Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

Abstract

עבור החקירה של לוקליזציה חלבון וסחר באמצעות הדמיה תא חי, החוקרים מסתמכים בדרך כלל על פיוזינג חלבון שלהם לעניין כתב פלורסנט. הרשימה מתפתחת ללא הרף של חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית (FPs) מציג משתמשים עם מספר חלופות כשמדובר עיצוב פיוז'ן פלורסנט. FP כל בעלת תכונות אופטי ו biophysical ספציפיים שיכולים להשפיע על מאפייני הביוכימי, סלולר ופונקציונלי fusions פלורסנט וכתוצאה מכך. למשל, כמה FPs נוטים ליצור oligomers לא ספציפית כי הם רגישים כדי להכשיל על הפונקציה של הזוג פיוז'ן. למרבה הצער, רק כמה שיטות קיימות כדי לבחון את ההשפעה של FPs על ההתנהגות של הכתב פלורסנט. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת את ההערכה המהירה של ההשפעה של FPs באמצעות מבחני רעילות polyglutamine (polyQ) בשמרים ניצני האפייה. חלבונים huntingtin מורחב-PolyQ קשורים עם תחילתה של מחלת הנטינגטון (HD), איפה huntingtin המורחב אגרגטים לתוך oligomers רעילים וגופים הכללה. צבירה של רעילות polyQ הרחבות בשמרים הם תלויים במידה רבה רצפי איגוף באזור polyQ, כולל הנוכחות של תגיות פלורסנט, ובכך מספק פלטפורמה ניסיוני אידיאלי לחקור את ההשפעה של FPs על התנהלות שלהם שותף פיוז'ן.

Introduction

מאז פותחו האפיון הראשוני של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויקטוריה Aequorea1, לוח צבעים רחב של מקודדים גנטית FPs, ומאפשר תא ביולוגים בו-זמנית לשפה ולעקוב מרובים אירועים/החלבונים חי תאים2,3. FPs נגזרות אורגניזמים מרובים, מן המדוזה אלמוגים, ולכן, הצגת מאפייני biophysical ספציפי המסיטים בהרחבה מעבר ספקטרום פלורסנט המתאימים שלהם. מאפיינים אלה כוללים בהירות, פוטוסטביליטי נטייה oligomerize בין היתר2,4. בחירת monomeric FPs היא היבט חשוב בבחירה של תג מתאים בעת עיצוב כתב פלורסנט, על מנת למזער אינטראקציות בלתי הולם והשינויים של הפונקציה של השותף פיוז'ן, למקסם את היעילות כתב עבור בהתחשב תא הסלולר-4,-5,-6. בעוד ה-GFP, לאורך זמן, התפתח כדי לצמצם את ההשפעה של הוספת תגית פלורסנט של פיוז'ן שותף5,7,8, כמה גרסאות חדשות FP לבצע בהשוואה ל GFP נשאר קשה להעריך.

כמה שיטות קיימות כדי לאפיין את אופן הפעולה של FPs. רובן כוללות בדיקת מאפיינים ביופיזיקלי של FPs שימוש בגישות ביוכימיים, כגון ultracentrifugation, ג'ל סינון פרוטוקולים9,10,11,12. שיטות כאלה יש אזהרה של שימוש FPs מטוהרים בפתרון, מציע תובנה קטנה התנהגותם בתאים ללא פגע. הפיתוח של ההצעות assay מאורגן חלקה רשתית תוך-פלזמית (OSER) הערכה הניתנת לכימות של נטייה FPs' oligomerize חי תאים13 על-ידי בדיקת היכולת של overexpressed FPs כדי לארגן מחדש את רשתית תוך-פלזמית בקוריאנית לתוך OSER דורים14. טכניקה זו בהצלחה לזהות שינויים בין גרסאות monomeric ו- oligomeric של ה-GFP, FPs אחרים. עם זאת, זה מסתמך בעיקר על ביטוי בתאים transiently transfected, כימות וניתוח התמונה פקוקה אלא אם הטכניקה מאומצת כמו איסוף נתונים אוטומטי של ניתוח זרימת העבודה.

על מנת להשלים את הגישות האלה, הקמנו וזמינותו כי מנצל את ההשפעה של פלורסנט תגים על רעילות, צבירה של הרחבות polyQ שמרים15,16. הרחבת רצועת polyQ עם יותר מ 36 חוזר בתוך אקסון הראשון של ג'ין קידוד שהחלבון huntingtin (Htt) מזוהה עם מחלת הנטינגטון17,18. הביטוי של Htt המורחבex1 בתוצאות שמרים ב צבירה חזקה של החלבון Htt misfolded מצמידים פגם חמור צמיחה. מעניין, אלה פנוטיפים חריפה מושפעים את רצפי איגוף רצועת polyQ, כולל FPs15,16. זה היה מיוחד כי מאפיינים שונים של FPs יכול להשפיע באופן שונה רעילות polyQ שמרים. ואכן, בהשוואה ל- FPs כמו GFP, חלבונים ניאון אדום וטפסים מפותחת שלהם הראו מופחתת רעילות, צבירת16. כתב יד זה מספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את ההשפעה של הדור הבא של FPs על רעילות polyQ, צבירה של שמרים. Assay זו מאפשרת ניתוח מהיר ולא פוטנציאל גבוה-תוכן של גרסאות FP שיכול לשמש במקביל בעבר מאופיין טכניקות אופטימלית אפיון חדש FPs וניתן להעריך כיצד הם לבצע בהשוואה ל- GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מהדור החדש Htt מתויג Fluorescentlyex1 כתבים עבור ביטוי בשמרים

הערה: סעיף זה השתנה מן הפרוטוקול על ידי ג'יאנג. et al. 16 ו. Albakri et al. 19.

  1. עיצוב תחל כדי להגביר את רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי או ריבית על-ידי ה-PCR. פריימר לפנים צריכה לכלול רצף מנהיג על מנת לסייע את אנזים הגבלה במהלך העיכול (GATC), ואחריו אתר ההגבלה SpeI (ACTAGT) ו 20 בסיסים downstream של ATG (למעט ATG) של הגן חלבון פלואורסצנטי עניין. ומהצמיגים הפוכה צריכה לכלול את רצף מנהיג (GATC), ואחריו אתר ההגבלה סאלי (GTCGAC), המשלים הפוכה של 20 בסיסי במעלה הזרם stop codon של הרצף FP (כולל הפסקה).
  2. באמצעות תחל את תוכנן בשלב 1.1, לבצע את תגובת ה-PCR של thermocycler באמצעות ההגדרות הבאות: חום עד 95 ° C 1 דקות, מחזור 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לכל kB של מוצר ה-PCR. ביצוע מחזורים 18 נמצא בשפע.
  3. להפעיל את תגובת ה-PCR ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). שם צריך להקה יחיד התואם לגודל המוצר הצפוי. לבודד את המקטע בעזרת ערכת טיהור ג'ל.
  4. הפרוטוקול מעסיקה וקטורex1 Htt נושאת 25 (בלתי רעיל), 72 (HD-הקשורים, הצגת צבירה חזק) polyQ חוזר. לעכל את השברים PCR והן את הווקטור עם אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
  5. לטהר את הווקטור מתעכל על ידי פועל זה ג'ל agarose כמו שלב 1.3.
  6. לטהר את המקטע PCR מעוכל בעזרת ערכת טיהור PCR.
  7. מאתרים ומפסיקים את השבר שנוצר מתעכל PCR ו- p415 -GAL1-דגל--25/72QpolyQ פלסמידים1 שימוש T4 ליגאז (1h בטמפרטורת החדר). השתמש לתגובה 10 µL (µL 1 של האנזים T4, µL 1 מאגר X 10, 6 µL של קטע ה-PCR ו- 2 µL של וקטור).
  8. להפוך את 2 µL של התגובה מצדו לתוך 50 µL של Escherichia coli-תאים המוסמכת דגירה אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, חום-הלם התאים ב 42 ° C ל 30 ס' הוסף 1 מ"ל של מדיה תוצר SOC, דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ב שייקר. צלחת µL 200 התגובה על צלחת LB-אגר המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. בחר שלוש מושבות חיידקים בודדים, לגדל אותם בן לילה ב- 3 מ ל LB-מרק המכיל אמפיצילין µg/mL 100 ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר ולחלץ את פלסמיד הדנ א באמצעות ערכת טיהור פלסמיד.
  10. בדוק את פלסמיד באמצעות עיכול 500 ננוגרם של הדנ א בעזרת אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 1 37 ° C ולהריץ התגובה על ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). צריך להיות שתי להקות בגדלים נכון של וקטור (~ 7 קילו), את תותב (גודל משתנה על פי הגן עניין). לאחר מכן, לאמת את פלסמיד על ידי רצף.
  11. להפוך את p415 -GAL1-דגלפלסמידים FP - polyQ לתוך המתח שמרים W303 בעקבות פרוטוקול טרנספורמציה2שמרים רגיל.

2. איתור Assay

  1. פס השמרים שיבוטים נשיאה 25Q/72Q המתויגת FP של ריבית על צלחת אגר המכילים שמרים בחירת מדיה (סינתטי להשלים-SC ללא לאוצין) עם גלוקוז כמקור פחמן. במקביל, גם פסים 25Q/72Q-ymsfGFP לשמש פקד חיובי.
    הערה: 25Q/72Q מבנים שאינם מכילים תגית פלורסנט אינם רעילים, יכול לשמש בקרה שלילית.
  2. דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 d.
  3. בחר עד שלוש מושבות יחיד מהצלחת.
  4. לחסן 5 מ ל SC בתוספת 2% גלוקוז כמקור פחמן.
  5. גלולה 200 µL של כל תרבות הלילה ולשטוף אותו x 3 עם סטרילי מים מזוקקים.
  6. Resuspend תאי SC המדיה המכילה 2% גלקטוז כמקור פחמן כדי לעודד את הביטוי של polyQ fusions. דגירה של גלקטוז מדיה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב rotator הרכבת התחתית. כפקד, חזור על שלב זה באמצעות מדיה המכילה גלוקוז.
  7. למחרת בבוקר, להשוות הצפיפויות תא כדי צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.2 ל-100 µL של התקשורת SC צלחת 96-ובכן סטרילי.
  8. להכין ארבעה דילולים למטר של כל מדגם במים סטריליים על-ידי pipetting 20 µL של הדוגמה הקודמת עד 80 µL של התקשורת הבאר הבא.
  9. להשתמש שמרים הצמדת כלי כדי לזהות את התאים על גבי לוחות סלקטיבית (המכילה גלוקוז או גלקטוז) דגירה ב 30 ° C עבור 2 d.
  10. תמונה הצלחות עם מכשיר תיעוד התמונה.

3. כימות של צמיחת תאים בתרבות נוזלי

  1. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.
  2. למדוד את יתר600 באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  3. לדלל לתאים יתר600 של 0.1 ב 300 µL של התקשורת צלחת 96-ובכן.
  4. תריץ את דגימת כל דולר.
  5. דגירה של צלחת צלחת הקורא/חממה עם יכולות חזק. להגדיר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, את ספיגת על 600 ננומטר, האורך של הניסויים ל 24 שעות, את המרווחים מדידה 15 דקות ולאחר בחר באופן רציף חזק.
  6. ליצור את עקומת גדילה ולכמת את השטח מתחת לעקומה באמצעות תוכנה graphing מדעי. 7 פריזמה GraphPad מומלץ. להדביק את הנתונים בתוך טבלת XY עם שלושה ערכים שכפל. עקומת גדילה יוצגו תחת התיקיה תרשימים בצד שמאל. כדי לכמת את השטח מתחת לעקומה, בחר נתח בפינה השמאלית העליונה ולחץ על האזור תחת עקומת ניתוחים XY.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.
  2. לדלל את התאים 10 x בצמיחה התקשורת והעברת µL 200 של כל מדגם ללשכה הדמיה 8-. טוב.
  3. תמונה של תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם מטרה Aprochromoat תוכנית X 63 (1.4 NA) בטמפרטורת החדר.
    הערה: השימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי היא אופציונלית. גם יכול להיות מועסק מיקרוסקופ רגיל של פלורסנט שדה רחב.
  4. להתאים את הכוח חריר ולייזר עבור רכישת תמונה אופטימלית. מאז מצרפי 72Q בהיר יותר האות 25Q ' מאטום לשקוף ', זה לעתים קרובות נדרש להשתמש הגדרה רכישה שונה בין פלסמידים שונים על מנת למנוע הרוויה של האות פלורסנט.
  5. לעבד את התמונות באמצעות ImageJ20 או תוכנות עיבוד תמונה. בשלב זה, רצוי האחוז של תאים כי התצוגה צבירה ניתן לחשב באופן ידני.

5. נקודה חשופה

הערה: ב פרוטוקול זה, נקודה חשופה משמש כדי לבדוק את רמות ביטוי של חלבונים. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.

  1. צור lysates חלבון באמצעות חרוזי זכוכית במאגר פירוק (100 מ מ. טריס, pH 7.5; 200 מ מ NaCl; 1 מ"מ EDTA; 5% גליצרול, 1 מ dithiothreitol [DTT]). מוסיפים מעכבי פרוטאז, 4 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PSMF), מעכבי פרוטאז קוקטייל, ישירות לפני השימוש. גלולה 5 מ של התרבות לילה, resuspend זה µL 200 של חרוזי זכוכית, µL 200 פירוק המאגר. מערבולת 30 s ל-12 סיבובים. צנטריפוגה ב x 12,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע.
  2. במקום כמות שווה של חלבונים הכולל על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות מנגנון אוסמוזה הפוכה. Prewet את הקרום עם PBS ולהרכיב את המנגנון. להתחבר למקור ואקום ולוודא שהברגים הם הידקו. את הריב ולתת את המסנן מדגם דרך הקרום על ידי הכבידה.
  3. לחסום את הקרום בחלב דל-שומן Tween/5% PBS - 0.05%.
  4. דגירה הקרום עם נוגדן נגד דגל הראשי בן לילה ב 4 º C. הדגל אנטי monoclonal ש-m1 מומלץ.
  5. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות כל אחד עם Tween PSB - 0.05%.
  6. דגירה הקרום עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (אנטי עכבר IgG) לשעה בטמפרטורת החדר ב- PBS - 0.05% Tween/5% חלב ללא שומן.
  7. רחץ ממברנה 3 x 10 דקות עם Tween PSB - 0.05%.
  8. תמונות-כתם באמצעות מערכת תיעוד immunoblot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FPs יש biophysical מאפיינים שונים, כולל שלהם נטייה oligomerize, אשר יכולים להשפיע על ההתנהגות של זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה היכן FPs מרובים יכולים נכרכים להרחבות polyQ רעילים. מאז polyQ רעילות תלויה מאוד רצפי איגוף למתוח את polyQ15, וזמינותו זו מאפשרת השוואה מהירה וישירה של כתבים פיוז'ן polyQ פלורסנט (איור 1). אורך-הקשורים HD polyQ (25Q) משמש פקד שלילי, מציג רעילות משמעותיות או צבירת15,16,21,22. 72Q הוא מועסק כדי להשיג את הפנוטיפים HD-כמו, כולל צבירת עיכוב ו polyQ צמיחה חזקה. חשוב, Httex1 קידוד רצף מועסקים חוסר התחום פרולין-עשיר כי בעקבות סיום polyQ. בנוכחות התחום פרולין-עשיר, Httex1 אינו רעיל שמרים15. במהלך זה assay, Httex1 דבוקה הממוטבים שמרים גרסה monomeric של superfolder-GFP-12 (ymsfGFP)-16 משמש פקד חיובי כפי שתואר לעיל16. המבנה יכיל גם תג epitope דגל ב N-הסופית של Httex1. דבר זה מאפשר זיהוי fusions שונים עם הנוגדן אותו (אנטי-דגל) לניתוח הביוכימי. בתור הוכחה-של-עיקרון, 72Q Httex1 דבוקה הממוטבים שמרים TagBFP2 (yomTagBFP2)23 לא תגרום צמיחה איטית נמדדת גם מבחני ספוט על פלטות אגר או צמיחה בתקשורת נוזלי (איור 2), המציין את הטבע תגית פלורסנט לטרפד אכן polyQ התנהגות הרחבה בתאים.

צבירה של fusions פלורסנט polyQ יכול להיות מוערך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. 72Q-ymsfGFP מציג צבירת משמעותי בהשוואה 25Q. עם זאת, האות פלורסנט 72-yomTagBFP נשאר כשמאירים ברחבי הציטופלסמה (איור 3). ברוב המקרים, לא מומלץ להשתמש בהגדרות רכישת תמונות זהות (לייזר כוח, זמן החשיפה) כדי לרכוש תמונות הן 25Q והן 72Q. מצרפי בתאים המבטאים 72Q בהירים הרבה יותר האות כשמאירים 25Q. לכן, בתנאים הדמיה נהגה לרכוש תמונות 72Q, האות כשמאירים 25Q מופיעים חלש מאוד או לא להיות גלוי בכלל. גם צריך להיות מוחל הגדרות רכישה המתאימים כדי למזער את הרוויה במהלך ההדמיה של התאים לבטא 72Q.

רמות הביטוי של fusions polyQ שונים עשוי להשפיע על רעילות. Amyloids דטרגנט-לא מסיס, כגון polyQ אגרגטים, לשמצה שקשה ללמוד מבחינה ביוכימית, אינם מתאימים עבור ניתוח מאת standerd מרחביות-דף. לכן, שהכלים נקודה יכולה להתבצע כדי להעריך את רמות החלבון. ההכללה של התג דגל בסוף טרמינוס אמינו Httex1 מאפשרת זיהוי של כל fusions פלורסנט בו זמנית, למרות נוכחותם של FPs (איור 4). לחלופין, ניתן לבצע agarose דטרגנט למחצה denaturing בג'ל (SDD-גיל) כדי להעריך את היווצרות oligomers polyQ16. פרוטוקול מפורט ווידאו זמינות Halfmann ו- Lindquist24.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה לניתוח של ההשפעה של חלבון פלואורסצנטי תג על צבירה ורעילות של polyQ חלבונים הרחבה בשמרים- ראשית, FPs הם משובטים לתוך שמרים ביטוי וקטורים קידוד גרסה גלקטוז-inducible של Htt מתויג דגלex1 מחסה או 25Q (בלתי רעיל) או 72Q (HD-הקשורים, צבירה, רעיל) חזרה. שיבוטים שנבחרו, מאומת על ידי רצף הינם, לאחר מכן, הפכה שמרים. בעקבות של אינדוקציה polyQ פיוז'ן הביטוי הדגירה מדיה המכילים גלקטוז, מבחני spotting על פלטות אגר או מדיה נוזלי גדילה יכול להעריך רעילות polyQ. PolyQ צבירה זה נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביטוי היחסי של המבנה שונה מוערך באמצעות נקודה חשופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: צמיחה נציג assay תוצאות בעקבות הביטוי של Httex1 fusions פלורסנט ב שמרים. שמרים לבטא Htt של 25Q או 72Q-ex1 דבוקה ymsfGFP או yomTagBFP היה תרבותי בגלוקוז (בקרה) או גלקטוז מדיה (polyQ-induced) למשך הלילה, או (א) הבחין על פלטות אגר או (B) מתפשט עוד בנוזל מדיה כדי להעריך צמיחה בתנאים שונים. בזמן 72Q-ymsfGFP גורם פגם צמיחה משמעותית, 72Q-yomTagBFP מציג את הפנוטיפ צמיחה דומה עמיתיהם בלתי רעיל 25Q. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תמונות פלורסנט נציג של Httex1 fusions פלורסנט ב שמרים. שמרים לבטא Htt של 25Q או 72Q-ex1 דבוקה ymsfGFP או yomTagBFP היה תרבותי בגלוקוז (בקרה) או גלקטוז תקשורת (polyQ-induced) בין לילה, עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי. בעוד הביטוי 72Q-ymsfGFP תוצאות צבירה חלבון polyQ חזק, 72Q-yomTagBFP מציג אות cytoplasmic כשמאירים דומה עמיתיהם בלתי רעיל 25Q. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נקודה נציג כתם ניתוח של פיוז'ן פלורסנט Httex1 ביטוי שמרים. שמרים לביטוי 25Q, 46Q, 72Q או 103Q Httex1 דבוקה CFP תרבותי בתקשורת גלקטוז (polyQ-induced) בן לילה ומעובדים לניתוח חשופה נקודה. מוצגים דילולים למטר של lysates התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, מבחני שונים כדי למדוד את המצבור של Httex1 polyQ הרחבות ואת השפעתם על צמיחת שמרים הועסקו כמודל ללמוד כמה שונה פלורסנט חלבונים לשנות זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט . באמצעות ה-GFP משתנה (ymsfGFP) כפקד חיובית, הראינו כי זה מזהה שינויים משמעותיים polyQ רעילות, צבירת בין תגי שונה פלורסנט, מאפשר השוואה ישירה ומהירה של ההופעה פיוז'ן polyQ-FP נגד מתויג GFP בונה16,19.

בעוד בפרוטוקול הנוכחי מתמקד חלבונים פלורסנט, חלקים שונים של הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות כדי לבחון את ההשפעה של תגי חלבונים אחרים. בנוסף, פרוטוקול נוכח מעסיקה וקטורים centromeric נמוך-העתק שמרים שעשוי להשתנות מבחינת עותק מספרי (בדרך כלל 1-2 עותקים) נוכח תאים25. באמצעות וקטורים אינטגרטיבית כדי להבטיח ביטוי אחיד על פני תנאי הניסוי יכול לעקוף בעיה זו. בעוד פרוטוקול זה הותאם לשימוש ברקע W303, זנים אחרים cerevisiae ס יכול להיות מועסק. עם זאת, הרגישות רעילות polyQ ייקבע באמצעות הווקטורים מתויג ymsfGFP לפני תכנון מבנים חדשים. במקרים מסוימים, ייתכן המתאימים להעסיק וקטורים גבוהה-העתקה (2µ) כדי ליצור פגם צמיחה משמעותית. הוא גם הציע לבחון מבודד מרובים בעקבות השינוי שמרים עם polyQ וקטורים כדי למנוע בחירה מדכאי ספונטנית מראה של רעילות polyQ מופחת. ראוי לציין, W303 שמרים זן26 משמש בדרך כלל הוא רגיש יותר רעילות polyQ מאשר אחרים נגזרים S288C, כגון BY4741/BY474227, ובכך מאפשר עבור מגוון רחב יותר של פנוטיפים צמיחה. חשוב, זנים מועסק assay הזה צריך לשאת את חלבון פריאון Rnq1 מאז rnq1Δ התאים אינם מציגים polyQ רעילות, צבירת28. חשוב גם להשתמש בונהex1 Htt נושא תג דגל אמינו-מסוף והוא חסר התחום פרולין-עשיר. וריאציות אחרות של העיצוב פיוז'ן עשוי לשנות פנוטיפים רעילים15. בסופו של דבר, את תנאי הגיוס של הביטוי פיוז'ן polyQ ב המכילות גלקטוז מדיה היא שלב קריטי של פרוטוקול ה21. בעת העברת תאים ממדיה גלוקוז כדי גלקטוז-המכילים, חשוב לשטוף את התאים לפחות שלוש פעמים עם מים סטריליים כדי לחסל את כל העקבות של גלוקוז יכול לתרום מדחיקה את תנאי הגיוס של יזם Gal129. בעת ביצוע מבחני spotting, culturing התאים לילה בגלקטוז מדיה לזירוז הביטוי של היתוך גרעיני יכול להחריף את ותפקיד רעילים של פיוז'ן 72Q ולעזור להפלות לשינויים צמיחה על פני fusions שונים16.

כמו מגבלה, מחקרים קודמים לא להתבונן אפקטים ההפרש בין גרסה nonmonomeric של CFP (נגזרת GFP) ל- ymsfGFP16. לכן, לפחות עבור גרסאות ה-GFP, assay הזה אולי לא מספיק רגיש להפלות בין גרסאות monomeric, oligomeric, סימון צורך להשלים את polyQ רעילות מבחני עם אחרים בשיטות הרגילות, כגון OSER assay13 ו אנליזה ביוכימית9,10,11,12 זה יכול להעריך ישירות oligomerization. בנוסף, יצוין כי FPs יכולים להתנהג באופן שונה בשמרים לעומת מבחני במבחנה או ביטוי אורגניזמים אחרים23.

באופן קולקטיבי, שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לאפיין FPs חדש ולמדוד את השפעתם על בן הזוג שלהן פיוז'ן במהירות. בעתיד, פרוטוקול זה יאפשר ההקרנה מהירה של נגזרות חדשות של FPs מאופיין בעבר כדי לזהות מוטציות המתנהגים באופן דומה גרסאות ה-GFP, אשר עדיין המדד תקן הזהב לכתבים FP. בעוד פרוטוקול זה מתמקד חלבונים פלורסנט, זה יכול בקלות להיות מותאם למסך על ההשפעות של תגיות מקודדים גנטית אחרים, כגון SNAP-תג30 ו- SunTag31.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק וזמינותו מהיר ומדרגי בקלות כדי לאפשר אפיון נוסף של הדור החדש של FPs ותגים אחרים מקודדים גנטית כדי להנחות מחקר בעיצוב חלבון פיוז'ן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמכת של גרנט ההפעלה של מכוני הקנדי למחקר בריאות M.L.D., פ. ל העבודה המוצגת כאן נתמכת על ידי פרס ג'ון ר אוונס מנהיג קרן קרן הקנדית לחדשנות ו קרן תואמות מקרן מחקר אונטריו כדי Y.J. פ. ל הוא נתמך על ידי תואר את PhD העברה מלגה של דיקן בית הספר לכימיה של מ' edicine, רפואת שיניים-מאוניברסיטת מערב אונטריו. S.D.G. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי מקנדה ALS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 141 חלבונים פלורסנט רעילות polyglutamine מבחני צמיחת שמרים צבירה חלבון פלואורסצנטי ירוק מיקרוסקופ פלואורסצנטי
ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, … More

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter