Summary
Vi har tidigare använt en guld nanopartiklar peptid hybrid intravenöst leverera en syntetisk peptid, C-delta proteinkinashämmare, vilket minskade ischemi-reperfusion-inducerad akut lungskada. Här visar vi det detaljerade protokollet av drogen formuleringen. Andra intracellulära peptider kan formuleras på samma sätt.
Abstract
C-delta proteinkinashämmare (PKCδi) är en lovande läkemedel för att förhindra ischemi-reperfusion-inducerad organ skada. Det är oftast konjugerat till en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. TAT har emellertid visat ospecifika biologiska aktiviteter. Guldnanopartiklar (BNI) kan användas som drogen leverans bärare utan erkända toxicitet. Därför har vi använt en GNP/peptid hybrid för att leverera PKCδi. Två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW), i förhållandet 95:5, användes för att modifiera ytegenskaper av BNP. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabila i destillerat vatten, 0,9% NaCl och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande bovint serum albumin eller fetalt bovint serum. Intravenös injektion av GNP-PKCi var tidigare visat att förhindra ischemi-reperfusionsskada i lungan. Denna artikel beskriver ett protokoll för att formulera GNP/PKCi och bedöma fysiokemiska egenskaper GNP/PKCi. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger med BNP. Denna artikel kommer förhoppningsvis dra mer uppmärksamhet till denna roman intracellulära drogen leverans teknik och dess tillämpningar i vivo.
Introduction
Lungtransplantation sparar patienter med slutstadiet lung sjukdom1. Allvarliga komplikationer efter lungtransplantation är dock ett hinder. I ett tidigt skede efter lungtransplantation, primära transplantatdysfunktion är den mest skadliga komplikation1och dess primära orsak är ischemi-reperfusion (IR)-inducerad akut lung skada2.
Under kalla konservering är metabolism i en donator lunga begränsad till en mycket låg nivå. Dock aktiveras reaktiva syreradikaler och kväveoxid syntesen på grund av upphörande av blod flöde3. Efter transplantation, blodcirkulationen är återställd, och reaktiva syreradikaler och kväveoxid som genereras under kall ischemi öka inflammation och celldöd död, vilket resulterar i vävnadsskada.
För att förhindra IR skada, har en Cδ proteinkinashämmare (PKCδi) använts i hjärta, hjärna och lungor4,5,6,7,8. Dessa studier visade att PKCδi minskade inflammation och apoptos under reperfusion. Det har också förhindrat pulmonell IR skada i råttor och en lung transplantation modell6. PKCδi är vanligtvis konjugerat med en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. Det har dock visat att TAT peptiden ensam har ospecifika biologiska effekter, inbegripet främjande av angiogenes, apoptos och hämning av flera cytokiner9,10,11. Nanopartiklar, små partiklar som sträcker sig från 1 till 100 nm i diameter12, har undersökts som kandidater för att underlätta drogen leverans13. I synnerhet betraktas guld nanopartiklar (BNI) som icke-invasiv och giftfritt. Därför har vi utvecklat BNI som drogen leverans bärare för peptid-baserad droger14,15.
Ytan av BNI kan manipuleras för specifika applikationer såsom molekylär igenkänning16,17, kemiska fjärranalys18, imaging19och drug delivery. En GNP/peptid hybrid-systemet har utvecklats, som innehåller 20 nm BNI och två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW) i förhållandet 95:5, att ändra ytegenskaper av BNI. P2 peptiden, med negativt laddad glutaminsyra (E) i slutet, stabiliserar BNI i vattenlösning, och P4 peptiden, med den hydrofoba tryptofan (W) i slutet, hjälper BNI hänrycka in i celler14. Cysteinrest (C) vid den N ändstationen av dessa peptider innehåller en tiolgrupp som kan böja till guld ytor14. Denna peptid/GNP hybrid användes ytterligare att leverera PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimerad molar förhållandet av P2:P4 till PKCδi är 47.5:2.5:50. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabil i destillerat vatten, 0,9% NaCl och PBS som innehåller bovint albumin eller fetalt bovint serum14. Intravenös injektion av GNP/PKCi har visat sig förhindra ischemi-reperfusionsskada av lungcancer15. Denna artikel beskriver en metod för att formulera GNP/PKCi och beskriver hur du utvärdera GNP/PKCi fysikalisk-kemiska egenskaper. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger konjugerat till GNP20,21,22. Vi hoppas att denna artikel kommer att dra mer uppmärksamhet åt denna nya formulering för intracellulära drogen leverans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av peptid lösningar
- Hämta peptiderna (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) från-20 ° C frysen och Tina i rumstemperatur (RT).
Obs: Håll flaskan stängd för att förhindra att fukt från kondenserande på peptiderna. - Väga 0,01 g av varje peptid på en hur provtagningsutrustningen skall. Tas varje peptid i ett separat 50 mL koniska rör.
- Tillsätt 18.74 mL avjoniserat vatten (DI) vatten till P2-röret.
- Tillsätt 16.93 mL DI vatten till P4 röret.
- Tillsätt 8,21 mL 50% acetonitril utspädd i DI vatten till PKCδi röret.
- Vortex peptid lösningarna kort. Lägg 50 mL koniska rören i en någon sonikator (40 MHz) för 5 min.
- Föra de peptid lösningarna till en biosäkerhet skåp. Alla peptid lösningar beredda bör vara 1 mM.
- Över 1 mL varje peptid lösningen till en 50 mL konisk reservrör. Lägg 19 mL DI vatten till rören av P2 och P4 och 19 mL 50% acetonitril till PKCδi röret, så att varje lösning späds ut till 50 µM och lagras i egna rör.
2. formulering av BNI/PKCi
- Peptider bör läggas till GNP lösningen medan fortfarande i BSC
- Tillsätt 475 μL av P2, 25μL av P4 och 500 μL av δPKCi lösning i en 15 mL tub. Lägga till 9 mL 20 nm GNP lösning (7.0x1011 partikel/mL) i en och samma 15 mL tub.
- Avfart biosäkerhet skåpet. Linda 15 mL röret med aluminiumfolie. Lämna den på en shaker på RT över natten.
- Tillbaka proven till biosäkerhet skåp. Alikvotens 1 mL GNP/PKCi till varje 1,5 mL mikrorör.
- Centrifugera rören i en mikro-Centrifugera under 30 minuter vid 15 294 x g vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten från varje rör under en biosäkerhet skåp.
Obs: Var noga med att avlägsna supernatanten samtidigt att GNP pelleten förblir intakt och inte är aspirerade. - Resuspendera pelleten i önskad lösningsmedlet enligt den koncentration som krävs. Tillämpliga lösningsmedel kan vara DI vatten, PBS och 0,9% NaCl.
Obs: Start från 1 mL GNP/PKCi, innehåller GNP pelleten 6,3 x 1011 partiklar, baserat på GNP koncentrationen som tillhandahålls av tillverkaren. Att administrera 1,3 x 1012 partiklar i 500 µL av 0,9% NaCl, vi lägger till 232 µL av 0,9% NaCl till var och en av tre pellets. Efter sammanslagning dem tillsammans, kan vi sedan samla 500 µL GNP/PKCi lösning.
Obs: Blanda önskad lösningsmedel väl före spädning GNP/PKCi pelleten, annars den GNP/PKCi kommer aggregera.
3. bedömning av BNI/PKCi Hybrid löslighet
- Häll 0,5 mL GNP/PKCi lösning i en acryl kyvetten. Placera den acryl kyvetten på en UV-Vis-spektrofotometer och testa de maximala absorption15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Försiktighet bör iakttas att utvärdera biofysiska egenskaper av GNP/PKCi hybrid, eftersom GNP tenderar att aggregera i lösningsmedel. När GNP aggregeras, ändras färgen på lösningen från rosa till lila (figur 1a). UV-Vis spektrofotometer är kunna identifiera ändringarna känsligare. Om den GNP/PKCi inte sammanställs toppen av absorption bör vara på 525 nm (figur 1b). Om BNP aggregeras, att toppen av absorption skifta till höger. Som en alternativ metod för analys, när aggregat har bildat ΔOptical densitet (ΔOD = OD på 525 nm - OD vid 440 nm) minskar.
Figur 1 : Kvalitet av BNI/PKCi. (A) ordentligt förberedd GNP/PKCi är rosa i färg (vänster). Aggregerade GNP/PKCi visas ljus lila (höger). (B) bra GNP/PKCi beredning är stabil i vattnet, PBS, eller 0,9% NaCl-lösning. Avläsningar på en UV-Vis-spektrometer tydde på att toppen av absorption på 525 nm i alla lösningar. (C) ett exempel på bra och dåliga GNP/PKCi preparat. När BNP var sammanställd, skiftades toppen av absorption till höger. Dessutom minskade ΔOD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att säkerställa korrekt formulering, är det viktigt att δPKCi lösningen genomgår den ultraljudsbehandling steg beskrivs i 1.6. ΔPKCi peptid sekvens innehåller hydrofoba delarna, så en någon sonikator bistår i upplösning PKCi i 50% acetonitril lösningen. Dessutom är det mycket viktigt att blanda spädningsvätskan minutiöst, som beskrivs i steg 2,7. GNP/PKCi hybrid kommer inte vara väl formulerade om dessa steg inte göras ordentligt, på grund av aggregering av den δPKCi peptid23.
BNI drog formulering ger flera fördelar. Först, BNI enkelt kan syntetiseras i välkontrollerade storlekar, alltifrån några nanometer till ~ 100 nm. Vanligtvis kan de mindre storlek BNI leverera droger in cellerna mer effektivt än de större som de mindre som kan lätt diffunderar in deras mål regionen24. Det andra är BNI giftfri in vitro- och in vivo25, vilket gör dem säkert läkemedel bärare. Tredje, hydrofoba droger kan vara laddad på den modifierade BNI26. Ytkemi av BNI är tillbaka, lätt modifierad för specifika applikationer. I våra studier används två kort peptider för att ändra GNP ytan, för att stabilisera dem i fysiologiska förhållanden och sprida nya bioactivities. Peptiderna utformades omsorgsfullt med tre regioner inklusive guld bindande, avstånd och funktionella regioner. Specifikt har N terminalen av peptiden cysteinrest (C) som innehåller tiolgrupp som kan binda med guld. Mittpartiet har fyra hydrofoba alanin rester att främja peptid församlingen till ett tätt packade enskiktslager på medlemsstaternas bruttonationalinkomst. Den amino syran på C terminus är en funktionell aminosyra som pekar utåt, som kan användas för att manipulera ytegenskaper av BNI. 95:5 förhållandet mellan dessa två peptider valdes systemiskt i en tidigare studie14. Förhållandet mellan PKCi och P2/P4 peptider testades också systemiskt och valt15.
Däremot, har GNP drogen leveranssystemet begränsningar. BNI är inte celltyp eller vävnad specifika. BNI ackumuleras främst i lungan, levern och mjälten efter intravenös administrering27,28,29. Denna formel har hittills endast testats i cellkultur och litet djur modeller. För att översätta det till klinisk tillämpning, ytterligare studier på stora djurmodeller och dess farmakokinetik, vävnad distribution och potentiella toxicitet behöver fastställas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja på detta projekt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av forskningsanslag från kanadensiska institut för hälsa forskning (PJT-148847), ministeriet för forskning och Innovation av Ontario (RE-08-029) och Kanada första forskning av Excellence Program, medicin genom Design vid University of Toronto. Dr. Mingyao Liu är James och Mary Davie stol i lungskada, reparation och förnyelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
