Effekten af fluorescerende proteiner på Fusion partnere ved hjælp af polyglutamin toksicitet Assays i gær
Summary
Denne artikel beskriver protokoller for at vurdere effekten af fluorescerende proteiner på en sammenlægning og toksicitet af fejlfoldede polyglutamin udvidelse til hurtig evaluering af en nyligt uncharacterized fluorescerende proteiner inden for rammerne af fluorescerende journalister.
Abstract
Ved undersøgelsen af protein lokalisering og menneskehandel ved hjælp af levende celle imaging, afhængige forskere ofte fusing deres protein af interesse for en fluorescerende reporter. Konstant udvikling listen over genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) præsenterer brugere med flere alternativer, når det kommer til fluorescerende fusion design. Hver FP har specifikke optisk og Biofysisk egenskaber, der kan påvirke de biokemiske, cellulære og funktionelle egenskaber af de resulterende fluorescerende fusioner. For eksempel, flere FPs har tendens til at danne uspecifik oligomerer, der er modtagelige for hindre på funktionen af fusion partneren. Desværre, kun et par metoder eksisterer for at teste effekten af FPs på opførsel af fluorescerende reporter. Her, beskriver vi en simpel metode, der muliggør hurtig vurdering af virkningen af FPs bruger polyglutamin (polyQ) toksicitet assays i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-udvidet huntingtin protein er forbundet med symptomdebut af Huntington’s chorea (HD), hvor den udvidede huntingtin aggregater i giftige oligomerer og inklusion organer. Sammenlægning og toksicitet af polyQ udvidelser i gær er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ regionen, herunder tilstedeværelsen af fluorescerende tags, hvilket giver en ideel eksperimentelle platform for at studere effekten af FPs på opførsel af deres fusion partner.
Introduction
Da den oprindelige karakterisering af den grønne fluorescerende proteiner (NGL) fra Aequorea victoria1, en bred palet af genetisk kodet FPs er blevet udviklet, så cellen biologer samtidig lokalisere og spore flere cellulære begivenheder/proteiner i levende celler,2,3. FPs er afledt fra flere organismer fra vandmand koral, og derfor, display specifikke biofysiske egenskaber, at aflede udstrakt grad ud over deres respektive fluorescerende spectrum. Disse egenskaber omfatter lysstyrke, fotostabilitet og en tendens til at oligomerize blandt andre2,4. Valg af monomere FPs er et vigtigt aspekt i forbindelse med udvælgelsen af en passende tag, når du udformer en fluorescerende reporter, for at minimere upassende interaktioner og ændringer af fusion Partners funktion og maksimere reporter effektiviteten for en givet cellulære rum4,5,6. Mens normal god landbrugspraksis, over tid, blevet ændret for at minimere effekten af tilføjer den fluorescerende tag til fusion partner5,7,8, hvor nye FP varianter udføre i forhold til normal god landbrugspraksis er stadig vanskeligt at vurdere.
Få metoder eksisterer for at karakterisere opførsel af FPs. De fleste af dem involverer test biofysiske egenskaber af FPs ved hjælp af biokemiske metoder, såsom ultracentrifugering og gel filtrering protokoller9,10,11,12. Disse metoder har hage ved renset FPs i opløsning, tilbyder lidt indsigt i deres adfærd i intakt celler. Udviklingen af den organiserede glatte endoplasmatiske reticulum (OSER) assay tilbyder en kvantificerbar vurdering af FPs’ tendens til at oligomerize i levende celler13 ved at teste overexpressed FPs evne til at reorganisere endoplasmatiske reticulum tubuli ind OSER hvirvler14. Denne teknik kan med held registrere ændringer mellem monomere og oligomere varianter af normal god landbrugspraksis og andre FPs. Men det er for det meste afhængig overekspression i forbigående transfekteret celler, og kvantitering og billedanalyse kan være tidskrævende, medmindre teknikken, der er vedtaget som en automatiseret dataindsamling og analyse arbejdsproces.
For at supplere disse tilgange, etableret vi en analyse, der tager fordel af effekten af fluorescerende tags på toksicitet og sammenlægning af polyQ udvidelser i gær15,16. Udbygningen af strækningen polyQ med mere end 36 gentages inden for den første exon gen kodning huntingtinprotein (Htt) er forbundet med Huntington’s chorea17,18. Udtryk for udvidede Httex1 i gær resultater i en stærk sammenlægning af fejlfoldede Htt protein koblet til en svær vækst defekt. Interessant, er disse fænotyper stærkt påvirket af de sekvenser, der flankerer polyQ stretch, herunder FPs15,16. Det blev rationaliseret, at de forskellige egenskaber af FPs varierende kan påvirke polyQ toksicitet i gær. Faktisk, i forhold til normal god landbrugspraksis-lignende FPs, rødt fluorescerende proteiner og deres udviklede former har vist en reduceret toksicitet og sammenlægning16. Håndskriftet indeholder en detaljeret protokol for at vurdere effekten af den næste generation af FPs på polyQ toksicitet og sammenlægning i gær. Denne analyse giver mulighed for en hurtig og potentielt high-indhold analyse af FP varianter, der kan bruges sideløbende med tidligere karakteriseret teknikker til optimal karakterisering af nye FPs og kan vurdere, hvordan de udfører i forhold til normal god landbrugspraksis.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel, forskellige assays til at måle en sammenlægning af Httex1 polyQ udvidelser og deres virkning på gær vækst var ansat som en model til at studere hvordan forskellige fluorescerende proteiner ændrer deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister . Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis variant (ymsfGFP) som en positiv kontrol, viste vi at det registrerer betydelige ændringer i polyQ toksicitet og sammenlægning mellem forskellige fluorescerende tags og giver muli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse understøttes af driftstilskud fra den canadiske institutter for sundhedsforskning til M.L.D. og P.L. Det arbejde, der præsenteres her er understøttet af en John R. Evans leder fond award fra den canadiske Institut for Innovation og en matchende fond fra Ontario forskningsfonden til P.L. Y.J. understøttes af en MSc til ph.d.-overførsel stipendium fra dekanen for den baggrund skole M seneste udgave og tandpleje på The University of Western Ontario. S.D.G. understøttes af et ph.d.-stipendium fra ALS Canada.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
