Summary
Denne artikel beskriver protokoller for at vurdere effekten af fluorescerende proteiner på en sammenlægning og toksicitet af fejlfoldede polyglutamin udvidelse til hurtig evaluering af en nyligt uncharacterized fluorescerende proteiner inden for rammerne af fluorescerende journalister.
Abstract
Ved undersøgelsen af protein lokalisering og menneskehandel ved hjælp af levende celle imaging, afhængige forskere ofte fusing deres protein af interesse for en fluorescerende reporter. Konstant udvikling listen over genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) præsenterer brugere med flere alternativer, når det kommer til fluorescerende fusion design. Hver FP har specifikke optisk og Biofysisk egenskaber, der kan påvirke de biokemiske, cellulære og funktionelle egenskaber af de resulterende fluorescerende fusioner. For eksempel, flere FPs har tendens til at danne uspecifik oligomerer, der er modtagelige for hindre på funktionen af fusion partneren. Desværre, kun et par metoder eksisterer for at teste effekten af FPs på opførsel af fluorescerende reporter. Her, beskriver vi en simpel metode, der muliggør hurtig vurdering af virkningen af FPs bruger polyglutamin (polyQ) toksicitet assays i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-udvidet huntingtin protein er forbundet med symptomdebut af Huntington's chorea (HD), hvor den udvidede huntingtin aggregater i giftige oligomerer og inklusion organer. Sammenlægning og toksicitet af polyQ udvidelser i gær er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ regionen, herunder tilstedeværelsen af fluorescerende tags, hvilket giver en ideel eksperimentelle platform for at studere effekten af FPs på opførsel af deres fusion partner.
Introduction
Da den oprindelige karakterisering af den grønne fluorescerende proteiner (NGL) fra Aequorea victoria1, en bred palet af genetisk kodet FPs er blevet udviklet, så cellen biologer samtidig lokalisere og spore flere cellulære begivenheder/proteiner i levende celler,2,3. FPs er afledt fra flere organismer fra vandmand koral, og derfor, display specifikke biofysiske egenskaber, at aflede udstrakt grad ud over deres respektive fluorescerende spectrum. Disse egenskaber omfatter lysstyrke, fotostabilitet og en tendens til at oligomerize blandt andre2,4. Valg af monomere FPs er et vigtigt aspekt i forbindelse med udvælgelsen af en passende tag, når du udformer en fluorescerende reporter, for at minimere upassende interaktioner og ændringer af fusion Partners funktion og maksimere reporter effektiviteten for en givet cellulære rum4,5,6. Mens normal god landbrugspraksis, over tid, blevet ændret for at minimere effekten af tilføjer den fluorescerende tag til fusion partner5,7,8, hvor nye FP varianter udføre i forhold til normal god landbrugspraksis er stadig vanskeligt at vurdere.
Få metoder eksisterer for at karakterisere opførsel af FPs. De fleste af dem involverer test biofysiske egenskaber af FPs ved hjælp af biokemiske metoder, såsom ultracentrifugering og gel filtrering protokoller9,10,11,12. Disse metoder har hage ved renset FPs i opløsning, tilbyder lidt indsigt i deres adfærd i intakt celler. Udviklingen af den organiserede glatte endoplasmatiske reticulum (OSER) assay tilbyder en kvantificerbar vurdering af FPs' tendens til at oligomerize i levende celler13 ved at teste overexpressed FPs evne til at reorganisere endoplasmatiske reticulum tubuli ind OSER hvirvler14. Denne teknik kan med held registrere ændringer mellem monomere og oligomere varianter af normal god landbrugspraksis og andre FPs. Men det er for det meste afhængig overekspression i forbigående transfekteret celler, og kvantitering og billedanalyse kan være tidskrævende, medmindre teknikken, der er vedtaget som en automatiseret dataindsamling og analyse arbejdsproces.
For at supplere disse tilgange, etableret vi en analyse, der tager fordel af effekten af fluorescerende tags på toksicitet og sammenlægning af polyQ udvidelser i gær15,16. Udbygningen af strækningen polyQ med mere end 36 gentages inden for den første exon gen kodning huntingtinprotein (Htt) er forbundet med Huntington's chorea17,18. Udtryk for udvidede Httex1 i gær resultater i en stærk sammenlægning af fejlfoldede Htt protein koblet til en svær vækst defekt. Interessant, er disse fænotyper stærkt påvirket af de sekvenser, der flankerer polyQ stretch, herunder FPs15,16. Det blev rationaliseret, at de forskellige egenskaber af FPs varierende kan påvirke polyQ toksicitet i gær. Faktisk, i forhold til normal god landbrugspraksis-lignende FPs, rødt fluorescerende proteiner og deres udviklede former har vist en reduceret toksicitet og sammenlægning16. Håndskriftet indeholder en detaljeret protokol for at vurdere effekten af den næste generation af FPs på polyQ toksicitet og sammenlægning i gær. Denne analyse giver mulighed for en hurtig og potentielt high-indhold analyse af FP varianter, der kan bruges sideløbende med tidligere karakteriseret teknikker til optimal karakterisering af nye FPs og kan vurdere, hvordan de udfører i forhold til normal god landbrugspraksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af nye Fluorescently markeret Httex1 journalister for et udtryk i gær
Bemærk: Dette afsnit er blevet ændret fra protokollen af Jiang et al. 16 og torfinn et al. 19.
- Design primere til at forstærke sekvensen kodning fluorescerende proteiner eller interesse ved PCR. Den forreste primer bør omfatte en leader sekvens for at bistå begrænsning enzym under fordøjelsen (GATC'EN), efterfulgt af en SpeI begrænsning websted (ACTAGT) og 20 baser nedstrøms af ATG (undtagen ATG) af fluorescerende proteiner-gen af interesse. Den omvendte primer bør omfatte leder sekvens (GATC'EN), efterfulgt af en SalI begrænsning websted (GTCGAC) og den omvendte supplement af 20 baser opstrøms af stop-codon af FP sekvensen (herunder stop).
- Ved hjælp af primere designet i trin 1.1, udføre PCR reaktion ved hjælp af en thermocycler med følgende indstillinger: opvarmes til 95 ° C i 1 min og cyklus ved 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s, og mindst 72 ° C i 2 min. pr. kB af PCR produkt. Udfører 18 cykler er rigelig.
- Køre PCR reaktion på en agarosegel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Der skal en enkelt band svarende til den forventede produktstørrelse. Isolere fragment ved hjælp af en gel rensning kit.
- Protokollen beskæftiger en Httex1 vektor bærer 25 (nontoxic) og 72 (HD-forbindelse, viser en stærk sammenlægning) polyQ gentager. Fordøje både PCR fragmenter og vektor med SpeI og SalI restriktionsenzymer i 3 timer ved 37 ° C.
- Rense den fordøjede vektor ved at køre det på en agarosegel som i trin 1.3.
- Rense fordøjet PCR fragmentet ved hjælp af en PCR rensning kit.
- Ligate den resulterende fordøjet PCR fragment og p415 -GAL1-FLAG-25/72QpolyQ plasmider1 ved hjælp af T4 ligase (1 time ved stuetemperatur). Bruge en 10 µL reaktion (1 µL af T4 enzym, 1 µL af 10 X buffer, 6 µL PCR fragment og 2 µL af vektor).
- Omdanne 2 µL af ligatur reaktion i 50 µL af Escherichia coli-kompetente celler, og der inkuberes i isbad i 30 min. Derefter, heat-shock celler på 42 ° C i 30 s. Tilføj 1 mL af SOC udvækst medier og inkuberes ved 37 ° C i 1 time i en shaker. Plade 200 µL af reaktion på en LB-agar plade med 100 µg/mL ampicillin. Inkuber plade ved 37 ° C natten over.
- Vælg tre individuelle bakteriel kolonier, dyrke dem natten over i 3 mL LB-bouillon indeholdende 100 µg/mL ampicillin ved 37 ° C i en shaker og udtrække plasmid DNA ved hjælp af en plasmid rensning kit.
- Kontrollere plasmidet ved fordøje 500 ng af DNA ved hjælp af SpeI og SalI restriktionsenzymer i 1 timer ved 37 ° C og Kør reaktionen på en agarosegel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Der bør være to bands på de rigtige størrelser af vektor (~ 7 kb) og Indsæt (størrelse varierer alt efter gen af interesse). Kontroller derefter, at plasmid af sekventering.
- Omdanne p415 -GAL1-FLAG- polyQ-FP plasmider til gærstamme W303 efter en standard gær transformation protokol2.
2. spotting Assay
- Streak gæren kloner regnskabsmæssige 25Q/72Q markeret med FP af interesse på en agar plade der indeholder gær udvalg medier (syntetisk komplet-SC uden leucin) med glukose som CO2-kilde. På samme tid, også streak 25Q/72Q-ymsfGFP til at tjene som positiv kontrol.
Bemærk: 25Q/72Q-konstruktioner, der ikke indeholder en fluorescerende tag er ikke giftige og kan tjene som negativ kontrol. - Inkuber plader ved 30 ° C i 2-3 d.
- Vælg op til tre enkelt kolonier fra pladen.
- Podes 5 mL SC suppleret med 2% glukose som CO2-kilde.
- Pellet 200 µL af hver overnight kultur og vaske det 3 x med sterilt destilleret vand.
- Resuspend celler i SC medier indeholdende 2% galactose som carbon kilde til at fremkalde udtryk for polyQ fusioner. Inkuber galactose media natten over ved 30 ° C i en tube rotator. Som et kontrolelement, skal du gentage dette trin ved hjælp af glukose-holdige medier.
- Den næste morgen, udligne celle tætheder til optisk tæthed på 600 nm (OD600) af 0,2 i 100 µL af SC medier i et sterilt 96-brønd plade.
- Forberede fire femdoblet fortyndinger af hver prøve med sterilt vand af pipettering 20 µL af prøven fra den tidligere godt ind i 80 µL af medier i de næste godt.
- Bruge en gær pinning værktøj til at spotte cellerne på selektiv plader (indeholdende glucose eller galactose) og inkuberes ved 30 ° C i 2 d.
- Billede af plader med en billede dokumentation enhed.
3. kvantificering af cellevækst i flydende kultur
- Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol.
- Måle OD600 bruger et spektrofotometer.
- Fortynd celler til en OD600 af 0,1 i 300 µL af medier i en 96-brønd plade.
- Kør hver prøve i tre eksemplarer.
- Inkuber plade i en plade læser/kuvøse med rystende kapaciteter. Angive antallet af prøver, temperatur på 30 ° C, absorbansen på 600 nm, længden af eksperimenter til 24 h og måling intervaller til 15 min, og vælg den kontinuerlige ryster tilstand.
- Oprette vækstkurven og kvantificere arealet under kurven ved hjælp af videnskabelige graftegning software. GraphPad prisme 7 anbefales. Indsætte dataene til et XY tabel med tre Repliker værdier. Vækstkurven bliver vist under mappen grafer på venstre side. At kvantificere arealet under kurven, Vælg analyser øverst til venstre og klik på arealet under kurven i XY-analyser.
4. fluorescerende mikroskopi
- Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol.
- Fortynd celler 10 x i vækst medier og overføre 200 µL af hver prøve til 8-godt billeddiagnostiske afdelinger.
- Image celler ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 63 X planlægger Aprochromoat mål (1,4 NA) ved stuetemperatur.
Bemærk: Brugen af en Konfokal mikroskop er valgfri. En standard wide-felt fluorescerende mikroskop kan også være ansat. - Justere pinhole og laser power for optimal billede erhvervelse. Da 72Q aggregater er meget lysere end diffuse 25Q signalet, er det ofte nødvendigt at bruge en anden erhvervelse indstilling mellem de forskellige plasmider med henblik på at undgå mætning af fluorescerende signal.
- Behandle billeder ved hjælp af ImageJ20 eller en anden billedbehandling software. På dette trin ønskes procentdelen af cellerne at display aggregat kan beregnes manuelt.
5. dot skamplet
Bemærk: I denne protokol, dot skamplet bruges til at undersøge protein udtryk niveauer. Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol.
- Generere protein lysates ved hjælp af glasperler i lysisbuffer (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Tilføje proteasehæmmere, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PSMF) og protease hæmmer cocktail, umiddelbart før brug. Pellet 5 mL af overnight kultur og resuspend det i 200 µL af glasperler og 200 µL af lysisbuffer. Vortex 30 s for 12 runder. Der centrifugeres ved 12.000 x g ved 4 ° C i 10 min og indsamle supernatanten.
- Spot et lige antal samlede proteiner på en nitrocellulose membran med en mikrofiltrering apparatur. Prewet membran med PBS og samle apparatet. Oprette forbindelse til et vakuum kilde og sørg for, at skruerne strammes. Tænd vakuum og lad prøven filtreres gennem membranen ved hjælp af tyngdekraften.
- Blokere membran i PBS - 0,05% Tween/5% fedtfri mælk.
- Inkuber membran med primære anti-FLAG antistof natten over ved 4 ° C. Det monoklonale anti-FLAG M1 anbefales.
- Vaske membran 3 x til 10 min med PSB - 0,05% Tween.
- Inkuber membran med en fluorescently mærket sekundær antistof (anti-mus IgG) i 1 time ved stuetemperatur i PBS - 0,05% Tween/5% fedtfri mælk.
- Vask membran 3 x 10 min. med PSB - 0,05% Tween.
- Billede-blot ved hjælp af en immunblot dokumentationssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FPs har forskellige biofysiske egenskaber, herunder deres tendens til at oligomerize, der kan påvirke funktionsmåden for deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister. Denne protokol beskriver en simpel metode, hvor flere FPs kan være smeltet til giftige polyQ udvidelser. Da polyQ toksicitet er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ stretch15, denne analyse giver mulighed for en hurtig og direkte sammenligning af fluorescerende polyQ fusion journalister (figur 1). En ikke-HD-associerede polyQ længde (25Q) bruges som en negativ kontrol og viser ikke betydelig toksicitet eller sammenlægning15,16,21,22. 72Q er ansat til at opnå HD-lignende fænotyper, herunder stærk vækst hæmning og polyQ sammenlægning. Vigtigere, Httex1 kodende sekvens ansat manglende domænet prolin-rige, der følger strækningen polyQ. I nærværelse af domænet prolin-rige er Httex1 ikke giftigt i gær15. I denne analyse bruges en Httex1 smeltet til en gær-optimeret monomere variant af superfolder normal god landbrugspraksis12 (ymsfGFP)16 som positiv kontrol som tidligere beskrevet16. Konstruktioner indeholder også et FLAG epitop tag på N-terminus af Httex1. Dette giver mulighed for påvisning af de forskellige fusioner med den samme antistoffer (anti-FLAG) til biokemiske analyser. Som en proof-of-principle, 72Q Httex1 smeltet til gær-optimeret TagBFP2 (yomTagBFP2)23 ikke medfører langsom vækst målt ved enten spot assays på agar plader eller vækst i flydende medier (figur 2), der angiver, at arten af fluorescerende tag kan faktisk hæmme polyQ ekspansion adfærd i celler.
Sammenlægning af fluorescerende polyQ fusioner kan vurderes ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. 72Q-ymsfGFP viser betydelige sammenlægning i forhold til 25Q. 72-yomTagBFP fluorescerende signal er imidlertid spredt over hele cytoplasma (figur 3). I de fleste tilfælde, er det ikke anbefales at bruge de samme billede erhvervelse indstillinger (laser power, eksponeringstid) at erhverve både 25Q og 72Q billeder. Aggregater i de 72Q-udtrykker celler er meget lysere end diffust 25Q signal. Derfor, under imaging betingelser bruges til at erhverve 72Q billeder, diffust 25Q signalet kan vises meget svage eller ikke være synlig på alle. Passende erhvervelse indstillinger bør også anvendes for at minimere mætning under billeddannelse af de 72Q udtryk for celler.
Udtrykket niveauer af de forskellige polyQ fusioner kan påvirke toksicitet. Detergent-uopløselige amyloids, såsom polyQ aggregater, er notorisk vanskeligt at studere biokemisk og er ikke egnede til en analyse af standerd SDS-PAGE. Derfor, dot blots kan udføres for at vurdere protein niveauer. Optagelse af FLAG tag enden amino terminus af Httex1 tillader detektering af alle fluorescerende fusions samtidigt, trods tilstedeværelsen af FPs (figur 4). Alternativt, semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese (SDD-alder) kan udføres for at vurdere dannelsen af polyQ oligomerer16. En detaljeret protokol og video er tilgængelig i Halfmann og Lindquist24.
Figur 1: arbejdsprocesdiagram til analyse af effekten af fluorescerende proteiner tag på sammenlægning og toksicitet af polyQ ekspansion proteiner i gær. Først, FPs er klonet i gær udtryk vektorer kodning et galactose-inducerbar version af FLAG-tagged Httex1 husly enten 25Q (nontoxic) eller 72Q (HD-associerede, samle og giftige) gentagelser. Kloner er valgt og bekræftet af sekventering og efterfølgende omdannes i gær. Efter inkubation i galaktose-indeholdende medier, enten spotting assays på agar plader eller vækst flydende medier induktion af polyQ fusion udtryk kan vurdere polyQ toksicitet. PolyQ sammenlægning er analyseret af fluorescerende mikroskopi. En relativ udtryk for de forskellige konstruktioner er vurderet ved hjælp af dot skamplet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative vækst assay resultater efter udtryk for Httex1 fluorescerende fusioner i gær. Gær udtryk for enten 25Q eller 72Q Httex1 sammenvokset til ymsfGFP eller yomTagBFP blev kulturperler i glucose (kontrol) eller galactose medier (polyQ-induceret) natten over og enten (A) spottet på agar plader eller (B) rugede videre i væske Media at vurdere vækst under forskellige forhold. Mens 72Q-ymsfGFP inducerer en betydelig vækst defekt, viser 72Q-yomTagBFP en vækst fænotype svarende til nontoxic 25Q modstykker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentant fluorescerende billeder af Httex1 fluorescerende fusioner i gær. Gær udtryk for enten 25Q eller 72Q Httex1 sammenvokset til ymsfGFP eller yomTagBFP blev kulturperler i glucose (kontrol) eller galactose medier (polyQ-induceret) natten over og afbildet med en Konfokal mikroskop. Mens udtrykket 72Q-ymsfGFP resulterer i en stærk polyQ protein sammenlægning, viser 72Q-yomTagBFP et diffust cytoplasmatisk signal svarer til nontoxic 25Q modstykker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative dot skamplet analyse af Httex1 fluorescerende fusion udtryk i gær. Gær udtrykker 25Q, 46Q, 72Q eller 103Q Httex1 smeltet til fælles fiskeripolitik var kulturperler i galactose medier (polyQ-induceret) natten over og forarbejdet til dot skamplet analyse. Femdoblet fortyndinger af cellelysater er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel, forskellige assays til at måle en sammenlægning af Httex1 polyQ udvidelser og deres virkning på gær vækst var ansat som en model til at studere hvordan forskellige fluorescerende proteiner ændrer deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister . Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis variant (ymsfGFP) som en positiv kontrol, viste vi at det registrerer betydelige ændringer i polyQ toksicitet og sammenlægning mellem forskellige fluorescerende tags og giver mulighed for en direkte og hurtig sammenligning af polyQ-FP fusion ydeevne mod Normal god landbrugspraksis-tagged konstruktioner16,19.
Mens denne protokol fokuserer på fluorescerende proteiner, kunne forskellige dele af protokollen tilpasses let at teste effekten af andre protein tags. Derudover beskæftiger denne protokol lav-kopi gær centromeric vektorer, der kan variere i form af kopi numre (generelt et til to kopier) i celler25. Ved hjælp af Integrativ vektorer til at sikre et ensartet udtryk på tværs af eksperimentelle betingelser kunne omgå dette problem. Mens denne protokol er blevet optimeret til brug i W303 baggrunden, kan andre S. cerevisiae stammer være ansat. Modtagelighed for polyQ toksicitet bør imidlertid bestemmes ved hjælp af de ymsfGFP-tagged vektorer før designe nye konstruktioner. I visse tilfælde kan det være hensigtsmæssigt at ansætte high-kopi (2µ) vektorer til at generere en betydelig vækst defekt. Det foreslås også for at teste flere isolater efter gær transformation med polyQ vektorer til at undgå at vælge spontan overspændingsbeskyttere viser en reduceret polyQ toksicitet. Bemærk, at W303 gær stamme26 er normalt bruges som det er mere følsomme over for polyQ toksicitet end andre S288C derivater, som BY4741/BY474227, således giver mulighed for en bredere vifte af vækst fænotyper. Vigtigere, skal stammer, der er ansat til denne analyse bære prionprotein Rnq1 da rnq1Δ celler ikke vise polyQ toksicitet og sammenlægning28. Det er også vigtigt at bruge Httex1 konstruktioner bærer amino-terminal FLAG tag og mangler prolin-rige domæne. Andre varianter af fusion design kan ændre giftige fænotyper15. Endelig, induktion af polyQ fusion udtryk i galaktose-indeholdende media er et kritisk skridt protokol21. Når du overfører celler fra glucose til galaktose-indeholdende medier, er det vigtigt at cellerne vaskes mindst tre gange med sterilt vand for at fjerne alle spor af glucose, der kunne bidrage til at undertrykke induktion af Gal1 promotor29. Når du udfører spotting assays, kan dyrkning af celler overnatning i galactose medier til at fremkalde udtryk for fusion forværre den giftige fænotype 72Q fusion og hjælpe diskriminere ændringer i væksten på tværs af forskellige fusions16.
Som en begrænsning, tidligere undersøgelser ikke har overholdt differential virkninger mellem en nonmonomeric version af den fælles fiskeripolitik (en normal god landbrugspraksis derivat) og ymsfGFP16. Således i det mindste for normal god landbrugspraksis varianter, denne analyse kan ikke være følsomme nok til at skelne mellem monomere og oligomere varianter, fremhæve behovet for at supplere polyQ toksicitet undersøgelser med andre standard metoder, såsom OSER assay13 og biokemiske analyser9,10,11,12 , direkte kan vurdere oligomerisering. Også, skal det bemærkes, at FPs kan opfører sig anderledes i gær i forhold til in vitro- assays eller deres udtryk i andre organismer23.
Kollektivt, giver disse metoder forskere hurtigt at karakterisere nye FPs og måle deres effekt på deres fusion partner. Denne protokol vil fremover, aktiverer hurtig screening af nye derivater af tidligere karakteriseret FPs til at identificere mutanter, der opfører sig på samme måde til normal god landbrugspraksis varianter, som stadig er den gyldne standard foranstaltning for FP journalister. Mens denne protokol fokuserer på fluorescerende proteiner, kan det nemt tilpasses til skærmen for virkningerne af andre genetisk kodet tags, som SNAP-tag30 og SunTag31.
Til sidst, giver denne protokol en hurtig og let skalerbare assay for at aktivere yderligere karakterisering af den nye generation af FPs og andre genetisk kodet tags til at guide forskning i fusion protein design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse understøttes af driftstilskud fra den canadiske institutter for sundhedsforskning til M.L.D. og P.L. Det arbejde, der præsenteres her er understøttet af en John R. Evans leder fond award fra den canadiske Institut for Innovation og en matchende fond fra Ontario forskningsfonden til P.L. Y.J. understøttes af en MSc til ph.d.-overførsel stipendium fra dekanen for den baggrund skole M seneste udgave og tandpleje på The University of Western Ontario. S.D.G. understøttes af et ph.d.-stipendium fra ALS Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
