Summary
本文介绍了评估荧光蛋白对错误折叠的多谷氨酰胺扩张的聚集和毒性的影响的协议, 以便在荧光记者的背景下快速评估一种新的无特征荧光蛋白。
Abstract
为了利用活细胞成像对蛋白质定位和贩运进行研究, 研究人员通常依靠荧光记者感兴趣的蛋白质融合。不断发展的基因编码荧光蛋白 (fp) 列表为用户提供了几种替代方案, 当涉及到荧光融合设计。每个 fp 都具有特定的光学和生物物理特性, 可以影响由此产生的荧光融合的生化、细胞和功能特性。例如, 若干 fp 往往形成非特异性低聚物, 容易阻碍融合伙伴的功能。遗憾的是, 只有少数方法可以测试 fp 对荧光记者行为的影响。在这里, 我们描述了一个简单的方法, 使快速评估的影响, 使用多谷氨酰胺 (聚 q) 毒性检测的多谷氨酰胺酿酒酵母。聚 q 扩展亨廷顿蛋白与亨廷顿病 (hd) 的发生有关, 亨廷顿蛋白的扩展聚集在有毒的低聚物和包涵体中。酵母中多 q 膨胀的聚集和毒性在很大程度上取决于多 q 区两侧的序列, 包括荧光标记的存在, 从而为研究 fop 对其行为的影响提供了一个理想的实验平台。融合合作伙伴。
Introduction
自从最初的表征绿色荧光蛋白 (gfp) 从aequorea维多利亚1, 一个广泛的调色板的基因编码的 fp 已经开发, 使细胞生物学家同时定位和跟踪多个活细胞中的细胞事件蛋白 2,3。flp 来自多种生物, 从水母到珊瑚, 因此, 显示出特定的生物物理特性, 这些特性广泛地转移到它们各自的荧光光谱之外。这些特性包括亮度、光稳定性和寡聚倾向等 2,4。选择单体 fp 是在设计荧光记者时选择合适标签的一个重要方面, 目的是最大限度地减少融合伙伴功能的不适当相互作用和变化, 最大限度地提高记者的效率。给细胞隔间 4,5,6。虽然随着时间的推移, gfp 的发展是为了最大限度地减少将荧光标记添加到融合伙伴5,7, 8 的影响, 但与 gfp 相比, 新的 fp 变体的性能仍难以评估。
很少有方法来描述 fp 的行为。其中大多数涉及使用生化方法测试 flp 的生物物理特性, 例如超离心和凝胶过滤方案9、10、11、12。这样的方法对在溶液中使用纯化的 fp 有一个警告, 几乎没有提供对它们在完整细胞中的行为的了解。通过测试过度表达的 fp 将内质网小管重组为小管的能力, 对 fp在活细胞 13中的低聚倾向进行了量化评估。oser漩涡 14。该技术可以成功地检测 gfp 和其他 fp 的单体和寡聚变异之间的变化。然而, 它主要依赖于瞬态转染细胞中的过度表达, 除非将该技术作为自动数据收集和分析工作流程, 否则定量和图像分析可能非常耗时。
为了补充这些方法, 我们建立了一种方法, 利用荧光标记对酵母15,16中多 q 扩张的毒性和聚集的影响。多 q 拉伸的扩展与超过36个重复在基因编码亨廷顿蛋白 (htt) 的第一个外显子与亨廷顿病 17,18.酵母中膨胀的 ttex1 的表达导致了错误折叠的 htt 蛋白的强烈聚集, 再加上严重的生长缺陷。有趣的是, 这些表型受到多 q 拉伸两侧序列的强烈影响, 包括 fp15,16。合理地认为, 不同性质的 fp 会对酵母中的多 q 毒性有不同的影响。事实上, 与类似 gfp 的 fp 相比, 红色荧光蛋白及其进化形式的毒性和聚集率降低了 16。这份手稿提供了一个详细的协议, 以评估下一代 fp 对酵母中的多 q 毒性和聚集的影响。该方法可对 fp 变体进行快速且可能含量高的分析, 可与以前表征的技术并行使用, 以优化新的 fp 特性, 并可评估它们与 gfp 相比的性能。
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Protocol
1. 在酵母中表达的新荧光标记 httex1 记者的生成
注: 本节已由江泽民等人从议定书中修改。16和 albakri等人19岁
- 设计引物, 通过 pcr 放大编码荧光蛋白或感兴趣的序列。前引物应包括一个引线序列, 以协助在消化过程中的限制性酶 (gatc), 其次是一个 spei 限制位点 (actag) 和20个基地下游的 atg (不包括 atg) 的荧光蛋白基因感兴趣。反向引物应包括引线序列 (gatc), 然后是 sali 限制站点 (gtcgac) 和 fp 序列停止密码子 (包括停止) 的停止密码子上游20个碱基的反向补货。
- 使用步骤1.1 中设计的引物, 使用具有以下设置的热环器进行 pcr 反应: 热到 95°c 1分钟, 在95°c 下循环 30秒, 60°c 循环 30秒, 72°c, 每 kb 产品2分钟。执行18个周期就足够了。
- 在琼脂糖凝胶上运行 pcr 反应 (在醋酸-edta 中为 0.5%)。应该有一个与预期产品尺寸相对应的单一波段。使用凝胶纯化试剂盒分离片段。
- 该协议采用了带有 25 (无毒) 和 72 (hd 相关, 显示强聚合) 多 q重复的 htt ex1 矢量。在37°c 条件下, 用 spei 和 sali 限制性酶消化 pcr 片段和载体3小时。
- 在步骤1.3 中, 通过在琼脂糖凝胶上运行来净化被消化的矢量。
- 使用 pcr 纯化试剂盒纯化已消化的 pcr 片段。
- 使用 t4 连接酶 (室温下 1小时)将得到消化的 p415片段和 p415-fl1-flag/25qquq 质粒1结合.使用10μl 反应 (1μl 的 t4 酶、10x 缓冲液的1μl、pcr 片段的6μl 和向量的 2μl)。
- 将结扎反应的2μl 转化为50μl 的大肠杆菌主管细胞, 并在冰上孵育30分钟。然后, 在42°c 时对细胞进行热冲击 30秒, 加入1毫升的 soc 外生长培养基, 在37°c 时在振动台孵育1小时。在含有100μgml 氨匹西林的 lb-agar 板上的反应板200μl。在37°c 下隔夜生板。
- 选择三个单独的细菌菌落, 在振荡器中的37°c 时, 在含有100μgml 氨匹西林的 lb-s伯中过夜生长, 并使用质粒纯化试剂盒提取质粒 dna。
- 在37°c 下, 用 spei 和 sali 限制性酶消化500纳气, 以1小时的速度检测质粒, 并在琼脂糖凝胶上运行反应 (在醋酸酯中占 0.5%)。应该有两个带在正确的尺寸的载体 (~ 7kb) 和插入物 (大小根据感兴趣的基因变化)。然后, 通过测序验证质粒。
- 按照标准酵母转化协议2,将p415-gal1-flag-聚 q-fp 质粒转化为酵母菌株 w303.
2. 发现检测
- 在含有酵母选择介质 (合成完全 sc 不含亮氨酸) 的琼脂板上, 以葡萄糖为碳源, 将带有25q/72q 的酵母克隆标记为感兴趣的 fp。同时, 也连续25q/7q-ymsfgffp 起到了积极的控制作用。
注: 25q/72q 结构不含荧光标记, 无毒, 可作为负控制。 - 在30°c 下将板材培育 2-3 d。
- 从板材中选择最多三个单个菌落。
- 接种5毫升的 sc, 以2% 的葡萄糖为碳源。
- 每个隔夜培养物的颗粒 200μl, 用无菌蒸馏水清洗3倍。
- 在含有2% 半乳糖的 sc 培养基中, 以2% 的半乳糖为碳源, 对细胞进行再利用, 诱导多 q 融合的表达。在管式旋转器中, 在30°c 下隔夜培养半乳糖介质。作为控制, 使用含葡萄糖介质重复此步骤。
- 第二天早上, 在无菌96孔板中, 将细胞密度平衡为 600 nm (od600), 在 100μl sc 介质中0.2。
- 用无菌水将样品从上井中的20μl 移入下井80μl 介质, 为每个样品准备四个5倍稀释剂。
- 使用酵母固定工具在选择性板 (含有葡萄糖或半乳糖) 上发现细胞, 并在30°c 下孵育 2 d。
- 使用图像文档设备对板材进行映像。
3. 液体培养中细胞生长的定量
- 按照本协议的步骤 2.1-2.5 准备细胞培养。
- 使用分光光度计测量 od600 。
- 在96孔板中, 将细胞稀释到0.1 英寸的 od600 。
- 运行每个样本一式三份。
- 将板材筛入具有晃动能力的板读者孵化器中。将样品数量、温度设置在30°c、吸收率在600纳米、实验长度为 24小时, 测量间隔设置为 15分钟, 并选择连续晃动模式。
- 创建生长曲线, 并使用科学的图形软件量化曲线下的面积。建议使用石墨垫棱镜7。将数据粘贴到具有三个复制值的 xy 表中。增长曲线将显示在左侧的"图形"文件夹下。若要量化曲线下的区域, 请选择左上角的 "分析",然后在xy 分析中单击 "曲线下的面积" 。
4. 荧光显微镜
- 按照本协议的步骤 2.1-2.5 准备细胞培养。
- 稀释生长介质中的细胞 10倍, 并将每个样品的200μl 转移到8井成像室。
- 在室温下使用配备63x 计划降色素值目标 (1.4 na) 的共聚焦显微镜对细胞进行成像。
注意: 共聚焦显微镜的使用是可选的。还可以使用标准的广域荧光显微镜。 - 调整针孔和激光功率, 以获得最佳图像采集。由于72q 集料比漫反射25q 信号要明亮得多, 因此通常需要在不同的质粒之间使用不同的采集设置, 以避免荧光信号的饱和。
- 使用 imagej20 或其他图像处理软件处理图像。在此步骤中, 需要手动计算显示聚合的单元格的百分比。
5. 点布
注意: 在这个协议中, 点印迹用于检查蛋白质表达水平。按照本协议的步骤 2.1-2.5 准备细胞培养。
- 在裂解缓冲液中使用玻璃珠生成蛋白质裂解物 (100 mm tris, ph 7.5; 200 mm ncl; 1 mm edta; 5% 甘油, 1 mm 二硫醇 [dtt])。使用前立即加入蛋白酶抑制剂、4 mm 苯甲基磺酰氟 (psmf) 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒。颗粒5毫升的隔夜培养, 并将其重新悬浮在200μl 的玻璃珠和200μl 的裂解缓冲液中。12发子弹的涡流30秒。在4°c 下以 12, 000 x g离心 10分钟, 并收集上清液。
- 使用微过滤设备在硝化纤维素膜上发现同等数量的总蛋白质。用 pbs 预湿膜并组装设备。连接到真空源, 并确保拧紧螺丝。打开真空, 让样品通过重力过滤膜。
- 在 pbs-0.05% 无脂牛奶中阻止膜。
- 在4°c 条件下, 用原发抗 flag 抗体隔夜培养膜。建议使用单克隆抗 flag m1。
- 用 psb-0.05% 补间清洗膜 3倍3分, 每次10分钟。
- 在室温下, 用荧光标记的二级抗体 (抗小鼠 igg) 在 pbs-0.05% 无脂牛奶中培养膜1小时。
- 用 psb-0.05% 补间清洗膜 3x 10分钟。
- 使用免疫印迹记录系统的图像印迹。
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Representative Results
fp 具有不同的生物物理特性, 包括其寡聚倾向, 这可能会影响其融合伙伴在荧光记者的背景下的行为。该协议描述了一种简单的方法, 其中多个 fp 可以融合到有毒的聚 q 扩展。由于聚 q 毒性高度依赖于多边形拉伸15两侧的序列, 因此该检测允许对荧光聚 q 融合记者进行快速、直接的比较 (图 1)。非 hd 相关的多 q 长度 (25q) 用作负对照, 不显示显著的毒性或聚集15, 16, 21,22.采用72q 获得 hd 样表型, 包括强生长抑制和多 q 聚集。重要的是, 所使用的htt ex1编码序列缺少多 q 拉伸后的一线丰富的域。在丙氨酸丰富的领域存在的情况下, httex1 在酵母15 中没有毒性。在本试验中, httex1融合到超夹 gfp12 (ymsfgfp)16的酵母优化的单体变体中, 如前面所述的 16, 用作阳性对照。该构造还包含一个 flag 表位标记在 n 终点的 httex1。这样就可以检测出具有相同抗体 (抗 flag) 的不同融合, 用于生化分析。作为一项原则证明, 72qhtt ex1融合到酵母优化的 tagbfp2 (yomtagbfp2)23不会导致通过琼脂板上的点检测或液体介质中的生长来测量缓慢的增长 (图 2), 这表明其性质荧光标记确实会阻碍细胞中的多 q 扩张行为。
荧光聚 q 融合的聚合可以用荧光显微镜进行评估。72Q-ymsfGFP 与25q 相比显示出显著的聚集。然而, 72-yomtagbfp 荧光信号在整个细胞质中保持扩散 (图 3)。在大多数情况下, 不建议使用相同的图像采集设置 (激光功率、曝光时间) 来获取25q 和72q 图像。72q 表达单元中的聚集体比扩散的25q 信号要明亮得多。因此, 在用于获取72q 图像的成像条件下, 扩散的25q 信号可能会显得非常微弱或根本不可见。在72q 表达细胞的成像过程中, 还应应用适当的采集设置, 以最大限度地降低饱和度。
不同多 q 融合的表达水平可能会影响毒性。引起了一种不溶于洗涤剂的淀粉样蛋白, 如聚 q 聚集体, 很难进行生化研究, 也不适合用标准 sds-page 进行分析。因此, 可以进行点印迹来评估蛋白质水平。在 httex1 的氨基末端包含 flag 标记, 可以同时检测所有荧光融合, 尽管存在 fp (图 4)。或者, 可以进行半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳 (sdd-age), 以评估多 q 低聚物16的形成.在哈夫曼和林奎斯特24号中提供了详细的协议和视频。
图 1: 用于分析荧光蛋白标记对酵母中多 q 膨胀蛋白聚集和毒性的影响的工作流程图.首先, fp 被克隆到酵母表达载体编码半乳糖诱导版本的 fla 标记的 htt ex1 具有 25q (无毒) 或 72q (hd 相关, 聚集和毒性) 重复.克隆通过测序进行选择和验证, 然后转化为酵母。在含半乳糖培养基中通过培养诱导多 q 融合表达后, 无论是在琼脂板上发现检测还是在生长液体介质上检测, 都可以评估多 q 毒性。用荧光显微镜对聚合反应进行了分析。使用点印迹评估不同构造的相对表达式。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在酵母中 htt ex1 荧光融合表达后的有代表性的生长检测结果。酵母表达25q 或 72q htt ext1 融合到 ymsfgfp或yomtagbfp 在葡萄糖 (控制) 或半乳糖介质 (聚 q 诱导) 中培养过夜, 并在琼脂板上 (a) 在琼脂板上发现或 (b) 在液体中进一步培养 (b)媒体评估不同条件下的增长。虽然72Q-ymsfGFP 会诱发明显的生长缺陷, 但72q-yomtagtbfp 显示出类似于无毒25q 的生长表型。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 酵母中的 httex1 荧光融合的代表性荧光图像。将表达25q 或 72q htt ex1 融合到 ymsfgfp 或 yomtagbfp的酵母在葡萄糖 (对照) 或半乳糖培养基 (聚 q 诱导) 中进行隔夜培养, 并用共聚焦显微镜成像。虽然72q-ymsfgfp 的表达导致了强大的多 q 蛋白聚集, 72q-yomtaggbfp 显示了一个扩散的细胞质信号类似于无毒的25q 对应。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 酵母中 htt ex1 荧光融合表达的代表性点印迹分析。酵母表示25q、46q、72q或103q htt ext1 融合在半乳糖培养基 (聚 q 诱导) 中过夜, 并进行点印迹分析。显示了细胞裂解物的五足稀释。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本文以各种检测方法进行了各种检测, 以测量 httex1多 q 扩张的聚集及其对酵母生长的影响, 以研究不同荧光蛋白如何在荧光记者的背景下改变其融合伙伴.使用 gfp 变体 (ymsfgfp) 作为阳性对照, 我们表明, 这可以检测到多 q 毒性和不同荧光标记之间聚集的显著变化, 并允许对 polyq-fp 融合性能进行直接和快速的比较。gfp 标记的构造16,19。
虽然本议定书的重点是荧光蛋白, 但该协议的各个部分可以很容易地适应, 以测试其他蛋白质标签的效果。此外, 本协议采用低副本酵母中丝量载体, 这些载体在细胞 25中存在的副本数量 (一般为一到两份) 方面可能有所不同。使用积分向量来确保实验条件下的一致表达可以避免这个问题。虽然该协议已优化用于 w303 背景, 其他酿酒酵母菌株可以使用。然而, 在设计新的结构之前, 应使用酶-ffgp 标记的载体来确定对多 q 毒性的敏感性。在某些情况下, 使用高拷贝 (2μ) 向量生成显著的生长缺陷可能是合适的。还建议用多 q 载体在酵母转化后测试多个分离株, 以避免选择具有较低多 q 毒性的自发抑制剂。值得注意的是, w303 酵母菌株26通常使用, 因为它比其他 s288c 衍生物 (如 BY4741/BY4742 27) 对多 q 毒性更敏感, 从而允许更广泛的生长表型。重要的是, 用于此检测的菌株需要携带 rnq1 prion 蛋白, 因为rnq1细胞不显示多 q 毒性和聚集28。使用带有氨基端子 flag 标记且缺乏丰富的内容域的 httex1构造也很重要。融合设计的其他变化可能会改变有毒表型 15。最后, 在含半乳糖介质中诱导多 q 融合表达是协议 21的关键步骤。当将细胞从含葡萄糖培养基转移到含半乳糖介质时, 重要的是用无菌水至少清洗细胞三次, 以消除所有可能有助于抑制 gal1启动子的诱导的葡萄糖痕迹。在进行发现性检测时, 在半乳糖培养基中培养细胞以诱导融合的表达, 可以加剧72q 融合的毒性表型, 并有助于识别不同融合过程中生长的变化 16.
作为一种限制, 以前的研究没有观察到 cfp (gfp 衍生物) 的非单体版本和 ymsfgfp16之间的差异效应。因此, 至少对于 gfp 变体, 这种检测可能不够敏感, 无法区分单体和寡聚变异, 这突出表明需要用其他标准方法 (如 oser 检测13和生化分析9,10,11,12, 可以直接评估寡聚。此外, 应该注意的是, 与体外检测或其在其他生物中的表达相比, fp 在酵母中的行为可能不同。
这些方法总体上使研究人员能够快速描述新的 fp, 并测量它们对融合伙伴的影响。在未来, 该协议将能够快速筛选以前具有特征的 fp 的新衍生物, 以识别行为类似于 gfp 变体的突变体, 而 gfp 变体仍然是 fp 记者的金标准度量。虽然该协议侧重于荧光蛋白, 它可以很容易地适应屏幕上的其他基因编码标签的影响, 如 snap-tag30和 suntag31。
总之, 该协议提供了一个快速和易于扩展的分析, 使新一代的 fp 和其他基因编码标签的进一步表征, 以指导融合蛋白设计的研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了加拿大卫生研究所向医学博士和 p. l. 的运营赠款的支持。这里介绍的工作得到了加拿大创新基金会的 john r. evans 领导基金奖和安大略省研究基金向 p. l. y. j. 提供的配套基金的支持, 该基金由舒利奇 m 学院院长颁发的博士转学硕士学位奖学金提供支持在西安大略大学的医学和牙科。s. d. g. 由加拿大 als 博士奖学金提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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