Summary
정 맥 합성 펩 티 드, 단백질 키 니 아 제 C 델타 억제제, 국 소 빈 혈 reperfusion 유발 급성 폐 상해 감소를 제공 하는 골드 나노 펩 티 드 하이브리드를 사용 이전 했습니다. 여기 우리가 약물 배합의 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 다른 세포내 펩 티 드 유사 하 게 공식화 될 수 있습니다.
Abstract
단백질 키 니 아 제 C 델타 억제제 (PKCδi)은 국 소 빈 혈 reperfusion 유도 장기 부상을 방지 하기 위해 유망 약 이다. 그것은 일반적으로 세포 관통 펩 티 드, 문신, 세포내 전달에 활용 됩니다. 그러나, 문신 일반적인 생물 학적 활동을 보이고 있다. 금 나노 입자 (GNPs) 인식된 독성 없이 약물 전달 매개체로 사용할 수 있습니다. 따라서, PKCδi를 제공 하는 한나라당/펩 티 드 하이브리드를 사용 했습니다. 두 개의 짧은 펩 티 드 (P2: CAAAAE 및 p 4: CAAAAW), 95:5 비율로 한나라당의 표면 특성을 수정 하는 데 했다. GNPs PKCδi (한나라당/PKCi)와 함께 활용 된 증류수, 안정는 0.9 %NaCl, 그리고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 소 혈 청 알 부 민 또는 소 태아 혈 청에 포함 된. 한나라당-PKCi의 정 맥 주입 이전 폐의 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 방지 하기 위해 표시 했다. 이 문서는 한나라당/PKCi 공식화 한나라당/PKCi의 physiochemical 속성을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 한나라당과 다른 펩 티 드 기반 약물을 공식화 하 유사한 방법을 사용 했습니다. 이 문서 잘하면이 소설 세포내 약물 전달 기술을 vivo에서 응용 프로그램에 더 많은 관심을 그릴 것입니다.
Introduction
폐 이식 말기 폐 질환1환자를 저장합니다. 그러나, 폐 이식 후 심각한 합병증 걸림돌이 남아 있다. 폐 이식 다음 초기 단계에서 기본 이식 부전 가장 유해한 합병증1이며 그 주요 원인이 국 소 빈 혈 reperfusion (IR)-유도 된 급성 폐 손상2.
차가운 보존에서 기증자 폐 물질 대사는 매우 낮은 수준으로 제한 됩니다. 그러나, 반응 산소 종 및 산화 질소 합성 혈액 흐름3의 중단으로 인해 활성화 됩니다. 이식 후 혈액 순환을 복원 하 고 반응성 산소 종 및 냉 허 혈 중에 생성 된 산화 질소 염증과 세포 죽음, 조직 상해의 결과 강화 한다.
부상을 방지 하기 위해 IR, 단백질 키 니 아 제 Cδ 억제제 (PKCδi)은 마음, 두뇌 및 폐4,,56,7,8에서 사용 되었습니다. 이러한 연구는 그 PKCδi 감소 염증 그리고 apoptosis reperfusion 동안 보여주었다. 그것은 또한 쥐 및 폐 이식 모델6폐 IR 부상을 하지 못했습니다. PKCδi은 일반적으로 세포 관통 펩 티 드, 문신, 세포내 배달용으로 활용 됩니다. 그러나, 그것은 혼자 문신 펩타이드는 일반적인 생물 학적 효과, angiogenesis, apoptosis, 그리고 여러 cytokines9,,1011의 금지의 승진을 포함 하 여 표시 되었습니다. 나노 입자, 작은 입자를 1에서 100 까지의 직경12nm 마약 배달13촉진에 후보자로 탐험 되었습니다. 특히, 금 나노 입자 (GNPs) 비 침 투 하 고 무 독성으로 간주 됩니다. 따라서, 우리는 펩 티 드 근거한 약14,15약물 전달 매개체로 GNPs를 개발 했습니다.
GNPs의 표면 분자 인식16,17, 화학 감지18, 이미징19, 약물 전달 등 특정 응용 프로그램에 대 한 조작할 수 있습니다. 20 nm GNPs 및 2 개의 짧은 펩 티 드를 포함 하는 한나라당/펩 티 드 하이브리드 시스템 개발 되었습니다 (P2: CAAAAE 및 p 4: CAAAAW) 비율로 95:5, GNPs의 표면 특성을 수정 하려면. P2 펩 티 드, 끝, 부정 청구 글루탐산 (E)와 함께 수성 해결책에서 GNPs 안정화 하 고 끝에, 소수 성 트립토판 (W)와 P4 펩타이드, GNPs 셀14로 입구. 이러한 펩 티이 드의 N terminus에 시스테인 (C) 잔류물 골드 표면14켤레 수 thiol 그룹을 포함 합니다. 이 펩 티 드/한나라당 하이브리드 추가 PKCδi (CSFNSYELGSL)를 전달 하기 위해 사용 되었다. PKCδi에 P2:P4의 최적화 된 어 금 니 비율은 47.5:2.5:50 이다. GNPs PKCδi (한나라당/PKCi)와 함께 활용 된 증류수, 0.9%에에서 안정적인 NaCl, 그리고 PBS 소 알 부 민 또는 소 태아 혈 청14를 포함 하는. 한나라당/PKCi의 정 맥 주입 폐15의 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 방지 하기 위해 표시 되었습니다. 이 문서에서는 한나라당/PKCi를 공식화 하는 방법에 설명 하 고 한나라당/PKCi의 물리 화학적 특성을 평가 하는 방법에 설명 합니다. 한나라당20,,2122에 활용 된 다른 펩 티 드 기반 약물을 공식화 하기 위해 유사한 방법을 사용 했습니다. 이 문서는 세포내 약물 전달에 대 한 소설이 공식에 더 많은 관심을 그릴 것입니다 바랍니다.
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Protocol
1입니다. 펩타이드 솔루션의 준비
- 검색은 펩 티 드 (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL)-20 ° C 냉장고를 상 온 (RT) 해 동.
참고: 병은 펩 티 드에 비응축에서 습기를 방지 하기 위해 폐쇄 유지. - 한 눈금에 각 펩 티 드의 0.01 g 무게. 별도 50 mL 원뿔 관으로 각 펩 티 드를 넣어.
- P2 튜브에 이온된 (DI) 수의 18.74 mL를 추가 합니다.
- P4 튜브를 디 물 16.93 mL를 추가 합니다.
- PKCδi 튜브를 디 물에 희석 50% 이기의 8.21 mL를 추가 합니다.
- 소용돌이 짧게 펩 티 드 솔루션. 5 분 동안 sonicator (40 MHz)에서 50 mL 원뿔 튜브를 넣어.
- Biosafety 캐비닛을 펩 티 드 솔루션을가지고. 준비 하는 모든 펩 티 드 솔루션 1 m m 이어야 한다입니다.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 각 펩 티 드 솔루션의 1 mL를 전송. P2, P4의 튜브에 디 물 19 mL을 추가 하 고 각 솔루션은 50 µ M을 희석 하 고 자체 튜브에 저장 되도록 PKCδi 튜브를 50% 이기의 19 개 mL를 추가.
2입니다. 한나라당/PKCi의 정립
- 펩 티 드 BSC에 한나라당 솔루션에 추가 되어야 한다
- 15 mL 튜브에 475 μ p2, P4의 25μL 및 δPKCi 솔루션의 500 μ를 추가 합니다. 같은 15 mL 튜브에 20 nm 한나라당 솔루션 (7.0x1011 입자/mL)의 9 mL를 추가 합니다.
- Biosafety 내각을 종료 합니다. 15 mL 튜브를 알루미늄 호 일로 감싸 줍니다. 두고 RT에서 통에 하룻밤.
- 캐비닛에 biosafety 샘플을 반환 합니다. 각 1.5 mL microtubes에 한나라당/PKCi의 aliquot 1 mL.
- 원심에 4 ° c.에 15,294 x g에서 30 분 동안 마이크로 원심 분리기 튜브
- 상쾌한 biosafety 캐비닛 아래 각 튜브에서 제거 합니다.
참고: 한나라당 펠 릿 그대로 유지 하 고 발음 하지는 상쾌한 제거를 주의 해야 합니다. - 다시 요구 하는 농도 따라 원하는 용 매에는 펠 릿을 일시 중단 합니다. 적용 가능한 용 매 디 물, 수 PBS, 0.9 %NaCl.
참고: 한나라당/PKCi의 1 mL에서 출발, 한나라당 펠 릿 1011 입자, 제조업체에서 제공 하는 한나라당 농도에 따라 x 6.3을 포함 되어 있습니다. 1.3 x 0.9%의 500 µ L에 1012 입자 관리를 NaCl, 0.9%의 232 µ L 추가 3 알 약의 각각에 NaCl. 함께 그들을 풀링 후 우리 다음 한나라당/PKCi 솔루션의 500 µ L을 수집할 수 있습니다.
참고: 원하는 혼합 용 매 한나라당/PKCi 펠 릿을 희석 하기 전에, 그렇지 않으면 한나라당/PKCi를 집계 합니다.
3. 한나라당/PKCi 하이브리드 용 해도의 평가
- 아크릴 베트에 한나라당/PKCi 솔루션의 0.5 mL를 붓으십시오. 대 일 분 광 광도 계에 아크릴 베트를 놓고 피크 흡수15를 테스트 합니다.
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Representative Results
주의 해야 한나라당/PKCi 하이브리드의 생물 속성을 평가 하기 위해 한나라당 경향으로 용 매에서 집계. 한나라당 집계 되는 경우 솔루션의 색상 분홍색에서 자주색 (그림 1a) 변경 합니다. 대 일 분 광 광도 계 더 민감하게 변화를 감지할 수 있다. 한나라당/PKCi 집계 되지 경우 흡수 피크 525에 있어야 한다 nm (그림 1b). 한나라당은 집계 흡수 피크 오른쪽으로 이동 됩니다. 분석, 집계 ΔOptical 밀도 형성 하는 경우의 대체 방법으로 (ΔOD 525에서 OD = nm-440에서 OD nm) 감소.
그림 1 : 한나라당/PKCi의 품질. (A) 제대로 준비 하는 한나라당/PKCi (왼쪽) 색깔에서 분홍색 이다. 집계 된 한나라당/PKCi 나타납니다 빛 보라색 (오른쪽). (B) 좋은 한나라당/PKCi 준비 물, PBS, 또는 0.9 %NaCl 용액에서 안정적입니다. UV-마주 분석기에 수치 표시 525에서의 흡수 피크가 모든 솔루션에 nm. (C) 좋은 나쁜 한나라당/PKCi 준비의 예입니다. 한나라당 집계 했다 흡수 피크는 오른쪽으로 이동 되었다. 또한, ΔOD 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
적절 한 배합을 보장 하기 위해, 그것은 중요 δPKCi 솔루션 1.6에서 설명 쥡니다 단계를 겪 습입니다. ΔPKCi 펩 티 드 순서는 sonicator 50% 이기 솔루션에서 PKCi를 녹이는 데 도움이 그래서 소수 moieties를 포함 되어 있습니다. 또한, 그것은 매우 꼼꼼하게, 2.7 단계에 설명 된 용 매를 혼합 하는 것이 중요입니다. 다음이 단계는 제대로 하지, 때문에 δPKCi 펩 티 드23의 집계 경우이 한나라당/PKCi 하이브리드는 하지 잘 공식화 됩니다.
한나라당 기반 약물 배합에는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, GNPs 종합 될 수 쉽게 몇 나노미터에서 ~ 100에 이르기까지 잘 제어 크기에 nm. 일반적으로, 더 작은 크기의 GNPs 제공할 수 있습니다 약물 세포로 큰 것 작은 것 들 수 쉽게 그들의 대상 지역24로 확산으로 보다 더 효율적으로. 둘째, GNPs는 그들에 게 안전한 약물 수송을 만드는 비 독성 생체 외에서 그리고 vivo에서25. 셋째, 소수 성 약물 수정된 GNPs26에 로드할 수 있습니다. GNPs의 표면 화학은 쉽게 특정 응용 프로그램에 대 한 수정 됩니다. 우리의 연구에 2 개의 짧은 펩 티 드 한나라당 표면, 생리 적 조건에서 안정 하 고 얻으며 새로운 bioactivities를 수정 하는 데 사용 됩니다. 펩 티 드 골드 바인딩, 간격, 및 기능 영역을 포함 하 여 3 개의 영역으로 신중 하 게 설계 되었다. 특히, 펩 티 드의 N terminus 시스테인 (C) 잔류물 골드 바인딩할 수 thiol 그룹을 포함 하는. 중간 부분에 4 개의 소수 알라닌 잔류물 펩 티 드 어셈블리는 GNPs에 밀도가 포장된 단층으로 홍보 있다. C terminus에 아미노산은 한 기능성 아미노산 바깥쪽 가리키는 GNPs의 표면 특성을 조작 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 두 펩 티 드의 95:5 비율은 이전 연구14에서 체계적으로 선정 되었다. PKCi 및 P2/P4 펩 티 드 사이 비율 또한 체계적으로 테스트 하 고15를 선택.
다른 한편으로, 한나라당 약물 전달 시스템에는 제한이 있습니다. GNPs 세포 유형 또는 조직 특정 되지 않습니다. GNPs는 주로 정 맥 관리27,,2829후 폐, 간, 그리고 비장에 축적 됩니다. 지금까지,이 수식은 단지 세포 배양 및 작은 동물에 테스트 되었습니다 모델. 임상 응용, 더 큰 동물 모델 및의 약 동학 연구를 번역, 조직 분포 및 잠재적인 독성 결정 될 필요가 있다.
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Disclosures
저자는이 프로젝트에 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (PJT-148847), 사역의 연구와 혁신의 온타리오 (재-08-029), 캐나다 첫 번째 연구의 우수 프로그램, 토론토 대학에서 디자인 하 여 의학에서 연구 보조금에 의해 지원 됩니다. 박사 Mingyao 리 우 제임스와 메리 Davie의 자 폐 상해, 수리, 및 재생 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
