Summary
Vi har brukt en gull hydrogenion peptid hybrid intravenøst levere en syntetisk peptid, protein kinase C-deltaet inhibitor, som redusert ischemia-reperfusion-indusert akutt lungen skade. Her viser vi detaljerte protokollen for drug formulering. Andre intracellulær peptider kan utformes på samme måte.
Abstract
Protein kinase C-deltaet hemmer (PKCδi) er en lovende stoffet å hindre ischemia-reperfusion-indusert orgel skade. Det er vanligvis konjugert til en celle-gjennomtrengende peptid, TAT, intracellulær levering. TAT har imidlertid vist uspesifisert biologiske aktiviteter. Gull nanopartikler (GNPs) kan brukes som stoffet levering bærer uten anerkjent toksisitet. Derfor har vi brukt en GNP/peptid hybrid for å levere PKCδi. To korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW), i 95:5 forholdet, ble brukt til å endre egenskapene overflaten av BNP. GNPs konjugert med PKCδi (GNP/PKCi) er stabile i destillert vann, 0,9% NaCl og fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder bovin serum albumin eller fosterets bovin serum. Intravenøs injeksjon av GNP-PKCi ble tidligere vist å hindre ischemia-reperfusion skade av lunge. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å formulere GNP/PKCi og vurdere physiochemical egenskapene til GNP/PKCi. Vi har brukt lignende metoder for å formulere andre peptid-baserte stoffer med GNP. Denne artikkelen vil forhåpentligvis trekke mer oppmerksomhet til denne romanen intracellulær stoffet levering teknologi og dens anvendelser i vivo.
Introduction
Lungetransplantasjon lagrer pasienter med sluttstadiet lunge sykdom1. Alvorlige komplikasjoner etter lungetransplantasjon beholdes imidlertid en hindring. I de tidlige fasene etter lungetransplantasjon, primære pode dysfunksjon er den mest skadelige komplikasjoner1, og dens primære årsaken er ischemia-reperfusion (IR)-indusert akutt lungen skade2.
Under kalde bevaring er metabolisme i en donor lunge begrenset til et svært lavt nivå. Imidlertid er reaktive oksygen arter og nitrogenoksid syntese aktivert på grunn av opphør av blod flyte3. Etter transplantasjon, blodsirkulasjonen er gjenopprettet og reaktive oksygen arter og nitrogenoksid genereres under kalde iskemi styrke betennelse og celle død, noe som resulterer i vev skade.
For å hindre IR skade, har en protein kinase Cδ hemmer (PKCδi) blitt brukt i hjertet, hjernen og lunge4,5,6,7,8. Disse studiene viste at PKCδi redusert betennelse og apoptose under reperfusion. Det har også hindret lunge IR skade i rotter og en lunge transplantasjon modell6. PKCδi er vanligvis konjugert med en celle-gjennomtrengende peptid, TAT, intracellulær levering. Det har imidlertid vist at TAT peptid alene har ikke-spesifikke biologiske effekter, inkludert markedsføring av angiogenese apoptose og hemming av flere cytokiner9,10,11. Nanopartikler, små partikler, fra 1 til 100 nm i diameter12, utforsket som kandidater i tilrettelegge stoffet levering13. Spesielt regnes gull nanopartikler (GNPs) som noninvasive og nontoxic. Derfor har vi utviklet GNPs som narkotika levering bærer for peptid-baserte narkotika14,15.
Overflaten av GNPs kan manipuleres for bestemte programmer som molekylær anerkjennelse16,17, kjemiske sensing18, tenkelig19og narkotika-leveranser. En GNP/peptid hybridsystem har blitt utviklet, som inneholder 20 nm GNPs og to korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW) i 95:5 forholdet, endre overflaten egenskapene for GNPs. P2 peptid, med den negativt ladde Glutaminsyre (E) på slutten, stabiliserer GNPs i en vandig løsning, og P4 peptid, med den hydrofobe tryptofan (W) på slutten, hjelper GNPs inngangen til celler14. Cystein (C) rester endestasjonen N til disse peptider inneholder en thiol gruppe som kan bøye gull overflater14. Dette peptid/GNP hybrid ble videre brukt til å levere PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimalisert molar forholdet mellom P2:P4 til PKCδi er 47.5:2.5:50. GNPs konjugert med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destillert vann, 0,9% NaCl og PBS med bovin albumin eller fosterets bovin serum14. Intravenøs injeksjon av GNP/PKCi har vist å hindre ischemia-reperfusion skade av lunge15. Denne artikkelen beskriver en metode for å formulere GNP/PKCi og beskriver hvordan man skal vurdere mekanisk-egenskapene for GNP/PKCi. Vi har brukt lignende metoder for å formulere andre peptid-baserte stoffer konjugert GNP20,21,22. Vi håper denne artikkelen vil trekke mer oppmerksomhet til denne romanen formulering intracellulær stoffet levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av peptid løsninger
- Hente peptidene (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) fra 20 ° C fryser og tine ved romtemperatur (RT).
Merk: Holde flasken lukket for å forhindre at fuktighet kondenserende på peptidene. - Veie 0,01 g hver peptid på en Mikroskala. Sett hver peptid i et separat 50 mL konisk rør.
- Legge til 18.74 mL deionisert vann (DI) P2 røret.
- Legg 16.93 mL DI vann til P4 røret.
- Legg 8.21 mL av 50% acetonitrile fortynnet i DI vann til PKCδi røret.
- Vortex peptid løsningene kort. Satte 50 mL konisk rørene i en sonicator (40 MHz) i 5 min.
- Bringe peptid løsninger til en biosafety kabinett. Alle peptid løsninger utarbeidet skal være 1 mM.
- Overføre 1 mL av hver peptid løsning til en ny 50 mL konisk tube. Legge til 19 mL DI vann rørene av P2 og P4 og legge til 19 mL av 50% acetonitrile PKCδi røret, slik at hver løsning er utvannet til 50 µM og lagret i sin egen rør.
2. formulering av BNP/PKCi
- Peptider bør legges til GNP løsningen mens du fremdeles er i BSC
- Legge til 475 μL P2, 25μL av P4 og 500 μL δPKCi løsning i en 15 mL tube. Legge til 9 mL av 20 nm GNP løsning (7.0x1011 partikkel/mL) i samme 15 mL rør.
- Avslutt biosikkerhet kabinettet. Pakk den 15 mL tuben med aluminiumsfolie. La den på en shaker på RT over natten.
- Tilbake prøvene til fravær av smittefarlige stoffer skap. Aliquot 1 mL av GNP/PKCi i hver 1,5 mL microtubes.
- Sentrifuge rør i en mikro-centrifuge for 30 min 15,294 x g på 4 ° C.
- Fjern nedbryting fra hver rør under en biosafety kabinett.
Merk: Pass på å fjerne nedbryting samtidig sikre at GNP pellet intakte og er ikke pustende. - Å avbryte pellet ønsket løsemiddelet ifølge konsentrasjon kreves. Gjeldende løsemidler kan DI vann, PBS og 0,9% NaCl.
Merk: Fra 1 mL av GNP/PKCi, inneholder GNP pellet 6.3 x 1011 partikler, basert på GNP konsentrasjonen leveres av produsenten. Administrere 1,3 x 1012 partikler i 500 µL av 0,9% NaCl, vi legger 232 µL av 0,9% NaCl til hver av tre pellets. Etter samle dem sammen, kan vi deretter samle 500 µL GNP/PKCi løsning.
Merk: Bland ønsket løsemiddel godt før fortynne GNP/PKCi pellets, ellers GNP/PKCi vil samle.
3. vurdering av BNP/PKCi Hybrid løselighet
- Hell 0,5 mL GNP/PKCi løsning i en akryl cuvette. Plasser akryl cuvette på et UV-Vis spektrofotometer og teste peak absorpsjon15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bekymre burde være tatt å evaluere egenskapene Biofysiske GNP/PKCi hybrid, som GNP pleier å samle i løsemiddel. Når GNP samles, endres fargen på løsningen fra rosa til lilla (figur 1a). UV-Vis spektrofotometer er kjøpedyktig merker endringene mer følsomt. Hvis GNP/PKCi ikke samles toppen av absorpsjon bør være på 525 nm (figur 1b). Hvis BNP er akkumuleres vil toppen av absorpsjon bli forskjøvet til høyre. Som en alternativ metode for analyse, når aggregater har dannet ΔOptical tetthet (ΔOD = OD på 525 nm - OD på 440 nm) reduseres.
Figur 1 : Kvaliteten på BNP/PKCi. (A) skikkelig forberedt GNP/PKCi rosa farge (til venstre). Aggregert GNP/PKCi vises lys lilla (høyre). (B) god GNP/PKCi forberedelse er stabil i vann, PBS, eller 0,9% NaCl løsning. Avlesninger på en UV-Vis spectrometer indikerte toppen av absorpsjon på 525 nm i alle løsninger. (C) et eksempel på god og dårlig GNP/PKCi forberedelser. Når BNP var samlet, ble toppen av absorpsjon flyttet til høyre. Videre ΔOD redusert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å sikre riktig formulering, er det avgjørende at den δPKCi løsningen gjennomgår sonication trinnet i 1.6. ΔPKCi peptid sekvensen inneholder hydrofobe moieties, så en sonicator bistår i oppløsning PKCi i 50% acetonitrile løsningen. I tillegg er det svært viktig å blande løsemiddelet omhyggelig, som beskrevet i trinn 2.7. GNP/PKCi hybrid vil ikke også være formulert hvis disse trinnene ikke gjort riktig, på grunn av aggregering av δPKCi peptid23.
GNP-baserte drug formulering gir flere fordeler. Først GNPs kan syntetiseres lett i godt styrt størrelser, fra et par nanometers ~ 100 nm. Vanligvis kan mindre størrelse GNPs levere narkotika i celler mer effektivt enn de større, så små kan lett diffus i deres mål regionen24. Andre er GNPs giftfri i vitro og in vivo25, gjør dem trygt stoff bærere. Tredje, hydrofobe narkotika kan lastes inn den endrede GNPs26. Frem endres overflatekjemi av GNPs lett for bestemte programmer. I våre studier brukes to kort peptider til å endre GNP overflaten, for å stabilisere seg i fysiologiske forhold og formidle nye bioactivities. Peptidene er nøye utformet med tre regioner, inkludert gull bindende, avstand og funksjonelle områder. Spesielt har N endestasjonen til peptid cystein (C) rester som inneholder thiol gruppe som kan binde med gull. Den midtre delen har fire hydrofobe alanin rester å fremme peptid forsamlingen en tett pakket monolayer på GNPs. Aminosyren endestasjonen C er en funksjonell aminosyre peker utover, som kan brukes til å manipulere overflaten egenskapene til GNPs. 95:5 forholdet mellom disse to peptider er systemisk valgt i en tidligere studie14. Forholdet mellom PKCi og P2/P4 peptider ble også systematisk testet og valgt15.
På den annen side, har GNP stoffet leveringssystemet begrensninger. GNPs er ikke celle type eller vev bestemt. GNPs er hovedsakelig samlet i lunge, lever og milt etter intravenøs administrasjon27,28,29. Så langt denne formelen har bare blitt testet i cellekultur og små dyr modeller. For å oversette det klinisk anvendelse, videre studier på store dyr modeller og dens farmakokinetikken, vev distribusjon og potensielle toksisitet skal bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre på dette prosjektet.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av forskningsmidler fra kanadiske institutter for helseforskning (PJT-148847), departementet for forskning og innovasjon i Ontario (RE-08-029) og Canada første av fortreffelighet forskningsprogram, medisin ved Design ved University of Toronto. Dr. Mingyao Liu er James og Mary Davie stol i lungen skade, reparasjon og gjenfødelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
