anvendelser som molekylærbiologi, biokjemi, fluorescens aktivert celle sortering og primær in vitro-bruk (f.eks. clonogenic keratinocytter).
Abstract
Protokollen er beskrevet her er en pålitelig metode for høsting primære keratinocytter fra voksne kvinnelige mus (54 ± 2 dager gamle) gir ca 30 x 106 levedyktige celler per mus. Primær voksen mus keratinocytter er høstet fra rygg hud av kvinnelige mus. Mannlige mus (~ 6 uker gammel) kan brukes til Keratinocyte høsting avhengig av kravene i eksperimentet. Euthanized mus er barbert og sterilisert med seriell vasker i povidon jod og etanol løsninger (70% alkohol). Etter desinfisering av mus, er rygg hud fjernet og subkutan fett og muskler er fjernet med en skalpell og forkastet. Skinnene er skåret i små biter og behandlet med en mild, lav temperatur trypsinization å løsne de nedre dermis fra epidermis. De skrapte epidermises blir rørt ved lav hastighet, filtrert for å fjerne hårene, telles, og re-suspendert i kultur medium. Denne metoden gir en utmerket enkelt celle suspensjon av svært culturable celler for mange nedstrøms applikasjoner.
Introduction
Pattedyr huden dekker hele kroppen og serverer en rekke funksjoner (f. eks, en primær fysisk barriere, temperaturregulering, og fuktighet oppbevaring). I løpet av de siste fem ti årene, grunnleggende forskning på musen huden har gitt ny informasjon om struktur og funksjon av huden. Musen huden modellen har i stor grad bidratt til forståelse av grunnleggende biologi bak de komplekse molekylære mekanismer av kjemisk eller ultrafiolett stråling-indusert kreft. Disse mus hud modeller gitt et betydelig bidrag til forståelse av menneskelige hudsykdommer og deres utslippsreduksjoner. For å utforske videre molekylær Disseksjon av den primære keratinocytter i hårsekken utviklingsmessige biologi, stilk cellen forskning, kreft, og genetisk utforskning av epidermis, er det ofte ønskelig å isolere og kultur primære epitel keratinocytter fra mus huden til bruk parallelt med in vivo eksperimenter. Den motiverende faktoren i utviklingen av denne metoden var behovet for en in vitro-analysen for clonogenic epidermal og hårsekken stamceller1,2. Det var også et presserende behov for enkelt celle suspensjoner av epidermal celler egnet for clonogenic analyser3, fluorescens aktivert celle sortering, og flyt flowcytometri3,4. Fordelene med denne metoden er en robust avling øke en størrelsesorden over andre metoder5,6, inkludering av epitel delen av hårsekkene, og den høye culturability av høstes celler. På 1980-tallet fantes det ingen kjente metoder som kunne oppfylle disse kravene. I de påfølgende årene, denne metoden ble raffinert for å øke celle yield. Den viktigste begrensningen av denne metoden ville være maskering av noen Trypsin følsomme antistoffer som ville kompromittere immunoreactivity6.
Musene fikk husdyrhold i henhold til spesifikke patogen gratis retningslinjer. En til fem kvinnelige mus 54 ± 2 dager av alder ble innhentet. I eldre mus, levedyktigheten av keratinocytter vil bli redusert på grunn av anagen fase (vekst) av hår syklusen. Dessuten er prosessen med trypsinization vanskeligere sammenlignet med unge mus. Den høsting prosedyren har blitt optimalisert for den tynnere huden av kvinnelige mus sammenlignet med mannlige. Mannlige mus er vanligvis ikke brukes til Keratinocyte avlinger som de har en tendens til å kjempe med hverandre under bolig og derfor kan etterlate riper eller sår på huden.
Protocol
Alle virveldyr dyr bruker protokoller har blitt godkjent av University of Minnesota institusjonelle Animal Care og bruk komiteen i samsvar med anbefalte NIH og regjeringens retningslinjer.
1. mater Layer initialisering og Subculturing
- Tin ett celle hetteglass med frossen sveitsisk mus 3T3 fra den flytende nitrogen tanken ved å plassere hetteglasset i et vannbad på 37 ° c i 1-2 min. Antall celler i hetteglasset er ca. 1 x 106.
- Fjern 3T3 i hetteglasset når den siste fliken av isen har smeltet. Tørk av røret med en 70% alkoholserviett. Deretter overfører du hetteglasset til et biosafety skap.
- Overfør cellene langsomt til en T-150 kolbe, og skyll 3T3 hetteglasset med 1 mL CGM medium. Sakte legge til 30 mL av pre-varmet 3T3 komplett vekst medium (CGM) til cellene. Forsiktig rock flasken å jevnt spre 3T3 Fibroblast celler. Etiketten flasken med cellelinje detaljer, dato og passasje nummer hensiktsmessig.
- Ruge cellene ved 37 ° c med 5% CO2 og 95% fuktighet.
Merk: Ifølge ATCC, dobling tiden av sveitsisk mus 3T3 er 18 h; Når confluent (kontakt hemmet), er tettheten ca 40 000 celler per cm2. Vi bruker en bestemt linje av 3T3 innen 10-15 passasjer etter initialisering. Mer rask vekst eller tilstedeværelsen av spindel-formede celler kan forekomme ved høyere passasjer og er vanligvis et tegn på at 3T3 ikke vil utføre så vel som mater celler for voksen mus keratinocytter. Hvis rask vekst oppstår, er det bedre å starte en ny linje fra lavere passasje celler. - Endre Media etter 24 h for å fjerne døde celler og resterende DMSO (kryonisk bevaring agent), og to ganger ukentlig etterpå. Tillat celler til å spre rundt 80% samløpet og bruke T-150 flasker for kultur innvielse. Bruk T-225 flasker for under kultur etter initialisering.
- Til under kultur 3T3 Fibroblast celler, fjerne flasken fra cellen kultur inkubator og vask to ganger med kald steril PBS (1x) med Gentamycin. Pipet 10 mL pre-varmet (37 ° c vannbad) Trypsin oppløsning (0,25%) i hver T-225 kolbe.
- Plasser flasken på en varmende plate i 3-8 min. Fjern flasken og forsiktig bruk håndflatene til å tappe veggene i flasken for å løsne celler og bekrefte celle avløsning under invertert mikroskop. Trypsin løsning kan virke skyet med frittliggende 3T3 celler.
- Pipet den Trypsin løsningen 3 – 4X for å vaske cellevekst overflaten på flasken og overføre den trypsinized cellen til 30 mL CGM i et 50 mL konisk rør. Rewash flasken 3 – 5x med 10 mL av CGM-Trypsin i celle blandingen fra 50 mL konisk slange.
Merk: Innholdet av to kolbe innholdet kan legges til en 50 mL tube; Hvis bare én kolbe brukes, plasser deretter 10 mL Trypsin/celler i 20 mL CGM i et 50 mL rør. - Sentrifuger 50 mL konisk rør ved 160 x g i 7 min ved 4 ° c.
- Nå aspirer supernatanten og resuspend celle pellet med 5 mL CGM, pipettering forsiktig ~ 10x å fullstendig forstyrre cellen pellet. Tilsett 10 mL CGM for å bringe det totale volumet av 50 mL konisk rør til 15 mL.
- Bland igjen ~ 10x og plassere 5 mL av cellen suspensjon i 3 separate T-150 flasker. Under kultur forholdet er 1:3 i T-225 flasker eller 1:4 i T-150 flasker. Tilsett 30 mL pre-varmet 3T3 CGM til hver av flaskene.
- Merk flasken med cellelinje navnet, datoen for celle seeding og passasje nummeret.
- For å fryse ned 3T3 celler etter sentrifugering i under kultur trinn, Fjern 50 mL røret fra sentrifuger og Legg på en is bøtte. Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet med 1 mL 5% DMSO-DMEM blanding (se tabell 1) for hver kolbe høstes.
- Plasser 1 mL DMSO-DMEM blanding med celle fjæring i hver cryovial (en cryovial per 3T3 kolbe høstes). Merk hetteglasset med passasje nummeret, cellelinje navnet (3T3) og datoen da cellene ble frosset.
- Plasser disse 3T3 i celle fryseboks (se tabell over materialer) og Overfør til-70 ° c fryser til > 5 timer. forsiktig fjerne og overføre hetteglassene fra cellen fryseren jar og plass i en flytende nitrogen lagertank for langtidslagring til neste bruk . Angi informasjon om cellelinje navnet, plasseringen i beholderen og datoen i lager arket for laboratorie væske nitrogen.
2. utarbeidelse av 3T3 mater lag for røntgen bestråling og seeding
- Forbered 3T3 celler en uke før bestråling deres og tillate dem å vokse ~ 100% samløpet. De 3T3 cellene er vanligvis innenfor passasjer av 120 til 130.
-
For vellykket clonogenic analyser av primære keratinocytter, før seeding 3T3 celler, overflate pels på 60 mm Petri retter med et kollagen.
- Pipet rundt 2 – 3 mL av kollagen-belegg løsningen i 60 mm Petri retter til pels bunnen og fjerne overflødig kollagen-belegg væske (se tabell 1). Overfør Petri retter til en 37 ° c inkubator med 5% CO2 i minst 1 time. Ikke la rettene tørke i inkubator.
- X-ray bestråling trinn: Følg trinn 1.4 – 1.6. Bruk 50 mL fersk CGM til å suspendere celle pellet, lukke konisk rør og forsegle med parafin tetnings film. For å unngå forurensning, bruk plastposer til å doble posen parafin-lukket celle som inneholder rør og plass på isen. En mitomycin basert alternativ mater lag kan brukes for Keratinocyte kultur7.
-
Irradiate Fibroblast 3T3 celler i 50 mL konisk rør med en 5 000 rads (50 CGY) dose med en biologisk røntgenmaskin. Irradiate disse cellene sammen med CGM-mediet.
- Etter røntgen bestråling, sentrifuge celler ved 160 x g i 7 min ved 4 ° c. Aspirer supernatanten Media og forsiktig resuspend celle pellet med 5 mL CGM triturating forsiktig ~ 10x. Nå bringer det endelige volumet til 30 mL med ytterligere 25 mL middels og triturate 10x. Disse triturating trinnene er avgjørende for uniform 3T3 Fibroblast lag for clonogenicity analysen.
- Levedyktig celle telling: telle keratinocytter ved hjelp av en vanlig glass hemocytometer. Ta ca 0,5 mL av cellene og plasser den i et 1,5 mL rør. Fjern 200 μL av celle blanding og tilsett et lik volum på 0,4% Trypan blå oppløsning og blanding 3 – 4X. Overfør celler med en hemocytometer og telle alle kjerne celler (små gull og rosa celler) som levedyktige celler. Beregn den endelige konsentrasjonen av levedyktige gull celler.
- Pipette 1 x 106 3T3 celler (minimum 7 x 105) celler kan brukes) i 60 mm kollagen-belagt Petri retter (trinn 2,2) og forsiktig legge til 4 ml modifisert høy kalsium Williams E Media (se tabell 1). Tillat friske seeded 3T3 celler til å feste i 24 h. På den neste dagen, høste den friske primære Keratinocyte og frø dem på toppen av festet 3T3 Fibroblast lag for clonogenic analysen som angitt nedenfor.
3. primær Keratinocyte høsting og seeding
- Euthanize fire til fem voksne kvinnelige mus via CO2 inhalasjon i henhold til godkjente dyr FACILITY/IACUC standarder. Denne protokollen kan imidlertid også brukes for enslige kvinnelige/mannlige mus.
- Clip ca 9 cm2 av rygg pels med en elektrisk dyr Clipper og plassere alle klippet mus i en 500 ml krukke med nok povidon jod antiseptisk løsning (ikke skrubb) for å dekke dem for 1-2 min. rist glasset godt å jevnt coat den antiseptisk løsning over musene.
- Hell av løsningen og skyll med rent vann til væsken renner klart. Gjenta samme antiseptisk vask etterfulgt av en vann skyll. Etter antiseptisk vask med jod løsning, suge alle musene i 70% etanol i 5-10 min.
Merk: Mus med lys pels (f. eks, BALB/c) vil beholde en svak gulaktig farge fra antiseptisk jod vasker, mens mørkere mus (f. eks, C57BL/6) vil ikke. Spesielt, celle levedyktighet eller kultur vekst påvirkes ikke på grunn av den gule fargen.
- Forsiktig fjerne klippet rygg hud ved hjelp av tommelen tang og saks i en laminær Flow hette. Plasser den excised rygg huden i konisk rør fylt med PBS/2x Gentamycin. Unngå å bruke ventrale hud for å forhindre bryst celle forurensning i kulturen.
- Bruk autoklaveres tang og en skalpell, Legg en rygg hud om gangen hårete side ned på en tynn Petri parabolen. Begynn å skrape alle subkutant vev inkludert fett fra ventrale siden av hud vevet til det er halvt gjennomskinnelig. Prøv å fjerne maksimalt spor av under Huds vev uten å rive huden (hårsekken del). Også, ikke skrape i lang tid og unngå hud tørking.
- Hold skrapet huden i PBS løsning til alle andre gjenværende skins er behandlet. Ved hjelp av en skalpell, Slice skins inn 0,5 cm x 1-1,5 cm strimler og plassere den hårete side opp på en steril Petri parabolen.
- Pipette forsiktig 20 mL PBS/2x Gentamicin løsning blandet med Trypsin (0,25%) inn i en 100 mm x 20 mm plastikk Petri parabolen. Ved hjelp av steril tang, overføre skins og flyte dem hårete side opp på overflaten av Trypsin løsning for 2 t i en 32 ° c inkubator.
Merk: Trypsinization tid og temperatur er avgjørende for god utbytte av høyt culturable primære keratinocytter. Selv om andre metoder kan gi god avkastning av levedyktige celler, har culturability av keratinocytter vært mindre tilfredsstillende.- I løpet av denne 2 h inkubasjonstid, frakk retter med kollagen belegg og plassere dem ved 37 ° c for 1 t (se trinn 3.1.2). For clonogenic analyser, den 60 mm Petri retter har allerede vært belagt 24 h før Keratinocyte høsting å tillate bestrålt 3T3 mater laget for å feste til bunnen og spre jevnt.
Merk: Coating av kultur retter for clonogenic kultur er svært viktig for riktig vedlegg, koloni formasjon, og endelig vekst/spredning av mus epidermal keratinocytter.
- I løpet av denne 2 h inkubasjonstid, frakk retter med kollagen belegg og plassere dem ved 37 ° c for 1 t (se trinn 3.1.2). For clonogenic analyser, den 60 mm Petri retter har allerede vært belagt 24 h før Keratinocyte høsting å tillate bestrålt 3T3 mater laget for å feste til bunnen og spre jevnt.
- Epidermal skraping trinn: arrangere en steril plast kvadrat Petri parabol og skape en overflate ved en 30 ° skråning for riktig epidermal skraping med 15 mL høsting medium (se tabell 1). Forsiktig fjerne en flytende hud stripe fra Trypsin løsning med buet tang. Med en ny skalpell blad, skrape av epidermis og hår inn i mediet.
- Ikke bruk overdreven kraft, men bruk tilstrekkelig kraft til å skrape epidermis, eller det vil påvirke cellen levedyktighet.
- Under epidermis skraping, holde bladet vinkelrett på huden stykke. Hvis bladet er vinklet mot bevegelsen av bladet, er det flere sjanser for huden rive. Hvis bladet er vinklet bort fra bladet bevegelsen, er det flere sjanser for utilstrekkelig epidermis fjerning.
- Forsiktig helle høsting medium som inneholder skrapet epidermal celler til en steril 60 mL krukke (autoklaverbar og gjenbrukbare) med en 1,5 tommers magnetisk røre bar. Skyll Petri parabolen med ekstra høsting medium for å samle gjenværende epidermal celler og bringe det endelige volumet til 30 mL. Bruk en magnetisk rører og rør på 100 RPM i 20 min ved romtemperatur. Denne prosessen vil fjerne de fanget epidermal cellene fra hår.
- Plasser en steril celle sil 70 μm på toppen av et 50 mL konisk rør. Celle sil passer på toppen av en 50 mL konisk rør.
- Ta glasset inne i en biosafety hette. Fjern rør stangen og hell innholdet i filterfestet til et 50 mL konisk rør. Sil ut uønsket hår og ark av stratum corneum.
- Trykk hårene sammen med stratum corneum materialer i sil og manipulere dem til å løsne de fanget hårcellene. Bruk 5 mL høsting medium for å tillate gjenværende fanget celler for å løsne og strømme inn i røret. Bring det totale volumet opp til 50 mL i konisk rør.
- Cap 50 mL konisk slange med celle Filtrer og sentrifuge ved 160 x g i 7 min ved 4 ° c. Neste aspirer supernatanten og tilsett 5 mL høsting medium. Resuspend celle pellet ved å triturating forsiktig ~ 20x med en 5 mL Pipet.
- På dette trinnet holder du cellene i en kjøleskapet for å unngå aggregering. Tilsett 25 mL høsting medium og triturate igjen (20 – 25x).
- For å sikre en nøyaktig Keratinocyte telle på dette trinnet, ta 1 mL av celle suspensjon og tilsett 19 mL høsting medium. Nå celle fortynning er 1:20 i 50 mL konisk rør. Hvis keratinocytter høstes fra en enkelt mus, justerer du volumet på celle fjæringen. I stedet for 30 mL, bruk 15 mL og lag en 1:10 fortynning for å telle cellene.
- Pipet 0,5 mL av fortynnede celler fra 50 mL konisk rør (1:20 fortynning) og overføres til en 1,5 mL autoklaveres mikrosentrifugen rør. Fjern 0,2 mL (200 μL) av celle blandingen til en annen 1,5 mL mikrosentrifugen rør og tilsett et lik volum (200 μL) av 0,4% Trypan blå oppløsning. Bland denne løsningen forsiktig 3x og Overfør celler til en hemocytometer for telling av kjerne keratinocytter.
- Score alle mørkeblå celler positive for Trypan blå som ikke-levedyktige døde celler, og scorer små gull og rosa celler som levedyktige celler. Den endelige Keratinocyte yield per mus bør være rundt 30 000 000 levedyktige celler.
- Sentrifuger den opprinnelige 50 mL konisk rør (fra trinn 3,8) i 7 min ved 160 x g ved 4 ° c. På dette trinnet, resuspend cellene i ønsket medium og gjøre de nødvendige fortynning for seeding celler.
- For massekulturen, frø 2 til 4 000 000 levedyktige gull celler i hver 35 mm Petri parabol i cellekultur medium (KGM-type medium + kosttilskudd for monolag kulturer) (se tabell 1). For en clonogenic (koloni formasjon) analysen, frø 1 000 celler per 60 mm Petri parabolen på X-ray bestrålt sveitsiske musen 3T3 mater lag med kollagen-belegg og modifisert William ' s E medium med kosttilskudd og serum.
- Bruk til sammen 2 til 4 mL medium for 35 mm og 60 mm Petri retter, henholdsvis. Også formulere DMEM og Williams E medium anskaffet fra ATCC med reduserte nivåer av natrium bikarbonat for bruk på 5% CO2.
- Dyrke kultur celler (masse eller clonogenic) ved 32 ° c, 95% luftfuktighet med 5% CO2. Endre Media en dag etter første seeding for masse kultur, og deretter 3x ukentlig etterpå. Men for klonal analyser, den første medium endring er 2 dager etter celle seeding og 3x ukentlig etterpå.
- For klonal kultur, dyrke celler på to-og fire-ukers intervaller. Etter fullføring av klonal kulturer (2 eller 4 uker), aspirer mediet. Fest koloniene i 10% bufret formalin over natten ved romtemperatur og beis med 0,5% rhodamine B i autoklav vann for 1 t. Deretter fjerner du rhodamine B-flekken med en pipette fra kanten av rettene.
- Skyll rettene i kaldt autoklaveres vann til rettene løpe klart. Sett rettene tilbøyelig på lokket av rettene og la dem tørke for endelig koloni telling. Spesielt når du utfører clonogenic kultur analysen, aldri Pipet < 1 mL celler. Hvis cellene er konsentrert, serielt fortynne celle konsentrasjonen.
Representative Results
Vanligvis er rentene av epidermal keratinocytter per mus varierer fra 20 x 106 til 30 x 106 Trypan blå eksklusive celler er oppnådd8,9. Levedyktigheten varierer fra 80%-90%. Typisk seeding effektivitet er rundt 30% vedlegg ved 24 h. Colony formasjon på bestrålt 3T3 mater lag er rundt 60 kolonier per 1 000 levedyktige celler seeded for C57BL/6 mus, og ca 30 kolonier per 1 000 celler for Swiss-type mus10 ,11. Typiske resultater fra analyser av koloni formasjonen er illustrert i figur 1. Antall hårsekken stamceller er ca 9% CD34+/CD49f+ stamceller for C57BL/6 mus12. Typiske resultater fra strømnings flowcytometri er gitt i figur 2.
Vekst egenskapene til fire forskjellige medier er illustrert i Figur 3. Mediene testet inkluderer KGM-Gold, SFM, William ' s E medium, og Morris-2 (en redusert kalsium medium utviklet i Morris laboratorium basert på Williams E).
Figur 1: representative eksempler fra en analyse for clonogenic keratinocytter fra voksen mus. Dette fotografiet demonstrerer Keratinocyte koloni formasjon fra CD-1 kvinnelige mus 54 dager av alder behandlet lokalt med 1) ingen behandling, 2) aceton fulgte en uke senere av aceton to ganger ukentlig i to uker, 3) DMBA fulgte en uke senere av aceton to ganger ukentlig for to uker, 4) aceton fulgte en uke senere av TPA to ganger ukentlig i to uker, og 5) DMBA fulgte en uke senere av TPA to ganger ukentlig i to uker. Etter deres in vivo behandlinger, ble keratinocytter høstet og seeded på 1 000 celler per tallerken på mater lag av bestrålt 3T3, og kultivert i to uker, hvoretter rettene ble fikset med bufrede formalin og beiset med rhodamine B. Rettene i hver kolonne er replikeres fra hver muse behandlingsgruppe. Merk at antall større kolonier økte ved behandling med DMBA, og det totale antall kolonier økte TPA-behandlingen av musene før Keratinocyte innhøsting. Forkortelser: DMBA: 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativt eksempel på flyt flowcytometri av hårsekken stamceller fra voksen mus. Kort sagt, den isolerte primære keratinocytter ble isolert fra rygg mus hud og filtrert for mobilnettet rusk ved hjelp av celle filter. Den isolerte Keratinocyte suspensjonen ble merket med CD49f eller α6-integrin (PE) og CD34 (FITC) antistoffer sammen med levende døde fargestoff og andre kontroller. FITC og PE isotype kontroll antistoffer (Rat IgG2akappa) ble brukt til kompensasjon formål (se tabell over materialer). Stamceller ble valgt ved hjelp av CD49f (PE kanal), som anerkjente den eksterne komponenten av hemi-desmosomes funnet på basal epidermal og hårsekken celler, og CD34 (FITC kanal), som anerkjente hårsekken stamceller (dvs. CD34-FITC+ og a6-PE+ (øvre høyre kolonne, totalt 5%)). Høyre kolonne viser de forskjellige Keratinocyte populasjoner nemlig CD34-FITC bare, CD34-FITC og a6-PE celler (dobbel positiv stilk cellen befolkning), A6-PE bare, og unstained celler. Merk at det er to CD34+ Stamcelle populasjoner som er rapportert6,14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av fire forskjellige medier på primære kulturer av epidermal celler fra voksne kvinnelige mus. Primær keratinocytter ble isolert fra rygg mus huden og telles for seeding ved hjelp av fire forskjellige medier (KGM, SFM, Willem ' s-E og Morris-2). Lik antall keratinocytter ble sådd og fulgt for deres generelle morfologi og vekstmønster. Merk at voksende keratinocytter har litt forskjellige morfologier. KGM, SFM, og Morris-2 som alle er redusert kalsium Media har den mest robuste veksten etter fjorten dager. I kontrast, cellene ikke vedvarer når kultivert i Williams E medium som har 1,4 mM kalsium og et høyt forhold av kalium til natrium. Overraskende, Williams E medium med kosttilskudd og tjue prosent Foster storfe serum støtter Keratinocyte klonal kulturer langt bedre enn noe annet medium testet, sannsynligvis fordi beriket Williams E medium hjelper 3T3 mater celler til "feed" bedre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsninger og Media | Kommentarer |
| Høsting Solutions | |
| 2,5% Trypsin (5 mL) | |
| Dulbecco ' s PBS (500 mL) | |
| Gentamycin (2 mL) | |
| PBS med 2x Gentamycin (45 mL) | |
| Fosfat-bufret saltvann (PBS) med 2x Gentamycin | |
| Trypsin løsning | |
| Cell kultur løsninger | |
| Purecol-fibronektin parabol-belegg løsning: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Storfe serum albumin 1,0 mg/mL (10 mL) | |
| Cellekultur medium (100 mL) | |
| Fibronektin (1 mg) | |
| Purecol kollagen (1 mL) | |
| Løsning for celle frysing | |
| DMSO (2 mL) | |
| DMEM med 10% BCS og penn-strep | |
| Høsting medium | Må være uten kalsium |
| 2x Gentamycin (1 mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| SMEM (500 mL) | |
| High-kalsium Williams ' E Media med: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| Glutamin 14,5 mL | |
| Hydrocortisone (1 mg/mL) 0,5 mL | |
| Insulin 1 mL | |
| LinoAcid-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL | |
| MEM ess AminoAcids 4 mL | |
| MEM vitaminer 5 mL | |
| Penicillin-Streptomycin 5 mL | |
| Transferrin (5 mg/mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg/mL (4 ° c) 3,5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL | |
| 3T3 Fibroblast komplett vekstmedium (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penicillin-Streptomycin (10 mL) | |
| KGM | Medium brukt for masse kultur er en redusert kalsium medium |
| Morris 2 medium med samme kosttilskudd som Williams ' E | En redusert kalsium variant av Williams E med kosttilskudd |
Tabell 1: Løsnings-og medie oppskrifter.
Discussion
Den Keratinocyte høsting metoden beskrevet her ble utviklet for å produsere høy avkastning av høyt culturable primære epidermal keratinocytter fra baksiden av voksne kvinnelige mus. Disse keratinocytter er egnet for Flow flowcytometri, molekylærbiologi program, og primær cellekultur, inkludert clonogenic analysen rapportert her. Dette Keratinocyte høsting metoden har også vært nyttig for å studere andre nedstrøms aspekter av hud kjemiske kreft og tumor forfremmelse1,13.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. Først, for rigor og reproduserbarhet, kvinnelige mus av alder 54 ± 2 dager ble brukt. Dette har gjort det mulig for oss å utføre følsomme og kvantitative koloni analyser fra flere mus stammer og bruke dem som en fenotype i koblings analyse som fører til identifisering av minst én ny stilk cellen Regulatory gen10,11. For det andre er det nyttig å kutte skins i mindre biter, som trypsinization er mer effektivt enn å prøve å holde huden hel. For det tredje er tiden og temperaturen i Trypsin flyte svært viktig for den påfølgende culturability. Videre må man "rote betraktelig" på hårene som gjenstår på filteret for å løsne de vedlagte cellene. Dette trinnet er viktig å oppnå høy avkastning av celler. Videre er 32 ° c temperatur av inkubator viktig for lengre sikt dyrking av keratinocytter fra voksne mus. Til slutt, i denne protokollen, er parallell readouts av in vitro og in vivo eksperimenter1 basert på primære kulturer i stedet for subkulturer eller cellelinjer. Spesielt hvis høsting primære keratinocytter for første gang ved hjelp av denne protokollen, holde de resterende dermis etter skraping å bekrefte full fjerning av hårsekkene sammen med epidermis ved histopathological observasjon.
Den viktigste styrken i denne protokollen for høsting voksen mus keratinocytter er at den produserer høy avkastning av culturable celler som er egnet for mange nedstrøms applikasjoner. Det Chief begrensningen er det alt noe cellen overflate epitopes kanskje være følsom å trypsinization slik det immunostaining kanskje være kompromittert. Derfor, når du tester en ny celle overflate antistoff, kan det være klokt å bruke en dispase6 eller thermolysin5 basert metode for høsting for sammenligning. Betydningen av denne protokollen er at den har blitt grundig testet, kvantifisert, og brukes på slike ulike anvendelser som analyser for clonogenic stamceller1,9,10,11, for masse kulturer i biokjemi8, for FACS sortering i Stamcelle analyse3,4, for molekylærbiologi3,12, og for pågående RNA og DNA-sekvensering.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
