Summary
Målet med detta protokoll är att isolera epidermal keratinocyter från den dorsala huden hos vuxna möss för en mängd olika nedströms tillämpningar såsom molekylärbiologi, biokemi, fluorescens aktiverad cell sortering, och primära in vitro-användning (t. ex., klonogena keratinocyter).
Abstract
Det protokoll som beskrivs här är en tillförlitlig metod för skörd primära keratinocyter från vuxna honmöss (54 ± 2 dagar gamla) ger cirka 30 x 106 livskraftiga celler per mus. Primära vuxna mus keratinocyter skördas från dorsala huden av honmöss. Manliga möss (~ 6 veckor gamla) kan användas för keratinocyt skörd beroende på kraven i experimentet. Euthanized möss är rakade och steriliseras med seriella tvättar i povidon jod och etanol lösningar (70% alkohol). Efter desinfektion av möss, rygg huden avlägsnas och subkutant fett och muskler avlägsnas med en skalpell och kasseras. Skinnen skärs i små bitar och behandlas med en mild, låg temperatur trypsinization att lossa den nedre dermis från epidermis. Den skrapade epidermises rörs vid låg hastighet, filtreras för att ta bort hårstrån, räknas och återsuspenderas i odlingssubstrat. Denna metod ger en utmärkt enda cellsuspension av mycket odlingsbara celler för många nedströms applikationer.
Introduction
Däggdjur huden täcker hela kroppen och serverar en mängd funktioner (t. ex. en primär fysisk barriär, temperaturreglering, och fukt retention). Under de senaste fem decennierna har grundforskning på mus hud gett ny information om hudens struktur och funktion. Musen hud modell har kraftigt bidragit till förståelsen av den grundläggande biologi bakom komplexa molekylära mekanismer för kemisk eller ultraviolett strålning-inducerad carcinogenes. Dessa mus hud modeller gav ett betydande bidrag till förståelsen av mänskliga hudsjukdomar och deras lindring. För att utforska ytterligare molekylär dissektion av den primära keratinocyter i hårsäcken utvecklingsbiologi, stamcellsforskning, carcinogenes, och genetisk utforskning av epidermis, det är ofta önskvärt att isolera och kultur primära epitelial keratinocyter från möss huden att använda parallellt med in vivo experiment. Den motiverande faktorn för att utveckla denna metod var behovet av en in vitro-analys för klonogena epidermal och hårfollikelstamceller1,2. Det fanns också ett brådskande behov av enstaka cellsuspensioner av epidermal celler som lämpar sig för klonogena analyser3, fluorescens aktiverad cell sortering, och flödescytometri3,4. Fördelarna med denna metod är en robust skörd öka en storleksordning över andra metoder5,6, införande av epiteliala delen av hårsäckarna, och den höga culturability av de skördade cellerna. På 1980-talet fanns det inga kända metoder som kunde uppfylla dessa krav. Under de följande åren har denna metod förfinats för att öka cell utbytet. Den huvudsakliga begränsningen av denna metod skulle vara maskering av vissa trypsin känsliga antikroppar som skulle äventyra immunoreaktivitet6.
Mössen fick djurhållning enligt de särskilda patogenfria riktlinjerna. En till fem honmöss 54 ± 2 dagars ålder erhölls. Hos äldre möss, lönsamheten av keratinocyter kommer att minskas på grund av anagen fas (tillväxt) av hår cykeln. Också, processen för trypsinization är svårare jämfört med unga möss. Skördeprocessen har framgångsrikt optimerats för den tunnare huden hos honmöss jämfört med manliga. Manliga möss är i allmänhet inte används för keratinocyter skördar eftersom de har en tendens att slåss med varandra under huset och därför kan lämna repor eller sår på huden.
Protocol
Alla djur användnings protokoll för ryggradsdjur har godkänts av University of Minnesota institutionella djuromsorg och användning kommitté i enlighet med rekommenderade NIH och regeringens riktlinjer.
1. initiering av matar skikt och Subculturing
- Tina en cell flaska innehållande fryst schweizisk mus 3T3 från flytande kväve tanken genom att placera injektionsflaskan i en 37 ° c vattenbad för 1-2 min. Antalet celler i injektionsflaskan är cirka 1 x 106.
- Ta bort 3T3-cell flaskan när den slutliga Sliver av is har smält. Torka av röret med en 70% sprittork. Överför sedan injektionsflaskan till ett biosäkerhetsskåp.
- Överför cellerna långsamt till en T-150-kolv och skölj injektionsflaskan med 3T3 med 1 mL CGM-medium. Tillsätt långsamt 30 mL förvärmda 3T3 komplett odlingssubstrat (CGM) till cellerna. Häll försiktigt kolven så att 3T3 fibroblastcellerna fördelas jämnt. Märk kolven med cell linjens detaljer, datum och passage nummer på lämpligt sätt.
- Inkubera cellerna vid 37 ° c med 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
Anmärkning: Enligt ATCC är fördubblings tiden för schweizisk mus 3T3 18 h; När konfluenta (kontakt hämmade), tätheten är ca 40 000 celler per cm2. Vi använder en viss rad av 3T3 inom 10-15 passager efter initiering. Snabbare tillväxt eller närvaron av Spindelformade celler kan förekomma vid högre passager och är vanligtvis ett tecken på att 3T3 inte kommer att utföra samt Feeder celler för vuxna mus keratinocyter. Om snabb tillväxt sker, är det bättre att initiera en ny linje från nedre passage celler. - Ändra media efter 24 h för att ta bort döda celler och resterande DMSO (cryopreservation agent), och två gånger i veckan därefter. Tillåt celler att förgöra runt 80% sammanflödet och använda T-150 kolvar för kultur initiering. Använd T-225 kolvar för subkultur efter initiering.
- För subkultur 3T3 fibroblastceller, ta bort kolven från cellkulturen inkubator och tvätta två gånger med kall steril PBS (1x) med gentamycin. Pipet 10 mL förvärmd (37 ° c vattenbad) trypsin lösning (0,25%) i varje T-225 kolv.
- Placera kolven på en uppvärmnings platta i 3-8 min. ta bort kolven och Använd försiktigt handflatorna för att knacka på kolvens väggar för att lossa celler och bekräfta cell avlossning under inverterat Mikroskop. Trypsin lösning kan visas grumlig med fristående 3T3 celler.
- Pipet den trypsin lösning 3-4x att tvätta celltillväxt ytan av kolven och överföra trypsinized cellen till 30 mL CGM i en 50 mL koniskt rör. Tvätta kolven 3 – 5x med 10 mL av CGM-trypsin-cell-blandningen från 50 mL koniskt rör.
Anmärkning: Innehållet i två Flask innehåll kan tillsättas till ett 50 mL-rör; om endast en kolv används, placera 10 mL trypsin/celler i 20 mL CGM i en 50 mL tub. - Centrifugera 50 mL koniska röret vid 160 x g i 7 min vid 4 ° c.
- Nu aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten med 5 mL CGM, Pipettera varsamt ~ 10X för att helt störa cellpelleten. Tillsätt 10 mL CGM för att få den totala volymen av 50 mL koniskt rör till 15 mL.
- Blanda igen ~ 10X och placera 5 mL av cellsuspensionen i 3 separata T-150 kolvar. Subkulturförhållandet är 1:3 i T-225 kolvar eller 1:4 i T-150 kolvar. Tillsätt 30 mL förvärmda 3T3 CGM till varje kolvar.
- Märk kolven med cell linjens namn, datum för cell sådd och passage nummer.
- För att frysa ner 3T3-celler efter centrifugering i subkultursteget, avlägsna 50 mL-röret från centrifugen och placera det på en isskopa. Aspirera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten med 1 mL 5% DMSO-DMEM-blandning (se tabell 1) för varje skördad kolv.
- Placera 1 mL DMSO-DMEM-blandning med cellsuspension i varje kryovial (en kryovial per 3T3-kolv skördad). Märk injektionsflaskan med passage numret, cellradsnamnet (3T3) och det datum då cellerna frystes.
- Placera dessa 3T3 cell ampuller i cell frys burk (se tabell över material) och överföring till-70 ° c frys för > 5 h. försiktig ta bort och överföra flaskorna från cellen frys burk och placera i en flytande kväve lagringstank för långtidslagring tills nästa användning . Ange information om cellradsnamnet, platsen i tanken och datumet i laboratorie inventerings bladet för flytande kväve.
2. beredning av 3T3 matar skikt för röntgenbestrålning och sådd
- Förbered 3T3 celler en vecka innan deras bestrålning och låta dem växa ~ 100% Confluence. 3T3-cellerna är vanligtvis inom avsnitten 120 till 130.
-
För framgångsrika klonogena analyser av primära keratinocyter, innan sådd 3T3 celler, ytskikt den 60 mm petriskålar med ett kollagen.
- Pipet runt 2 – 3 mL av kollagen-beläggnings lösningen i 60 mm petriskålar för att belägga bottenytan och ta bort överflödig kollagen-beläggning vätska (se tabell 1). Överföra Petriskålarna till en 37 ° c inkubator med 5% CO2 för minst 1 h. Låt inte rätterna torka i inkubator.
- Röntgen bestrålning steg: Följ steg 1.4 – 1.6. Använd 50 mL färsk CGM för att Återsuspendera cellpelleten, Stäng det koniska röret och försegla med paraffin tätning film. För att undvika kontaminering, Använd plastpåsar för att dubbla påsen paraffin förslutna cell som innehåller rör och placera på isen. En mitomycin baserad alternativ Feeder skikt kan användas för keratinocyter kultur7.
-
Bestråla fibroblast 3T3-celler i 50 mL koniskt rör med en 5 000 rads (50 CGY) dos med en biologisk röntgenapparat. Bestråla dessa celler tillsammans med CGM-mediet.
- Efter röntgenbestrålning, Centrifugera celler vid 160 X g i 7 min vid 4 ° c. Aspirera på supernatanten media och försiktigt Omsuspendera cellpellet med 5 mL CGM triturating försiktigt ~ 10X. Ta nu den slutliga volymen till 30 ml med ytterligare 25 ml medium och hackad 10X. Dessa triturating steg är avgörande för enhetliga 3T3 fibroblast skikt för klonogenicitetsanalys.
- Livskraftiga cell räkning: räkna keratinocyter med hjälp av en vanlig glas hemocytometer. Ta cirka 0,5 mL av cellerna och placera i en 1,5 mL tub. Ta bort 200 μL cell blandning och tillsätt en lika mängd 0,4% Trypan blå lösning och blandning 3 – 4x. Överför celler med en hemocytometern och räkna alla kärn celler (små guld och rosa celler) som livskraftiga celler. Beräkna den slutliga koncentrationen av livskraftiga guld celler.
- Pipettera över 1 x 106 3T3 celler (minst 7 x 105) celler kan användas) i 60 mm kollagen-belagda petriskålar (steg 2,2) och tillsätt försiktigt 4 ml modifierad hög-kalcium Williams E media (se tabell 1). Tillåt nyligen seedade 3T3 celler att fästa för 24 h. På nästa dag, skörda den färska primära keratinocyter och utsäde dem ovanpå bifogade 3T3 fibroblast skikt för klonogena test som anges nedan.
3. primär Keratinocyt skörd och sådd
- Euthanize fyra till fem vuxna honmöss via CO2 inandning enligt godkänd djur anläggning/IACUC standarder. Emellertid, detta protokoll kan också användas för enstaka kvinnliga/manliga möss.
- Klipp ca 9 cm2 av rygg pälsen med ett elektriskt djur klippare och placera alla klippta möss i en 500 ml burk med tillräckligt povidon jod antiseptisk lösning (inte skrubba) för att täcka dem för 1 – 2 min. skaka burken väl för att jämnt belägga den antiseptiska lösning över mössen.
- Häll av lösningen och skölj med rent vatten tills vätskan rinner klart. Upprepa samma antiseptiska tvätta följt av en vatten sköljning. Efter den antiseptiska tvätta med jod lösning, blöt alla möss i 70% etanol för 5 – 10 min.
Anmärkning: Möss med lätt päls (t. ex. BALB/c) kommer att behålla en liten gulaktig färg från den antiseptiska jod tvättar, medan mörkare möss (t. ex., C57BL/6) kommer inte. I synnerhet påverkas inte cellernas lönsamhet eller kultur tillväxt på grund av den gula färgen.
- Ta försiktigt bort klippt rygg skinn med tumtång och sax i en laminärt flöde huva. Placera den exciderade dorsala huden i koniskt rör fyllt med PBS/2x gentamycin. Undvik att använda ventrala sidan huden för att förhindra bröstcell förorening i kulturen.
- Använda autoklaverade tång och en skalpell, placera en rygg hud i taget håriga sidan ner på en tunn petriskål. Börja skrapa all subkutan vävnad inklusive fett från den ventrala sidan av huden vävnaden tills den är semi-genomskinlig. Försök att ta bort maximala spår av subkutan vävnad utan att riva huden (hårfollikeldel). Också, inte skrapa under en lång tid och undvika hud torkning.
- Håll skrapad hud i PBS-lösning tills alla andra kvarvarande skinn bearbetas. Med hjälp av en skalpell, skiva skinn i 0,5 cm x 1-1.5 cm remsor och placera den håriga Sidan upp på en steril petriskål.
- Pipettera försiktigt 20 mL PBS/2x gentamicin-lösning blandat med trypsin (0,25%) till en 100 mm x 20 mm plast petriskål. Använda sterila tång, överföra skinn och flyta dem håriga Sidan upp på ytan av trypsin lösning för 2 h i en 32 ° c inkubator.
Obs: trypsinization tid och temperatur är avgörande för god avkastning av mycket odlingsbara primära keratinocyter. Även om andra metoder kan ge god avkastning av livskraftiga celler, den culturability av keratinocyter har varit mindre tillfredsställande.- Under denna 2 h inkubationstid, päls rätter med kollagen beläggning och placera dem vid 37 ° c för 1 h (se steg 3.1.2). För klonogena analyser, den 60 mm petriskålar har redan bestruket 24 h före keratinocyt skörd att tillåta bestrålade 3T3 matar skikt att fästa till botten och fördela jämnt.
Anmärkning: Beläggning av kultur rätter för klonogena kultur är mycket viktigt för korrekt fastsättning, kolonibildning, och ultimat tillväxt/spridning av möss epidermal keratinocyter.
- Under denna 2 h inkubationstid, päls rätter med kollagen beläggning och placera dem vid 37 ° c för 1 h (se steg 3.1.2). För klonogena analyser, den 60 mm petriskålar har redan bestruket 24 h före keratinocyt skörd att tillåta bestrålade 3T3 matar skikt att fästa till botten och fördela jämnt.
- Epidermal skrapning steg: ordna en steril plast fyrkantig petriskål och skapa en yta vid en 30 ° lutning för korrekt epidermal skrapning med 15 mL avverknings medium (se tabell 1). Ta försiktigt bort en flytande hud remsa från trypsin lösning med böjda tång. Med en ny skalpell blad, skrapa bort epidermis och hårstrån i mediet.
- Använd inte överdriven kraft, men Använd tillräcklig kraft för att skrapa epidermis, eller det kommer att påverka cellernas lönsamhet.
- Under epidermis skrapning, hålla bladet vinkelrätt mot huden bit. Om bladet är vinklat mot rörelsen av bladet, det finns fler chanser att huden sliter. Om bladet är vinklat bort från blad rörelsen, det finns fler chanser att otillräcklig epidermis avlägsnande.
- Häll försiktigt avverknings mediet som innehåller skrapade epidermal celler i en steril 60 mL burk (Autoklaverbar och återanvändbar) med en 1,5 tums magnetisk rör bar. Skölj petriskål med ytterligare skörd medium för att samla återstående epidermal celler och få den slutliga volymen till 30 mL. Använd en magnetisk omrörare och rör vid 100 rpm i 20 min vid rumstemperatur. Denna process kommer att ta bort fångade epidermal celler från hårstrån.
- Placera en steril 70 μm-cellsil på toppen av ett 50 mL koniskt rör. Cellen SIL passar ovanpå en 50 mL koniskt rör.
- Ta burken inuti en biosäkerhet huva. Ta bort rör fältet och häll innehållet i SIL filter fäst på en 50 mL koniskt rör. Sila ut oönskat hår och ark av stratum corneum.
- Tryck hårstrån tillsammans med stratum hornlagret material i SIL och manipulera dem för att frigöra fångade hårcellerna. Använd 5 mL avverknings medium för att tillåta kvarvarande fångade celler att frigöra och flöda in i röret. Ta den totala volymen upp till 50 mL i koniskt rör.
- Locket 50 mL koniskt rör med cellfiltrat och centrifugera vid 160 x g i 7 min vid 4 ° c. Nästa Aspirera supernatanten och tillsätt 5 mL avverknings medium. Omsuspendera cellen pellet genom att triturating försiktigt ~ 20x med en 5 mL pipet.
- I detta steg, hålla cellerna i en Icebox för att undvika aggregering. Tillsätt 25 mL avverknings medium och triturat igen (20 – 25x).
- För att säkerställa en noggrann keratinocyt räkna i detta steg, ta 1 mL cellsuspension och tillsätt 19 mL avverknings medium. Nu är cell utspädning 1:20 i 50 mL koniskt rör. Om keratinocyter skördas från en enda mus, justera volymen av cellsuspensionen. I stället för 30 mL, Använd 15 mL och gör en 1:10 utspädning för att räkna cellerna.
- Pipet 0,5 mL utspädda celler från 50 mL koniskt rör (1:20 spädning) och överför till ett 1,5 mL autoklaverat microcentrifugerör. Ta bort 0,2 mL (200 μL) cell blandning till ett annat 1,5 mL microcentrifugerör och tillsätt en lika volym (200 μL) av 0,4% Trypan blå lösning. Blanda försiktigt denna lösning 3x och överföra celler till en hemocytometern för att räkna kärnförsedda keratinocyter.
- Poäng alla mörkblå celler positiva för Trypan blå som icke-livskraftiga döda celler, och värdering små guld och rosa celler som livskraftiga celler. Den slutliga keratinocyt avkastning per mus bör vara runt 30 000 000 livskraftiga celler.
- Centrifugera det ursprungliga 50 mL koniska röret (från steg 3,8) i 7 min vid 160 x g vid 4 ° c. I detta steg, Omsuspendera cellerna i önskat medium och gör den nödvändiga spädningen för sådd celler.
- För masskultur, utsäde 2 till 4 000 000 livskraftiga guld celler i varje 35 mm petriskål i cellodlingsmedium (KGM-typ medium + kosttillskott för enskiktslager kulturer) (se tabell 1). För en klonogena (koloni formation) assay, utsäde 1 000 celler per 60 mm petriskål på röntgen bestrålade schweiziska mus 3T3 Feeder lager med kollagen-beläggning och modifierade Williams E medium med kosttillskott och serum.
- Använd totalt 2 till 4 mL medium för 35 mm och 60 mm petriskålar, respektive. Också, formulera DMEM och Williams E medium upphandlas från ATCC med reducerade nivåer av natriumbikarbonat för användning vid 5% CO2.
- Odla kultur celler (massa eller clonogenic) vid 32 ° c, 95% luftfuktighet med 5% CO2. Ändra mediet en dag efter inledande seedning för masskultur, och sedan 3x varje vecka därefter. Men för klonala analyser är den första medelförändringen 2 dagar efter cell sådd och 3x varje vecka därefter.
- För klonala kulturen, odla celler med två-och fyra veckors mellanrum. Efter avslutad klon kulturer (2 eller 4 veckor), aspirera mediet. Fixera kolonierna i 10% buffrad formalin över natten vid rumstemperatur och fläcken med 0,5% rodamin B i autoklav vatten för 1 h. Ta sedan bort rodamin B fläcken med en pipett från kanten av rätterna.
- Skölj rätterna i kallt autoklaverat vatten tills rätterna går klart. Sätt rätterna lutande på locket på rätterna och låt dem torka för final Colony Counting. Särskilt, när du utför klonogena kulturanalys, aldrig Pipettera < 1 mL celler. Om cellerna är koncentrerade, seriellt späda cellkoncentrationen.
Representative Results
Typiskt, avkastningen av epidermal keratinocyter per mus som sträcker sig från 20 x 106 till 30 x 106 trypan blå exklusive celler erhålls8,9. Lönsamheten varierar från 80%-90%. Typiska sådd effektivitetsvinster är cirka 30% fastsättning vid 24 h. kolonibildning på bestrålade 3T3 Feeder lager är cirka 60 kolonier per 1 000 livskraftiga celler seedad för C57BL/6 möss, och cirka 30 kolonier per 1 000 celler för schweizisk-typ möss10 ,11. Typiska resultat från kolonibildande analyser illustreras i figur 1. Antalet hårfollikelstamceller är cirka 9% CD34+/Cd49f+ stamceller för C57BL/6 möss12. Typiska resultat från flödescytometri ges i figur 2.
Tillväxtkarakteristika för fyra olika medier illustreras i figur 3. De testade medierna är KGM-Gold, SFM, William ' s E medium och Morris-2 (ett reducerat kalcium medium utvecklat i Morris-laboratoriet baserat på Williams E).
Figur 1: representativa exempel från en analys för klonogena keratinocyter från vuxna möss. Detta fotografi visar keratinocyter koloni formation från CD-1 honmöss 54 dagar av ålder behandlas topiskt med 1) ingen behandling, 2) aceton följde en vecka senare av aceton två gånger i veckan i två veckor, 3) DMBA följt en vecka senare av aceton två gånger i veckan för två veckor, 4) aceton följde en vecka senare av TPA två gånger i veckan i två veckor, och 5) DMBA följde en vecka senare av TPA två gånger i veckan i två veckor. Efter deras in vivo behandlingar, keratinocyter skördades och seedade på 1 000 celler per skålen på matar skikt av bestrålad 3T3, och odlade i två veckor, varefter rätterna fixerades med buffrade formalin och färgas med rodamin B. Rätterna i varje kolumn replikerar från varje mus behandlingsgrupp. Observera att antalet större kolonier ökade vid behandling med DMBA, och det totala antalet kolonier ökade TPA behandling av möss före keratinocyt skörd. Förkortningar: DMBA: 7, 12-dimetylbenz [a] antracen; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativt exempel på flödescytometri av stamceller från vuxna möss. Kortfattat, isolerade primära keratinocyter isolerades från dorsala möss huden och filtreras för cellulära skräp med hjälp av cell filter. Den isolerade keratinocyter suspensionen var märkt med CD49f eller Α6-integrin (PE) och CD34 (FITC) antikroppar tillsammans med levande döda färgämnen och andra kontroller. FITC-och PE-isotypkontrollantikroppar (råtta IgG2akappa) användes för kompensations ändamål (se tabell över material). Stamceller valdes med hjälp av CD49f (PE-kanal), som erkände den externa komponenten i Hemi-desmosomes finns på basal epidermal och hårsäckar celler, och CD34 (FITC kanal), som erkände hårsäcken stamceller (dvs CD34-FITC+ och A6-PE+ (övre högra kolumnen, totalt 5%)). Den högra kolumnen visar de olika keratinocyter populationer nämligen CD34-FITC bara, CD34-FITC och A6-PE celler (dubbel positiv stamcells population), A6-PE bara, och obefläckade celler. Observera att det finns två CD34+ stamcells populationer som har rapporterats6,14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse mellan fyra olika medier på primär kulturer i epidermala celler från vuxna honmöss. Primära keratinocyter isolerades från dorsala möss huden och räknade för sådd med fyra olika medier (KGM, SFM, Willem ' s-E och Morris-2). Lika antal keratinocyter var seedade och följdes för deras allmänna morfologi och tillväxtmönster. Observera att den prolifererande keratinocyter har något olika morfologier. KGM, SFM, och Morris-2 som alla är reducerade kalcium medier har den mest robusta tillväxten efter fjorton dagar. Däremot, cellerna inte kvarstår när odlade i Williams E medium som har 1,4 mM kalcium och en hög andel kalium till natrium. Överraskande, Williams E medium med kosttillskott och tjugo procent foster bovint serum stöder keratinocyter klonala kulturer mycket bättre än något annat medium testade, förmodligen för att den berikade Williams E medium hjälper 3T3 matar celler till "feed" bättre. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösningar och media | Kommentarer |
| Skörde lösningar | |
| 2,5% trypsin (5 mL) | |
| Dulbecco ' s PBS (500 mL) | |
| Gentamycin (2 mL) | |
| PBS med 2x gentamycin (45 mL) | |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2x gentamycin | |
| Trypsin lösning | |
| Cell kultur lösningar | |
| Purecol-fibronectin skålen-beläggning lösning: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Bovint serumalbumin 1,0 mg/mL (10 mL) | |
| Cell odlingssubstrat (100 mL) | |
| Fibronectin (1 mg) | |
| Purecol kollagen (1 mL) | |
| Cell frysning lösning | |
| DMSO (2 mL) | |
| DMEM med 10% BCS och Pen-STREP | |
| Avverknings medium | Behöver vara utan kalcium |
| 2x gentamycin (1 mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| SMEM (500 mL) | |
| Hög kalcium Williams E media med: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| Glutamin 14,5 mL | |
| Hydrokortison (1 mg/mL) 0,5 mL | |
| Insulin 1 mL | |
| LinoAcid-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL | |
| Med aminosyrorna 4 mL | |
| MEM vitaminer 5 mL | |
| Penicillin-streptomycin 5 mL | |
| Transferrin (5mg/mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg/mL (4 ° c) 3,5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL | |
| 3T3 fibroblast komplett odlingssubstrat (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penicillin-streptomycin (10 mL) | |
| Kgm | Medel som används för Mass odling är ett reducerat kalcium medium |
| Morris 2 medium med samma kosttillskott som Williams E | En reducerad kalciumvariant av Williams E med kosttillskott |
Tabell 1: lösnings-och medie recept.
Discussion
Den keratinocyt skörd metod som beskrivs här utvecklades för att producera hög avkastning av mycket odlingsbara primära epidermal keratinocyter från bak av vuxna honmöss. Dessa keratinocyter är lämpliga för flödescytometri, Molekylär biologi ansökan, och primär cellkultur, inklusive den klonogena analysen rapporteras här. Denna keratinocyt skörd metod också har varit användbart för att studera andra nedströms aspekter av kutan kemisk carcinogenes och tumör promotion1,13.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. Först, för noggrannhet och reproducerbarhet, honmöss av ålder 54 ± 2 dagar användes. Detta har gjort det möjligt för oss att utföra känsliga och kvantitativa kolonianalyser från flera stammar av möss och att använda dem som en fenotyp i länkage analys som leder till identifiering av minst en ny stamcells reglerande gen10,11. För det andra är det bra att skära skinn i mindre bitar, som trypsinization är mer effektivt än att försöka hålla huden hela. För det tredje är tiden och temperaturen för trypsin flotation mycket viktigt för den efterföljande culturability. Dessutom måste man "peta betydligt" på hårstrån kvar på filtret för att få bort de bifogade cellerna. Detta steg är viktigt för att få hög avkastning av celler. Dessutom, den 32 ° c temperaturen i inkubatorn är viktigt för den långsiktiga odlingen av keratinocyter från vuxna möss. Slutligen, i detta protokoll, parallell avläsning av in vitro-och in vivo experiment1 är baserade på primära kulturer snarare än subkulturer eller cellinjer. Särskilt, om skörd primära keratinocyter för första gången med hjälp av detta protokoll, hålla resterande dermis efter skrapning för att bekräfta fullt avlägsnande av hårsäckar tillsammans med epidermis av histopatologisk observation.
Den främsta styrkan i detta protokoll för skörd vuxen mus keratinocyter är att det ger hög avkastning av odlingsbara celler som lämpar sig för många nedströms applikationer. Den viktigaste begränsningen är att vissa cellytan epitoper kan vara känsliga för trypsinization så att immun färgning kan äventyras. Därför, när du testar en ny cellyta antikropp, det kan vara klokt att använda en dispas6 eller thermolysin5 baserad metod för skörd för jämförelse. Betydelsen av detta protokoll är att den har testats rigoröst, kvantifierats och tillämpats på så skilda tillämpningar som analyser för klonogena stamceller1,9,10,11, för Mass kulturer i biokemi8, för FACS sortering i stamcells analys3,4, för molekylärbiologi3,12, och för pågående RNA och DNA-sekvensering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
