Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.
Leukocyten egress uit perifere weefsels naar zuig lymfeklieren is niet alleen cruciaal voor immuun toezicht en inleiding maar draagt ook bij aan de resolutie van de perifere weefsel reacties. Hoewel een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om te kwantificeren leukocyte egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die context-afhankelijke egress regeren slecht begrepen. Hier beschrijven we het gebruik van in situ photoconversion voor kwantitatieve analyse van leukocyten egress van lymfkliertest huid en tumoren. Photoconversion zorgt voor de directe etikettering van leukocyten woonachtig binnen cutane weefsel. Hoewel de blootstelling van de huid aan violet licht lokale induceert inflammatoire reacties gekenmerkt door leukocyten infiltreert en vasculaire leakiness, in een head-to-head vergelijking met transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, photoconversion specifiek Label trekkende dendritische cel populaties en gelijktijdig ingeschakeld de kwantificering van myeloïde en lymfoïde egress van cutane microenvironments en tumoren. De mechanismen van leukocyten egress blijven een ontbrekende onderdeel in ons begrip van intratumoral leukocyten complexiteit zal, en aldus de toepassing van de instrumenten die hierin worden beschreven uniek inzicht in de dynamiek van tumor immuun microenvironments beide bij steady state en in reactie op de therapie.
Perifere weefsel immuunresponsen zijn gevormd, niet alleen door leukocyten aanwerving aan de sites van ontsteking, maar ook door mechanismen die hun latere retentie regelen. Dus, beschermende immuniteit is ingegeven door cumulatieve cellulaire en moleculaire mechanismen die bepalen of een leukocyte invoert, blijft binnen, of liever gezegd migreert is uit perifere weefsel via de lymfevaten. Nog belangrijker is, is de neiging voor leukocyten om af te sluiten van weefsel via de lymfevaten (zogenaamde egress) gekoppeld aan hun gespecialiseerde functies. Dendritische cellen (DC) verwerven trekgedrag in reactie op signalen van de rijping leidt tot antigeen vervoer en presentatie in het aftappen lymfklieren (dLN), een proces dat nodig is voor adaptieve immuniteit1. Opruiming myeloïde cellen, zoals macrofagen en neutrofielen, dienen apoptotic puin door fagocytose te wissen. Tijdens de bacteriële infectie, neutrofielen egress weefsel en uiteindelijk ondergaan apoptosis in dLNs2 en een model van DSS-geïnduceerde colitis, gegevens ondersteunt de hypothese dat de macrofaag egress is noodzakelijk om te lossen lokale ontsteking3. Of neutrofiele en macrofaag egress plaatsvindt in alle inflammatoire contexten, is echter onbekend. Bewijs voor T lymfocyten uitgang uit de steady-state4,,5,,6,7, besmette8en ontstoken4,9,10, 11,12 perifere, niet-lymfoïde weefsels geeft aan dat T-cellen actief recirculate, hoewel de weefsel gebaseerde signalen die deze afslag rijden blijven slecht begrepen. Verschillende studies hebben geïdentificeerd signalen nodig voor de directionele overgang naar het aftappen van lymfatische haarvaten en latere egress inclusief chemokine (C-C motief) ligand 21 (CCL21) en de receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motief) ligand 12 (CXCL12) en de receptor CXCR42,14, en sphingosine-1-fosfaat (S1P)10,15,16. Deze mechanismen zijn niet actief in alle contexten, echter, en of ze bepalen uitgang van alle celtypes blijft een open vraag. Nog belangrijker is, verder vereist inzicht in de mechanismen die egress en haar functionele relevantie in ziekte regeren kwantitatieve in-vivo analysemethoden.
Verschillende methoden zijn gebruikt om het kwantificeren van de uitgang in meerdere diermodellen in vivo met inbegrip van directe cannulation van lymfevaten, adoptief overdracht van ex vivo label leukocyten, transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, injectie van gelabelde deeltjes, en in vivo photoconversion17,18. Directe cannulation van de lymfevaten afferent muis is moeilijk en kleine dieren beperkt door de hoeveelheid vloeistof die kunnen worden verzameld. Dus cannulation is grotendeels uitgevoerd in grote dieren (bv., schapen) waar dergelijke chirurgische manipulaties zijn praktische. Deze studies leveren direct bewijs voor de aanwezigheid van zowel lymfoïde en myeloïde cellen in lymfe10,19,20. Bovendien, schapen modellen onthullen dat acute en chronische ontsteking lymfocyt aanwezigheid in lymfe steeg met bijna 100-fold10,–21.
Adoptief overdracht van gelabelde en genetisch gemanipuleerde lymfocyten belangrijker is gebleken dat CCR7 vereist voor de uitgang van CD4 is+ T cellen van acuut ontstoken huid5,11, terwijl de voorbehandeling van lymfocyten met het kleine molecuul S1P receptor agonist remt FTY720, slechts gedeeltelijk hun egress-10. Interessant is dat de uitgang van overgedragen lymfocyten van chronisch ontstoken huid is CCR7-onafhankelijke10, maar kan gedeeltelijk CXCR49vereisen. Adoptief overdracht experimenten, leveren niet-fysiologische aantal ex vivo echter geactiveerd en gelabelde lymfocyten in weefsel via injectie, dat de biomechanische omgeving van weefsels en een verhoogde interstitiële vloeistof druk verandert dat opent eerste lymfatische haarvaten en veranderen hun vervoer eigenschappen22. Als een alternatieve, transdermale toepassing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) in de aanwezigheid of afwezigheid van dermale irriterende stoffen (bv., dibutylftalaat, DBP) of infectie23,24 voorziet in het bijhouden van fagocytische cellen die accumuleren tracer en migreren naar dLNs. Evenzo fluorescently geëtiketteerde tumoren een manier bieden waarmee bijhouden fagocytische cellen die tumor materiële25hebben opgeslokt. Deze methoden hebben verstrekt belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen die regeren DC uitgang13,14,17,26,27 , maar zijn niet in staat om bij te houden van niet-fagocytische lymfocyten en interpretatie kunnen worden bemoeilijkt door gratis lymfedrainage van oplosbare FITC dus labeling niet-trekvogels, LN resident DCs.
U kunt ook is intravital microscopie een krachtig hulpmiddel waarmee voor in vivo bijhouden van fysiologisch relevante leukocyte populaties in real-time28,29. Gebruikt in combinatie met de verslaggever muizen en antilichaam gebaseerde in vivo immunefluorescentie labeling, intravital microscopie is gebleken dat de complexe ruimtelijke en temporele dynamiek van immuun cel mensenhandel, waaronder interstitiële migratie30 , zielsverhuizing over de lymfatische endotheel, passage binnen de lymfatische lumen en migratie op LN vermelding28,31. Brede goedkeuring van intravital beeldvormingstechnieken wordt beperkt door de kosten, de nodige expertise voor instellen, en doorvoer voor het kwantificeren van meerdere celtypen beperkt. Nog steeds, koppeling van de kwantitatieve methodes die het analyseren van de populatiedynamiek weefsels met intravital imaging geven extra en belangrijk mechanistische inzicht met betrekking tot de mechanismen van de motiliteit en migratie naar en binnen lymfatische haarvaten 18 , 31 , 32.
Bijgevolg, in vivo photoconversion heeft ontpopt als een methode voor het in situ labelen, waarmee onafhankelijk van fagocytische activiteit, en voor de kwantificering van fysiologische leukocyte egress (wanneer in combinatie met stroom cytometry) in de afwezigheid of aanwezigheid van uitdaging. Constitutively express Kaede-Tg muizen een proteïne van stony koraal dat groene fluorescentie (Kaede groene) vertoont totdat blootgesteld aan violet licht, waarna het onomkeerbaar wordt omgezet in rode fluorescentie (Kaede rode)33geïsoleerd. Photoconverted cellen kunnen worden getraceerd als zij egress van perifere weefsel sites en zich ophopen in de dLNs. Dit en andere soortgelijke photoconvertible muis modellen34,35 is gebleken dat belangrijke biologie met inbegrip van constituerende egress van regulatoire T-cellen van huid36, CXCR4-afhankelijke B-cel egress van Peyer van patches37 , mobilisatie van resident T geheugencellen op peptide opnieuw uitdaging38, en brede leukocyte egress tumor microenvironments €39. Hierin, voeren wij een head-to-head vergelijking van photoconversion met transdermaal FITC toepassing in het kader van cutane ontsteking en infectie te voorzien in rechtstreekse vergelijking van bestaande gegevens met de photoconvertible-methode. Bovendien, we tonen photoconversion geïmplanteerde tumoren en beschrijven van de omzettingsefficiëntie en selectieve egress van tumor microenvironments. Zo, we stellen dat verdere toepassing van deze methoden is nodig om te verhelderen van de kritische biologie van leukocyten egress van tumoren, die aanzienlijke gevolgen voor de interpretatie van intratumoral leukocyten complexiteit, anti-tumor immuniteit, zal hebben en respons op therapie.
Hoewel de leukocyten egress uit perifere, niet-lymfoïde weefsels essentieel voor de inleiding en de resolutie van de immuunrespons is, worden de moleculaire mechanismen die egress regeren slecht begrepen. Deze lacunes in de kennis is grotendeels te wijten aan de beschikbaarheid van instrumenten voor de kwantificering in vivo. Hier beschrijven we het gebruik van photoconvertible muizen (Kaede-Tg) te kwantificeren van endogene leukocyte uitgang van de huid en de tumoren en bieden een directe vergelijking van de h…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Dr. Marcus Bosenberg voor het verstrekken van YUMM 1.1 en YUMM 1.7 lymfkliertest melanoom lijnen en Dr. Deborah J. Fowell voor het verstrekken van B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr muizen in overleg met RIKEN BRC via de nationale Bio-bron van de MEXT, Japan.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
DNase | Roche | 4536282001 | |
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
HBSS | Caisson | HBL06 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo v10 Software | FlowJo |