Summary
静脈内合成ペプチド、蛋白質キナーゼ C デルタ阻害剤は、虚血再灌流惹起急性肺傷害の減少を提供する金ナノ粒子のペプチド ハイブリッド以前使いました。ここで、製剤の詳細なプロトコルを示す.他の細胞内ペプチドは同様に定式化することができます。
Abstract
蛋白質キナーゼ C デルタ阻害剤 (PKCδi) は、虚血再灌流による臓器損傷を防ぐために有望な薬剤です。通常、細胞透過性ペプチド、TAT の細胞内動態を活用します。しかし、TAT は、非固有の生物学的活性を示しています。金ナノ粒子 (GNPs) は、認識された毒性のない薬配信キャリアとして使用できます。したがって、我々 は PKCδi を提供する GNP/ペプチド ハイブリッドを使いました。2 つの短いペプチド (P2: CAAAAE と P4: CAAAAW)、95:5 の比率で GNP のサーフェスのプロパティを変更する使用されました。GNPs PKCδi (GNP/PKCi) と共役が蒸留水で安定して 0.9% 塩化ナトリウムとリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ウシ血清アルブミンやウシ胎児血清を含みます。GNP PKCi の静脈注射は以前肺の虚血再灌流障害を防ぐために示されました。この資料では、GNP/PKCi を策定し、ハンナラ党/PKCi の理化学特性を評価するためのプロトコルについて説明します。ハンナラ党と他のペプチド ベースの薬を策定する同じような方法を使いました。この記事は、うまく行けばこの細胞内薬剤デリバリー技術とその応用を体内にもっと注意を引くでしょう。
Introduction
肺移植は末期肺疾患1患者を保存します。ただし、肺移植後の重篤な合併症では、障害が残っています。肺移植初期段階で主な移植臓器機能不全は最も有害な合併症1で、その主な原因は虚血再灌流 (IR)-誘発急性肺傷害2。
低温保蔵下ドナー肺における代謝は非常に低いレベルに制限されます。しかし、活性酸素と一酸化窒素合成血流3の停止のためにアクティブ化されます。移植後血行が復元され、活性酸素種と冷たい虚血時に生成される酸化窒素を高める組織の損傷に伴う炎症や細胞死。
IR の傷害を防ぐためには、蛋白質キナーゼ c δ 阻害剤 (PKCδi) は、心、脳と肺4,5,6,7,8で使用されています。これらの研究は、PKCδi が、再灌流時に、炎症とアポトーシスを減少することを示した。それはまた肺の IR 損傷ラットおよび肺移植モデル6を許可していません。PKCδi は通常、細胞浸透性ペプチド、TAT の細胞内動態と共役系します。ただし、単独で TAT ペプチドが複数サイトカイン9,10,11の阻害、アポトーシス、血管新生の促進を含む非固有生物学的効果を持っていることが示されています。ナノ粒子、1 から 100 までの小粒子径12nm は薬配信13を容易に候補として検討されています。特に、金ナノ粒子 (GNPs) は無毒、非侵襲的にみなされます。そこで、ペプチド ベースの薬14,15薬配信キャリアとして GNPs を開発しました。
GNPs の表面は、分子認識16,17、化学センシング18、イメージング19、薬剤投与などの特定のアプリケーションを操作できます。20 nm GNPs と 2 つの短いペプチドを含む、ハンナラ党/ペプチド ハイブリッド システムを開発されている (P2: CAAAAE と P4: CAAAAW) GNPs の表面の特性を変更するのには、95:5 の比率で。P2 ペプチド、最後に、負荷電のグルタミン酸 (E) を水溶液中で GNPs を安定化し、最後に、疎水性トリプトファン (W) と、P4 のペプチドに役立ちます GNPs セル14への入口。これらのペプチドの N 末端のシステイン (C) 残基には、金表面14に共役することができますチオール グループが含まれています。このペプチド/GNP ハイブリッドはさらに PKCδi (CSFNSYELGSL) を提供する使用されました。PKCδi に P2:P4 の最適化のモル比は、47.5:2.5:50 です。GNPs PKCδi (GNP/PKCi) と共役安定蒸留水、0.9% の NaCl、牛アルブミンまたはウシ胎児血清14を含む PBS が。GNP/PKCi の静脈注射は、15肺の虚血再灌流障害を防ぐために示されています。この記事では、GNP/PKCi を定式化する方法の概要を説明し、ハンナラ党/PKCi の物理化学的特性を評価する方法について説明します。他のペプチド ベースの薬 GNP20,21,22に共役を策定する同じような方法を使いました。この記事がこの新規製剤細胞内薬物送達のためにもっと注目されると思います。
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Protocol
1. ペプチド溶液の調製
- ペプチドを取得 (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW、PKCδi: CSFNSYELGSL)-20 ° C のフリーザーと室温 (RT) 雪解けから。
注意: ボトル、ペプチドの凝縮から湿気を防ぐために閉じる。 - マイクロ スケールの各ペプチドが 0.01 g の重量を量る。各ペプチドを別の 50 mL の円錐管に入れます。
- P2 チューブに 18.74 mL 純水 (DI) を追加します。
- P4 チューブに純水の 16.93 mL を追加します。
- PKCδi 管を純水で希釈した 50% アセトニ トリル 8.21 mL を追加します。
- 渦ペプチド ソリューションを簡単に。5 分超音波発生装置 (40 MHz) で 50 mL の円錐管を置きます。
- バイオ セーフティ キャビネットにペプチッド解決をもたらします。準備すべてのペプチッド解決は 1 mM をする必要があります。
- 各ペプチド溶液 1 mL を新しい 50 mL の円錐管に転送します。P2 と P4 のチューブに DI 水 19 mL を追加し、各ソリューションを 50 μ M に希釈して、独自のチューブに格納されているように PKCδi チューブに 50% アセトニ トリルの 19 mL を追加します。
2. 国民総生産/PKCi の定式化
- ペプチドは、BSC で GNP のソリューションに追加する必要があります。
- 15 mL チューブに P2 の 475 μ L、P4 の 25μL、δPKCi ソリューションの 500 μ L を追加します。同じ 15 mL チューブに 20 nm GNP ソリューション (7.0x1011粒子/mL) の 9 つの mL を追加します。
- 安全キャビネットを終了します。アルミ箔で 15 mL チューブをラップします。RT でシェーカーに一晩置いておきます。
- キャビネット、バイオ セーフティにサンプルを返します。各 1.5 mL のマイクロ チューブに GNP/PKCi の分注 1 mL。
- 4 ° C で 15,294 x g で 30 分間マイクロ遠心チューブを遠心分離します。
- バイオ セーフティ キャビネットの下で各チューブから上澄みを削除します。
注: GNP ペレットのままで吸気がないことを確保しながら上澄みを除去するように気をつけてください。 - 再必要な濃度に応じて適切な溶媒中でペレットを中断します。該当する溶剤は、DI 水、PBS、および 0.9% 塩化ナトリウム。
注: は、GNP/PKCi の 1 mL から始まって、GNP ペレットは、製造元から提供された GNP 濃度に基づく 10 の11の粒子 x 6.3 を含まれています。1.3 0.9% の 500 μ L の 10 の12粒子を管理する, 塩化ナトリウム 0.9 %232 μ L を追加各 3 ペレットに塩化ナトリウム。一緒にそれらをプールした後我々 は、GNP/PKCi ソリューションを 500 μ l 添加を収集できます。
注: 混ぜる目的も GNP/PKCi ペレットを希釈する前に溶剤、そうでなければ GNP/PKCi 集計されます。
3. ハンナラ党/PKCi ハイブリッド溶解性の評価
- アクリル キュベットに GNP/PKCi 溶液 0.5 mL を注ぐ。紫外可視分光光度計のキュヴェット アクリルしピーク吸収15をテストします。
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Representative Results
ハンナラ党は、する傾向があるは、GNP/PKCi ハイブリッドの生物物理学的特性を評価する注意が必要溶媒中で集計。国民総生産を集約すると、ソリューションの色がピンクから紫 (図 1 a) に変更します。紫外可視分光光度計がより敏感に変化を検出することができます。GNP/PKCi が集約されていない場合吸収のピークは 525 でする必要があります (図 1 b) nm。国民総生産を集約すると、吸収のピークが右にシフトされます。分析、集計は ΔOptical 密度を形成しているときの代替手段として (ΔOD = 外径 525 nm - 440 で OD nm) が減少します。
図 1: ハンナラ党/PKCi の品質。(A) 適切に準備 GNP/PKCi ピンク色 (左) なのです。集約された GNP/PKCi 表示ライト パープル (右)。(B) 水、PBS、または 0.9 %nacl 水溶液の良い GNP/PKCi 準備は安定しました。紫外-可視分光器の測定値が吸収のピークが 525 で示したすべてのソリューションで nm。(C) 善と悪の GNP/PKCi 準備の例。国民総生産の集約、吸収のピークが右にシフトしました。さらに、ΔOD が減少しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
適切な定式化を確保するため、δPKCi ソリューションが 1.6 で説明されている超音波処理ステップを経ることが重要です。ΔPKCi ペプチッド シーケンスには、50% アセトニ トリル溶液中 PKCi を溶解に役立ちます、超音波発生装置、疎水性の部分が含まれています。さらに、細心、手順 2.7 に示した溶媒を混合する非常に重要です。 23δPKCi ペプチドの凝集による手順が適切に行われていない場合、GNP/PKCi ハイブリッドはよくは配合できません。
GNP ベースの製剤は、いくつかの利点を提供します。数ナノメートルから 〜 100 に至るまでよく制御のサイズで GNPs を簡単に合成できる最初に nm。通常より小さい大きさで分類された GNPs ことができます薬を届けるセルに大きいものと小さいものがそのターゲット地域24に容易に拡散よりもより効率的に。 第二に、GNPs は、非毒性の in vitro および in vivo の25、それらに安全な薬物キャリアーを作るします。 第三に、疎水性の薬は変更 GNPs26に読み込むことができます。 など、GNPs の表面化学は、特定のアプリケーションの容易に変更されます。私たちの研究で、2 つの短いペプチド生理的条件で安定して新しい生物活性を付与し、GNP サーフェスが修正されます。ペプチドは、ゴールド バインディング、間隔、および機能領域を含む 3 つの地域で思慮深く設計されていた。 具体的には、ペプチドの N 末端側は金に結合するチオール グループを含んでいるシステイン (C) 残基です。中央部は、GNPs の密集化単分子膜にペプチド組み立てを促進するために 4 の疎水性のアラニン残基。C 末端アミノ酸は、機能性アミノ酸、外側を向いている、GNPs の表面のプロパティを操作するために使用できます。これらの 2 つのペプチドの 95:5 比は、前研究14に全身選ばれました。PKCi と P2 ・ P4 ペプチド間の比率は、全身もテストされ、15を選択しました。
その一方で、GNP の薬物送達システムには、制限があります。GNPs 細胞型または特定の組織ではありません。GNPs は主に、静脈内投与27,28,29後肺、肝臓、および脾臓に蓄積されます。この数式は細胞培養と小動物でテストされているこれまでのところ、モデル。臨床応用、さらに大型動物モデルと体内動態に関する研究を行うには、組織の分布と潜在的な毒性を決定する必要があります。
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Disclosures
著者は、このプロジェクトで明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、カナダ最初研究の卓越性のプログラム、トロント大学でデザインによる医療とオンタリオ州の革新 (日時-08-029) 研究省健康の研究のカナダの協会 (PJT-148847) からの研究補助金によってサポートされます。Mingyao リューはジェームズと肺の損傷、修復、および再生のメアリー デイビー椅子です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
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