酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果
Summary
この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく, 蛍光タンパク質の迅速な評価のための誤って折りたたまれたポリグルタミン拡張の毒性を評価するためにプロトコルについて説明します。
Abstract
蛋白質のローカリゼーションと生細胞イメージングを用いた人身売買の調査、研究者は、しばしば蛍光レポーターに興味の彼らの蛋白質の融合に依存します。遺伝的に符号化された蛍光蛋白質 (FPs) の常に進化するリストは、それは蛍光融合設計に来るときいくつかの選択肢を持つユーザーを示します。各 FP は、結果として得られる蛍光融合の生化学的な携帯電話、および機能のプロパティに影響を与えることができます特定の光学的・生物物理プロパティを持ちます。たとえば、いくつかの FPs はフュージョン パートナーの機能を阻害する影響を受けやすい無指定のオリゴマーを形成する傾向があります。残念ながら、少数の方法だけは、FPs の蛍光レポーターの動作への影響をテストする存在します。ここでは、出芽酵母出芽酵母におけるポリグルタミン (polyQ) 毒性の試金を使用して FPs の影響を迅速に評価できるようにする簡単な方法をについて説明します。PolyQ 拡大 huntingtin 蛋白質は、拡張の huntingtin が有毒なオリゴマーと封入体に集約 (HD)、ハンチントン病の発症に関連付けられます。集約と酵母 polyQ 展開の毒性、蛍光タグ、FPs の動作への影響を研究する理想的な実験プラットフォーム提供の存在を含め、polyQ 地域を並べる順序に大きく依存、フュージョン パートナー。
Introduction
オワンクラゲ1、遺伝子にエンコードされた FPs の広いパレットから緑色蛍光タンパク質 (GFP) の初期特性が開発されているので同時にローカライズし、追跡する細胞生物学者が複数にできます。生活イベント/タンパク質は細胞2,3です。FPs は、サンゴとしたがって、彼らのそれぞれの蛍光スペクトルを超えて広く流用表示特定生物物理プロパティにクラゲから複数の有機体から派生します。これらのプロパティには、明るさには、光安定性、2,4他の間で oligomerize する傾向が含まれます。適切なタグの選択の重要な側面は、単量体の FPs を選択する不適切な相互作用と融合パートナーの機能の変化を最小限に抑え、レポーターの効率を最大化するために、蛍光レポーターを設計するとき、細胞内コンパートメント4,5,6を与えられました。GFP、時間をかけて、進化されているフュージョン パートナー5,7、8、蛍光タグの影響を最小限に抑えるため、FP の新しい亜種を実行と比較してどのように GFP のまま評価することは困難です。
FPs の動作を特徴付けるいくつかの方法が存在します。それらのほとんどは、超遠心法などの生化学的アプローチを使用して FPs の生物物理特性のテストを含むし、ゲルろ過プロトコル9,10、11,12。このようなメソッドがあるのままなセルの動作に少し洞察力を提供するソリューションで精製された FPs を使用して警告。組織の円滑な小胞体 (オゼ) 試金提供の開発生活 oligomerize FPs’ 傾向の定量的評価細胞13発現 FPs に小胞体尿細管を再編成する能力をテストすることによってオゼ渦巻き14。この手法は、GFP のモノマー ・ オリゴマーのバリエーション、および他の FPs の間の変更を正常に検出できます。主一時的に transfected セルで過剰発現に依存し、定量、画像解析を時間がかかること、自動データ収集および解析ワークフロー技術を採用しない限り、します。
これらのアプローチを補完するために酵母15,16毒性に関する蛍光タグの効果と polyQ 展開の集計の活用を試金を設立しました。以上 36 polyQ ストレッチの拡大は huntingtin 蛋白質 (Htt) がハンチントン病17,18と関連付けられている遺伝子の最初のエクソン内で繰り返されます。拡張 Httex1ミスフォールド Htt タンパク質が重度の成長障害に結合の強い凝集酵母で発現。興味深いことに、これらの表現型は強く FPs15,16を含む polyQ ストレッチを並べる順序によって影響されます。それは FPs のさまざまなプロパティも差動酵母 polyQ 毒性に影響を与えることができます合理化されました。確かに、GFP のような FPs と比べると、赤の蛍光タンパク質とその進化形態を示している減らされた毒性と集計16。この原稿は、次世代 FPs の polyQ 毒性と酵母の凝集の効果を評価するために詳細なプロトコルを提供します。この試金は以前の特徴と並行使用できる FP の亜種の迅速かつ潜在的高コンテンツ分析新しい FPs の最適な評価方法評価方法彼らは GFP と比較して実行できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事で Httex1 polyQ 展開と酵母の増殖への影響の集計を測定する様々 な試金がどのように異なる蛍光を勉強するはモデルとして採用されたタンパク質蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの変更.肯定的な制御として GFP バリアント (ymsfGFP) を使用して、示した polyQ 毒性と異なる蛍光タグ間集計の大幅な変化を検出とこに対して polyQ FP 融合パフォーマンスの直接かつ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.L.D. とパの健康研究のためカナダの機関から営業許可を支えこの研究ここで示した作業は革新のためのカナダの財団からジョン ・ r ・ エバンス リーダー基金受賞によってサポートされパ能にオンタリオ州研究基金から一致する基金に支えられて修士博士課程転送奨学金にシューリックスクール M 学校の長のedicine ・歯学部西部オンタリオの大学で。S.D.G. は、ALS カナダから博士課程奨学金によってサポートされます。
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
