Summary
我们以前使用过一种金纳米多肽混合体静脉注射一种合成肽, 即蛋白激酶 c-三角洲抑制剂, 减少缺血再灌注引起的急性肺损伤。在这里, 我们展示了药物配方的详细协议。其他细胞内肽也可以类似地配制。
Abstract
蛋白激酶 c-三角洲抑制剂 (pkcc i) 是一种很有前途的预防缺血再灌注所致器官损伤的药物。它通常与细胞穿透性肽 tat 结合, 用于细胞内分娩。然而, tat 显示了非特异性的生物活动。金纳米颗粒 (gnps) 可用作药物输送载体, 而不具有公认的毒性。因此, 我们使用了 gnp肽杂化剂来传递 pkc i。以95:5 的比例使用了两个短肽 (p2:caaae 和 p4:caaaaw) 来修正 gnp 的表面特性。与 pkcc i (gnp/pkgi) 结合的 gnp 在蒸馏水、0.9% 氯化钠和含牛血清白蛋白或胎儿牛血清的磷酸盐缓冲盐水中均稳定。静脉注射 gnp-pki 对肺缺血再灌注损伤有明显的预防作用。本文概述了制定 gnp/pkci 和评价 gnp/pkci 理化性质的方案。我们采用了类似的方法来制定其他具有国民生产总值的含肽药物。希望本文能引起人们对这种新型细胞内药物输送技术及其在体内应用的更多关注。
Introduction
肺移植挽救终末期肺病 1.然而, 肺移植后的严重并发症仍然是一个障碍。在肺移植术后早期, 原发性移植物功能障碍是最有害的并发症1, 其主要原因是缺血再灌注 (ir) 致急性肺损伤2。
在冷保存条件下, 供体肺的代谢被限制在很低的水平。然而, 活性氧和一氧化氮合成被激活, 由于停止血液流动 3。移植后, 血液循环恢复, 冷缺血过程中产生的活性氧和一氧化氮会增强炎症和细胞死亡, 导致组织损伤。
为预防红外损伤, 在心脏、大脑和肺4、5、6、7、8中使用了蛋白激酶 c 抑制剂 (pkc i)。这些研究表明, pkcc i 减少了再灌注过程中的炎症和凋亡。它还可以防止大鼠和第6型肺移植模型的肺 ir 损伤。pkc i 通常与细胞内穿透性肽 tat 结合, 用于细胞内分娩。然而, 事实表明, 仅 tat 肽具有非特异性的生物学效应, 包括促进血管生成, 凋亡, 并抑制多种细胞因子9,10,11。纳米粒子, 直径为 12的小颗粒, 已被探索为促进药物输送的候选物质 13.特别是, 金纳米粒子 (gnps) 被认为是无创和无毒的。因此, 我们开发了 gnp 作为肽基药物的药物传递载体 14,15。
gnps 的表面可用于分子识别16、17、化学传感18、成像19和药物输送等特定应用。开发了一种 gnp 肽混合体系, 该系统以95:5 的比例, 含有20纳米 gnp 和两个短肽 (p2:caaaae 和 p4:caaaaw), 以改变 gnp 的表面特性。p2 肽, 与带负电荷谷氨酸 (e) 的末端, 稳定 gnp 在水溶液中, 而 p4 肽, 与疏水色氨酸 (w) 在末端, 帮助 gnp 进入细胞14。这些肽 n 端的半胱氨酸 (c) 残留物含有硫醇基团, 可与金表面结合 14.该杂交种进一步用于 pkcgi (csfsyelgsl) 的制备。p2:p4 与 pkcci 的优化摩尔比为4.5:2.5:50。与 pkcc i (gnp/pkci) 结合的 gnp 在蒸馏水、0.9% 氯化钠和含有牛白蛋白或胎儿牛血清的pbs 中稳定。静脉注射 gnpmci 可预防肺缺血再灌注损伤 15.本文概述了一种制备 gnp/pkci 的方法, 并对 gnp/pkci 的理化性质进行了评价。我们使用了类似的方法来制定其他与 gnp20、21、22结合的基于肽的药物。我们希望本文能引起人们对这种新型细胞内药物输送制剂的更多关注。
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Protocol
1. 多肽溶液的制备
- 从-20°c 的冷冻机中提取多肽 (p2:caaaae, p4:caaaaw, pkkcci:csfnsyelgsl), 并在室温下解冻 (rt)。
注: 保持瓶子关闭, 以防止水分凝结在肽上。 - 在微观上称量每个肽 0.01 g。将每个肽放入一个单独的50毫升锥形管。
- 在 p2 管中加入18.74 毫升的去离子水。
- 在 p4 管中加入16.93 毫升的 di 水。
- 在 di 水中稀释50% 乙腈8.21 毫升至 pkcc i 管中。
- 短暂的旋涡肽溶液。将50毫升锥形管放入声纳 (40 mhz) 5分钟。
- 将肽溶液带到生物安全柜。制备的所有肽溶液应为 1 mm。
- 将每个肽溶液的1毫升转移到一个新的 50 ml 锥形管。在 p2 和 p4 管中加入19毫升 di 水, 并在 pkcc i 管中加入19毫升的50% 乙腈, 使每个溶液稀释到 50μm, 并储存在自己的试管中。
2. gnpmci 制剂
- 在 bsc 中仍在使用多肽的同时, 应将多肽添加到 gnp 解决方案中
- 在15毫升管中加入475μl 的 p2、25μl 的 p4 和500μl 的 pkti 溶液。在相同的15毫升管中加入9毫升的 20 nm gnp 溶液 (7.0x10 11 菌).
- 退出生物安全柜。用铝箔包裹15毫升管。把它放在 rt 的摇床上过夜。
- 将样品退回生物安全柜。将 gnp/pkci 的1毫升注入每个 1.5 ml 微管中。
- 在4°c 的 15 294 xg 下, 用微型离心机离心管30分钟。
- 从生物安全柜下的每个管中取出上清液。
注: 请小心去除上清液, 同时确保 gnp 颗粒保持完好且未吸气。 - 根据所需的浓度将颗粒重新悬浮在所需的溶剂中。适用溶剂可以是 di 水、pbs 和0.9% 氯化钠。
注: 从 gnp/pkti 开始, gnp 颗粒含有 6.3 x10 11粒颗粒, 以制造商提供的 gnp 浓度为基础。为了在 500μl中给出 1.3 x 10 12 粒颗粒, 使其达到0.9% 氯化碳, 我们在三个颗粒中的每一个颗粒上添加 232μl 0.9% 氯化碳。在将它们汇集在一起后, 我们可以收集500μl 的 gnp/pkci 解决方案。
注: 在稀释 gnpmci 颗粒之前, 请将所需的溶剂混合均匀, 否则 gnpmci 将聚集在一起。
3. gnp/pkci 杂分辨率的评估
- 将 gnp/pkci 溶液 0.5 ml 注入丙烯酸基立方。将丙烯酸酯放在 uv-vis 分光光度计上, 测试峰值吸收15。
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Representative Results
应注意评估 gnpmci 杂交种的生物物理特性, 因为 gnp 倾向于在溶剂中聚合。当 gnp 聚合时, 溶液的颜色将从粉红色变为紫色 (图 1a)。uv-vis 分光光度计能够更灵敏地检测到变化。如果 gnp/pkci 不聚合, 吸收的峰值应为 525 nm (图 1b)。如果国民生产总值是汇总的, 吸收的高峰将转移到右边。作为另一种分析方法, 当聚合物形成了光学密度 (od = 525 纳米的 od-440 nm 时的 od) 会减少。
图 1: gnp/pkci 的质量.(a) 准备得当的 gnp/pkci 是粉红色的 (左)。聚合 gnp/pkci 显示为浅紫色 (右)。(b) 良好的 gnp/pkci 制剂在水、pbs 或0.9% 氯化钠溶液中稳定。uv-vis 光谱仪的读数表明, 在所有溶液中, 吸收的峰值都是525纳米。(c) gnpxci 制剂的好坏的一个例子。当国民生产总值被汇总时, 吸收的高峰就转移到了右边。此外, od 减少。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
为了确保正确的配方, 至关重要的是, pkgi 解决方案要经历1.6 中概述的声纳步骤。pkgi 肽序列含有疏水的分子, 因此超声器有助于在50% 乙腈溶液中溶解 pkgi。此外, 如步骤2.7 中所述, 精心混合溶剂也是非常重要的。 gnp / pkci 将不是很好地制定 , 如果这些步骤不正确 , 由于聚集的 pkci 肽23。
基于 gnp 的药物配方提供了几个优点。首先, gnps 可以很容易地合成在良好的控制大小, 从几纳米到 ~ 100 纳米。通常情况下, 较小的 gnps 可以比较大的 gnps 更有效地将药物输送到细胞中, 因为较小的 gnps 可以很容易地扩散到其目标区域24。 其次, gnps 在体外和体内无毒25, 使其成为安全的药物载体。 第三, 疏水药物可以加载到修改后的 gnp26上。 第四, gnps 的表面化学很容易被修改到特定的应用中。在我们的研究中, 两个短肽被用来修饰 gnp 表面, 在生理条件下稳定它们, 并赋予新的生物活性。多肽经过精心设计, 有三个区域, 包括金结合、间距和功能区域。 具体而言, 该肽的 n 终点含有半胱氨酸 (c) 残留物, 含有硫醇基团, 可与黄金结合。中间部分有四个疏水丙氨酸残基, 以促进肽组装成一个密集的包装单层上的 gnp。c 终点的氨基酸是一种指向外的功能性氨基酸, 可用于操纵 gnp 的表面特性。这两个肽的95:5 比在以前的研究14中被系统地选择。并对 pkgi 和 p2p4 肽的比例进行了系统测试, 选择了 15。
另一方面, 国民生产总值药物输送系统也有局限性。gnp 不是细胞类型或组织特异性。gnps 主要在静脉注射27,28, 29后的肺、肝和脾中积累。到目前为止, 这种配方只在细胞培养和小动物模型中进行了测试。为了将其转化为临床应用, 需要进一步研究大型动物模型及其药代动力学、组织分布和潜在毒性。
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Disclosures
作者在这个项目上没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大卫生研究所 (pjt-148847)、安大略省研究和创新部 (re-08-029) 和加拿大首次卓越研究方案----多伦多大学设计医学方案----的研究赠款的支持。刘明耀博士是《肺损伤、修复和再生》的詹姆斯和玛丽·戴维斯主席。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
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