A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Denne artikel beskriver protokoller for at vurdere effekten af fluorescerende proteiner på en sammenlægning og toksicitet af fejlfoldede polyglutamin udvidelse til hurtig evaluering af en nyligt uncharacterized fluorescerende proteiner inden for rammerne af fluorescerende journalister.

Abstract

Ved undersøgelsen af protein lokalisering og menneskehandel ved hjælp af levende celle imaging, afhængige forskere ofte fusing deres protein af interesse for en fluorescerende reporter. Konstant udvikling listen over genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) præsenterer brugere med flere alternativer, når det kommer til fluorescerende fusion design. Hver FP har specifikke optisk og Biofysisk egenskaber, der kan påvirke de biokemiske, cellulære og funktionelle egenskaber af de resulterende fluorescerende fusioner. For eksempel, flere FPs har tendens til at danne uspecifik oligomerer, der er modtagelige for hindre på funktionen af fusion partneren. Desværre, kun et par metoder eksisterer for at teste effekten af FPs på opførsel af fluorescerende reporter. Her, beskriver vi en simpel metode, der muliggør hurtig vurdering af virkningen af FPs bruger polyglutamin (polyQ) toksicitet assays i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-udvidet huntingtin protein er forbundet med symptomdebut af Huntington’s chorea (HD), hvor den udvidede huntingtin aggregater i giftige oligomerer og inklusion organer. Sammenlægning og toksicitet af polyQ udvidelser i gær er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ regionen, herunder tilstedeværelsen af fluorescerende tags, hvilket giver en ideel eksperimentelle platform for at studere effekten af FPs på opførsel af deres fusion partner.

Introduction

Da den oprindelige karakterisering af den grønne fluorescerende proteiner (NGL) fra Aequorea victoria¹, en bred palet af genetisk kodet FPs er blevet udviklet, så cellen biologer samtidig lokalisere og spore flere cellulære begivenheder/proteiner i levende celler,^2,3. FPs er afledt fra flere organismer fra vandmand koral, og derfor, display specifikke biofysiske egenskaber, at aflede udstrakt grad ud over deres respektive fluorescerende spectrum. Disse egenskaber omfatter lysstyrke, fotostabilitet og en tendens til at oligomerize blandt andre^2,4. Valg af monomere FPs er et vigtigt aspekt i forbindelse med udvælgelsen af en passende tag, når du udformer en fluorescerende reporter, for at minimere upassende interaktioner og ændringer af fusion Partners funktion og maksimere reporter effektiviteten for en givet cellulære rum^4,5,6. Mens normal god landbrugspraksis, over tid, blevet ændret for at minimere effekten af tilføjer den fluorescerende tag til fusion partner^5,7,8, hvor nye FP varianter udføre i forhold til normal god landbrugspraksis er stadig vanskeligt at vurdere.

Få metoder eksisterer for at karakterisere opførsel af FPs. De fleste af dem involverer test biofysiske egenskaber af FPs ved hjælp af biokemiske metoder, såsom ultracentrifugering og gel filtrering protokoller^9,10,11,12. Disse metoder har hage ved renset FPs i opløsning, tilbyder lidt indsigt i deres adfærd i intakt celler. Udviklingen af den organiserede glatte endoplasmatiske reticulum (OSER) assay tilbyder en kvantificerbar vurdering af FPs’ tendens til at oligomerize i levende celler¹³ ved at teste overexpressed FPs evne til at reorganisere endoplasmatiske reticulum tubuli ind OSER hvirvler¹⁴. Denne teknik kan med held registrere ændringer mellem monomere og oligomere varianter af normal god landbrugspraksis og andre FPs. Men det er for det meste afhængig overekspression i forbigående transfekteret celler, og kvantitering og billedanalyse kan være tidskrævende, medmindre teknikken, der er vedtaget som en automatiseret dataindsamling og analyse arbejdsproces.

For at supplere disse tilgange, etableret vi en analyse, der tager fordel af effekten af fluorescerende tags på toksicitet og sammenlægning af polyQ udvidelser i gær^15,16. Udbygningen af strækningen polyQ med mere end 36 gentages inden for den første exon gen kodning huntingtinprotein (Htt) er forbundet med Huntington’s chorea^17,18. Udtryk for udvidede Htt^ex1 i gær resultater i en stærk sammenlægning af fejlfoldede Htt protein koblet til en svær vækst defekt. Interessant, er disse fænotyper stærkt påvirket af de sekvenser, der flankerer polyQ stretch, herunder FPs^15,16. Det blev rationaliseret, at de forskellige egenskaber af FPs varierende kan påvirke polyQ toksicitet i gær. Faktisk, i forhold til normal god landbrugspraksis-lignende FPs, rødt fluorescerende proteiner og deres udviklede former har vist en reduceret toksicitet og sammenlægning¹⁶. Håndskriftet indeholder en detaljeret protokol for at vurdere effekten af den næste generation af FPs på polyQ toksicitet og sammenlægning i gær. Denne analyse giver mulighed for en hurtig og potentielt high-indhold analyse af FP varianter, der kan bruges sideløbende med tidligere karakteriseret teknikker til optimal karakterisering af nye FPs og kan vurdere, hvordan de udfører i forhold til normal god landbrugspraksis.

Protocol

1. generation af nye Fluorescently markeret Httex1 journalister for et udtryk i gær Bemærk: Dette afsnit er blevet ændret fra protokollen af Jiang et al. 16 og torfinn et al. 19. Design primere til at forstærke sekvensen kodning fluorescerende proteiner eller interesse ved PCR. Den forreste primer bør omfatte en leader sekvens for at bistå begrænsning enzym under fordøjelsen (GATC’EN), efterfulgt af en SpeI begrænsning websted (ACTAGT) og 20 baser nedstrøms af ATG (undtagen ATG) af fluorescerende proteiner-gen af interesse. Den omvendte primer bør omfatte leder sekvens (GATC’EN), efterfulgt af en SalI begrænsning websted (GTCGAC) og den omvendte supplement af 20 baser opstrøms af stop-codon af FP sekvensen (herunder stop). Ved hjælp af primere designet i trin 1.1, udføre PCR reaktion ved hjælp af en thermocycler med følgende indstillinger: opvarmes til 95 ° C i 1 min og cyklus ved 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s, og mindst 72 ° C i 2 min. pr. kB af PCR produkt. Udfører 18 cykler er rigelig. Køre PCR reaktion på en agarosegel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Der skal en enkelt band svarende til den forventede produktstørrelse. Isolere fragment ved hjælp af en gel rensning kit. Protokollen beskæftiger en Httex1 vektor bærer 25 (nontoxic) og 72 (HD-forbindelse, viser en stærk sammenlægning) polyQ gentager. Fordøje både PCR fragmenter og vektor med SpeI og SalI restriktionsenzymer i 3 timer ved 37 ° C. Rense den fordøjede vektor ved at køre det på en agarosegel som i trin 1.3. Rense fordøjet PCR fragmentet ved hjælp af en PCR rensning kit. Ligate den resulterende fordøjet PCR fragment og p415 -GAL1-FLAG-25/72QpolyQ plasmider1 ved hjælp af T4 ligase (1 time ved stuetemperatur). Bruge en 10 µL reaktion (1 µL af T4 enzym, 1 µL af 10 X buffer, 6 µL PCR fragment og 2 µL af vektor). Omdanne 2 µL af ligatur reaktion i 50 µL af Escherichia coli-kompetente celler, og der inkuberes i isbad i 30 min. Derefter, heat-shock celler på 42 ° C i 30 s. Tilføj 1 mL af SOC udvækst medier og inkuberes ved 37 ° C i 1 time i en shaker. Plade 200 µL af reaktion på en LB-agar plade med 100 µg/mL ampicillin. Inkuber plade ved 37 ° C natten over. Vælg tre individuelle bakteriel kolonier, dyrke dem natten over i 3 mL LB-bouillon indeholdende 100 µg/mL ampicillin ved 37 ° C i en shaker og udtrække plasmid DNA ved hjælp af en plasmid rensning kit. Kontrollere plasmidet ved fordøje 500 ng af DNA ved hjælp af SpeI og SalI restriktionsenzymer i 1 timer ved 37 ° C og Kør reaktionen på en agarosegel (0,5% i Tris-acetat-EDTA). Der bør være to bands på de rigtige størrelser af vektor (~ 7 kb) og Indsæt (størrelse varierer alt efter gen af interesse). Kontroller derefter, at plasmid af sekventering. Omdanne p415 -GAL1-FLAG- polyQ-FP plasmider til gærstamme W303 efter en standard gær transformation protokol2. 2. spotting Assay Streak gæren kloner regnskabsmæssige 25Q/72Q markeret med FP af interesse på en agar plade der indeholder gær udvalg medier (syntetisk komplet-SC uden leucin) med glukose som CO2-kilde. På samme tid, også streak 25Q/72Q-ymsfGFP til at tjene som positiv kontrol.Bemærk: 25Q/72Q-konstruktioner, der ikke indeholder en fluorescerende tag er ikke giftige og kan tjene som negativ kontrol. Inkuber plader ved 30 ° C i 2-3 d. Vælg op til tre enkelt kolonier fra pladen. Podes 5 mL SC suppleret med 2% glukose som CO2-kilde. Pellet 200 µL af hver overnight kultur og vaske det 3 x med sterilt destilleret vand. Resuspend celler i SC medier indeholdende 2% galactose som carbon kilde til at fremkalde udtryk for polyQ fusioner. Inkuber galactose media natten over ved 30 ° C i en tube rotator. Som et kontrolelement, skal du gentage dette trin ved hjælp af glukose-holdige medier. Den næste morgen, udligne celle tætheder til optisk tæthed på 600 nm (OD600) af 0,2 i 100 µL af SC medier i et sterilt 96-brønd plade. Forberede fire femdoblet fortyndinger af hver prøve med sterilt vand af pipettering 20 µL af prøven fra den tidligere godt ind i 80 µL af medier i de næste godt. Bruge en gær pinning værktøj til at spotte cellerne på selektiv plader (indeholdende glucose eller galactose) og inkuberes ved 30 ° C i 2 d. Billede af plader med en billede dokumentation enhed. 3. kvantificering af cellevækst i flydende kultur Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol. Måle OD600 bruger et spektrofotometer. Fortynd celler til en OD600 af 0,1 i 300 µL af medier i en 96-brønd plade. Kør hver prøve i tre eksemplarer. Inkuber plade i en plade læser/kuvøse med rystende kapaciteter. Angive antallet af prøver, temperatur på 30 ° C, absorbansen på 600 nm, længden af eksperimenter til 24 h og måling intervaller til 15 min, og vælg den kontinuerlige ryster tilstand. Oprette vækstkurven og kvantificere arealet under kurven ved hjælp af videnskabelige graftegning software. GraphPad prisme 7 anbefales. Indsætte dataene til et XY tabel med tre Repliker værdier. Vækstkurven bliver vist under mappen grafer på venstre side. At kvantificere arealet under kurven, Vælg analyser øverst til venstre og klik på arealet under kurven i XY-analyser. 4. fluorescerende mikroskopi Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol. Fortynd celler 10 x i vækst medier og overføre 200 µL af hver prøve til 8-godt billeddiagnostiske afdelinger. Image celler ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 63 X planlægger Aprochromoat mål (1,4 NA) ved stuetemperatur.Bemærk: Brugen af en Konfokal mikroskop er valgfri. En standard wide-felt fluorescerende mikroskop kan også være ansat. Justere pinhole og laser power for optimal billede erhvervelse. Da 72Q aggregater er meget lysere end diffuse 25Q signalet, er det ofte nødvendigt at bruge en anden erhvervelse indstilling mellem de forskellige plasmider med henblik på at undgå mætning af fluorescerende signal. Behandle billeder ved hjælp af ImageJ20 eller en anden billedbehandling software. På dette trin ønskes procentdelen af cellerne at display aggregat kan beregnes manuelt. 5. dot skamplet Bemærk: I denne protokol, dot skamplet bruges til at undersøge protein udtryk niveauer. Forberede cellekulturer, følgende trin 2.1-2.5 i denne protokol. Generere protein lysates ved hjælp af glasperler i lysisbuffer (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Tilføje proteasehæmmere, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PSMF) og protease hæmmer cocktail, umiddelbart før brug. Pellet 5 mL af overnight kultur og resuspend det i 200 µL af glasperler og 200 µL af lysisbuffer. Vortex 30 s for 12 runder. Der centrifugeres ved 12.000 x g ved 4 ° C i 10 min og indsamle supernatanten. Spot et lige antal samlede proteiner på en nitrocellulose membran med en mikrofiltrering apparatur. Prewet membran med PBS og samle apparatet. Oprette forbindelse til et vakuum kilde og sørg for, at skruerne strammes. Tænd vakuum og lad prøven filtreres gennem membranen ved hjælp af tyngdekraften. Blokere membran i PBS – 0,05% Tween/5% fedtfri mælk. Inkuber membran med primære anti-FLAG antistof natten over ved 4 ° C. Det monoklonale anti-FLAG M1 anbefales. Vaske membran 3 x til 10 min med PSB – 0,05% Tween. Inkuber membran med en fluorescently mærket sekundær antistof (anti-mus IgG) i 1 time ved stuetemperatur i PBS – 0,05% Tween/5% fedtfri mælk. Vask membran 3 x 10 min. med PSB – 0,05% Tween. Billede-blot ved hjælp af en immunblot dokumentationssystem.

Representative Results

FPs har forskellige biofysiske egenskaber, herunder deres tendens til at oligomerize, der kan påvirke funktionsmåden for deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister. Denne protokol beskriver en simpel metode, hvor flere FPs kan være smeltet til giftige polyQ udvidelser. Da polyQ toksicitet er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ stretch15, denne analyse giver mulighed for en hurtig og direkte sammenligning af fluorescerende p…

Discussion

I denne artikel, forskellige assays til at måle en sammenlægning af Htt^ex1 polyQ udvidelser og deres virkning på gær vækst var ansat som en model til at studere hvordan forskellige fluorescerende proteiner ændrer deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister . Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis variant (ymsfGFP) som en positiv kontrol, viste vi at det registrerer betydelige ændringer i polyQ toksicitet og sammenlægning mellem forskellige fluorescerende tags og giver muli…

Materials

5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354