Summary
בעבר השתמשנו היברידית פפטיד nanoparticle זהב להעביר דרך הווריד של פפטיד סינתטי, חלבון קינאז C-דלתא מעכב, אשר מופחת איסכמיה-פגיעה reperfusion-induced ריאות חריפה פציעה. הנה אנחנו מראים את פרוטוקול מפורט של ניסוח סמים. פפטידים תאיים אחרים יכול לנסח באופן דומה.
Abstract
מעכבי קינאז C-דלתא חלבון (PKCδi) היא תרופה מבטיח למנוע פגיעה איסכמיה-פגיעה reperfusion-induced איברים. זה הוא בדרך כלל מצומדת כדי חודר לתא פפטיד, TAT, למסירה תאיים. עם זאת, TAT הראו פעילות ביולוגית שאינם ספציפיים. חלקיקי זהב (GNPs) יכול לשמש גם ספקיות שירות משלוח סמים ללא רעילות שזוהה. לכן, השתמשנו היברידית תל ג/פפטיד להעביר PKCδi. 2. קצר פפטידים (P2: CAAAAE ו- P4: CAAAAW), ביחס 95:5, שימשו כדי לשנות את המאפיינים משטח של תל ג. GNPs מצומדת עם PKCδi (תל ג/PKCi) יציבים במים מזוקקים, 0.9% NaCl, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) המכיל שור אלבומין או סרום שור בעובר. תל ג-PKCi תוך ורידיות הוצגה קודם לכן כדי למנוע פגיעה reperfusion-איסכמיה פציעה של הריאה. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לגבש תל ג/PKCi ולהעריך את המאפיינים physiochemical של תל ג/PKCi. השתמשנו בשיטות דומות על מנת לגבש תרופות אחרות מבוססות-פפטיד עם תל ג. מאמר זה בתקווה ימשוך יותר תשומת לב הטכנלוגיה משלוח סמים תאיים הרומן ויישומיה ויוו.
Introduction
השתלת ריאה שומר בחולים עם מחלת ריאות בשלב הסופי1. עם זאת, סיבוכים חמורים לאחר השתלת ריאה נשארים מכשול. בשלבים המוקדמים בעקבות השתלת ריאה, תפקוד שתל העיקרי הוא סיבוך המזיקים ביותר1, את הגורם הראשוני הוא איסכמיה-פגיעה reperfusion (IR)-induced ריאות חריפה פגיעה2.
תחת שימור קר, חילוף החומרים ריאה התורם הוא מוגבל לרמה מאוד נמוכה. עם זאת, מינים חמצן תגובתי, תחמוצת החנקן סינתזה מופעלות עקב הפסקת זרימת הדם3. לאחר ההשתלה, מחזור הדם משוחזר, מינים חמצן תגובתי תחמוצת החנקן שנוצרו במהלך איסכמיה קר לשפר את דלקת מוות תאים, וכתוצאה מכך פגיעה ברקמות.
כדי למנוע פציעה IR, שימש מעכב Cδ קינאז חלבון (PKCδi), לב, מוח, ריאות4,5,6,7,8. מחקרים אלה הראו כי PKCδi ירד אפופטוזיס דלקות במהלך פגיעה reperfusion. זה גם מנעה פגיעה IR ריאתי בחולדות, מודל השתלת ריאות6. PKCδi היא מצומדת בדרך כלל עם חודר לתא פפטיד, TAT, למסירה תאיים. עם זאת, הוכח כי פפטיד TAT לבד יש השפעות ביולוגיות שאינם ספציפיים, כולל קידום של אנגיוגנזה, אפופטוזיס עיכוב של מספר ציטוקינים9,10,11. חלקיקים, חלקיקים קטנים הנע בין 1 ל- 100 ננומטר קוטר12, נחקרו זהה להקל על משלוח סמים13. בפרט, חלקיקי זהב (GNPs) נחשבים כמו לא פולשנית ולא רעילים. לכן, פיתחנו GNPs כמו ספקיות שירות משלוח סמים עבור מבוססת על פפטיד סמים14,15.
ניתן לטפל השטח של GNPs עבור יישומים ספציפיים כגון הכרה מולקולרית16,17, חישה כימית18, הדמיה19ומסירת סמים. פותחה מערכת היברידית תל ג/פפטיד, המכילה 20 ננומטר GNPs, שני פפטידים קצרים (P2: CAAAAE ו- P4: CAAAAW)-יחס 95:5, כדי לשנות את המאפיינים פני שטח של GNPs. פפטיד P2, עם החומצה גלוטמית טעונים שלילית (E) בסוף, מייצב GNPs בתמיסה המימית ומסייעת פפטיד P4, עם טריפטופן הידרופובי (W) בסוף, GNPs הכניסה לתוך תאים14. שאריות ציסטאין (ג) התחנה הסופית N של פפטידים אלה מכיל קבוצה תיול יכול נזווג משטחי זהב14. היברידית פפטיד/תל ג זו שימשה נוסף כדי לספק PKCδi (CSFNSYELGSL). היחס טוחנת אופטימיזציה של P2:P4 כדי PKCδi הוא 47.5:2.5:50. GNPs מצומדת עם PKCδi (תל ג/PKCi) הם יציבים במים מזוקקים, 0.9% NaCl, PBS המכיל אלבומין שור או עוברי סרום שור14. תל ג/PKCi תוך ורידיות הוכח כדי למנוע פגיעה reperfusion-איסכמיה פציעה של ריאות15. מאמר זה מתאר שיטה לגבש תל ג/PKCi, ומתאר כיצד להעריך את המאפיינים physicochemical של תל ג/PKCi. השתמשנו בשיטות דומות על מנת לגבש תרופות אחרות מבוססות-פפטיד מצומדת לתל ג20,21,22. אנו מקווים שמאמר זה ימשוך יותר תשומת לב זה ניסוח רומן למשלוח סמים תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פפטיד פתרונות
- אחזר את פפטידים (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) מן המקפיא-20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: לשמור את הבקבוק סגור כדי למנוע עיבוי על פפטידים לחות. - שוקלים 0.01 גר' כל פפטיד על microscale. לשים כל פפטיד לתוך צינור חרוטי נפרד 50 מ.
- להוסיף 18.74 מ ל מים (DI) יונים הצינור P2.
- להוסיף 16.93 מ ל מים DI הצינור P4.
- הוסף 8.21 מ של 50% acetonitrile מדולל במים DI אל הצינור PKCδi.
- מערבולת הפתרונות פפטיד בקצרה. לשים צינורות חרוט 50 מ ל sonicator (40 מגה-הרץ) במשך 5 דקות.
- מביאים את הפתרונות פפטיד אבטחה בארון. כל הפתרונות פפטיד מוכן צריך להיות 1 מ מ.
- להעביר 1 מ"ל של כל פתרון פפטיד צינור חרוטי 50 מ. להוסיף 19 מ ל מים DI הצינורות של P2, P4 ולהוסיף מ 19 ל 50% acetonitrile הצינור PKCδi, כך כל אחד מהפתרונות מדולל 50 מיקרומטר ומאוחסנים בצינור משלו.
2. ניסוח של תל ג/PKCi
- פפטידים צריך להתווסף הפתרון תל ג עדיין בזמן BSC
- הוספת μL 475 של P2, 25μL של P4 ו- 500 μL של פתרון δPKCi לתוך צינור 15 מ"ל. להוסיף 9 מ של 20 ננומטר תל ג פתרון (7.0x1011 חלקיק/mL) הצינור 15 מ"ל זהה.
- יציאה הקבינט אבטחה. לעטוף את הצינור 15 מ"ל ברדיד אלומיניום. . תשאיר את זה דולק מטרף-RT בן לילה
- להחזיר את הדגימות אבטחה הקבינט. Aliquot 1 מ"ל של תל ג/PKCi לתוך microtubes 1.5 מ ל כל אחד.
- Centrifuge צינורות מיקרו-ומפרידה למשך 30 דקות ב g x 15,294 ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע כל שפופרת תחת אבטחה ארון.
הערה: הקפד להסיר את תגובת שיקוע תוך הקפדה כי בגדר תל ג נשאר שלם, הוא לא aspirated. - מחדש להשעות בגדר של הממס הרצוי על פי הריכוז הנדרש. ממיסים רלוונטי יכול להיות די מים, PBS ו- 0.9% NaCl.
הערה: החל מ- 1 מ"ל של תל ג/PKCi, בגדר תל ג מכיל 6.3 x 10 חלקיקים11 , מבוסס על ריכוז תל ג המסופקים על ידי היצרן. כדי לנהל 1.3 x 10 חלקיקים12 ב- 500 µL של 0.9% NaCl, נוסיף 232 µL של 0.9% NaCl לכל אחד שלושה כדורי. לאחר צירוף אותם יחד, ואז לאסוף µL 500 של תל ג/PKCi פתרון.
הערה: לערבב את הרצוי ממס לפני דילול בגדר תל ג/PKCi, אחרת תל ג/PKCi צבירה.
3. הערכה של תל ג/PKCi היברידית מסיסות
- שופכים 0.5 מ של פתרון תל ג/PKCi לתוך cuvette אקריל. למקם את cuvette אקריל ספקטרופוטומטרים UV-Vis ובדוק את הקליטה של שיא15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צריך לקחת כדי להעריך את המאפיינים ביופיזיקלי של היברידית תל ג/PKCi, כפי תל ג נוטה צבירה של הממס. כאשר תל ג נצבר, הצבע של הפתרון משתנה מוורוד לסגול (איור 1 א'). ספקטרופוטומטרים UV-Vis הוא מסוגל לזהות את השינויים יותר ברגישות. אם תל ג/PKCi לא נצבר הפסגה של קליטה צריך להיות 525 nm (איור 1b). אם התוצר נצבר, הפסגה של ספיגת יוסטו מימין. כמו שיטת חלופית של ניתוח, כאשר אגרגטים יצרו את ΔOptical צפיפות (ΔOD = OD-525 nm - OD-440 ננומטר) פוחתת.
איור 1 : איכות של תל ג/PKCi. (א) הוכן כראוי תל ג/PKCi ורוד בצבע (משמאל). צבור תל ג/PKCi מופיע אור סגול (מימין). (B) הכנה טובה תל ג/PKCi יציב במים, PBS, או ב- 0.9% NaCl פתרון. קריאות על ספקטרומטר UV-Vis ציין כי הפסגה של הקליטה היה ב 525 nm, כל הפתרונות. (ג) דוגמה ההכנות תל ג/PKCi טוב ורע. כאשר התוצר היה המצטברים, הפסגה של הקליטה היה זז ימינה. יתר על כן, ΔOD ירד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להבטיח ניסוח תקין, חשוב כי הפתרון δPKCi עובר את השלב sonication המתוארות ב 1.6. ΔPKCi פפטיד רצף מכיל moieties הידרופוביות, כך sonicator מסייע המסת PKCi בפתרון 50% acetonitrile. בנוסף, חשוב מאוד לערבב הממס בקפידה, כמתואר בשלב 2.7. היברידית תל ג/PKCi לא טוב יגובש אם שלבים אלה אינם נעשים כראוי, עקב הצבירה של פפטיד δPKCi23.
ניסוח סמים תל ג מספקת מספר יתרונות. קודם כל, להיות מסונתז GNPs בקלות לפי הגדלים מבוקרים היטב, ועד כמה ננומטר ~ 100 ננומטר. בדרך כלל, GNPs בגודל קטן יותר יכול לספק סמים לתוך תאים באופן יעיל יותר גדולים כמו הקטנים ניתן לפזר בקלות לתוך שלהם אזור היעד24. שנית, GNPs אינם רעיל במבחנה, ויוו25, הפיכתם התרופה בטוחה נשאים. שלישית, הידרופובי סמים יכול לטעון ששונה GNPs26. והלאה, הכימיה פני השטח של GNPs ברצון משתנה עבור יישומים ספציפיים. במחקרים שלנו, שני פפטידים קצרים משמשים לשינוי פני השטח תל ג, כדי לייצב אותם בתנאים פיזיולוגיים להקנות את bioactivities החדשה. פפטידים תוכננו בהרהור עם שלושה אזורים כולל איגוד זהב, מרווח בין אזורים פונקציונליים. באופן ספציפי, הסופית N של פפטיד יש שאריות ציסטאין (ג) המכיל קבוצה תיול ניתן לאגד עם זהב. החלק האמצעי יש ארבע שאריות אלנין הידרופובי לקדם פפטיד הרכבה לתוך חד שכבתי בצפיפות על GNPs. החומצה אמינית התחנה הסופית C היא פונקציונלי חומצת אמינו כלפי חוץ, אשר יכול לשמש כדי לתפעל את מאפייני GNPs פני השטח. היחס 95:5 של אלה שני פפטידים נבחר מערכתית במחקר הקודם14. היחס בין PKCi ו- P2/P4 פפטידים נבחנה גם מערכתית ונבחר15.
מצד שני, מערכת משלוח סמים תל ג יש מגבלות. GNPs אינם סוג התא או רקמות ספציפיות. GNPs הם בעיקר שהצטברו בתוך הריאות, הכבד, הטחול לאחר עירוי לוריד27,28,29. עד כה, נוסחה זו נבדק רק תרבית תאים, חיים קטן מודלים. כדי לתרגם את זה יישום קליני, עוד יותר מחקרים על מודלים בעלי חיים גדולים, פרמקוקינטיקה שלה, רעילות לרקמות הפצה ופוטנציאל צריך להיקבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף על הפרויקט הזה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר קנדי מוסדות הבריאות מחקר (PJT-148847), משרד של מחקר, חדשנות של אונטריו (RE-08-029), קנדה הראשון של מצוינות תכנית המחקר, רפואה על ידי עיצוב באוניברסיטת טורונטו. ד ר Mingyao ליו הוא ג'יימס וכיסא דייוי מרי ב פגיעת ריאות, תיקון והתחדשות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
