Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

फ्यूजन भागीदारों पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रभाव खमीर में Polyglutamine विषाक्तता परख का उपयोग

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

यह लेख प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एकत्रीकरण और polyglutamine विस्तार की विषाक्तता पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में एक नए पात्र फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तेजी से मूल्यांकन के लिए ।

Abstract

प्रोटीन स्थानीयकरण और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग तस्करी की जांच के लिए, शोधकर्ताओं अक्सर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए ब्याज की अपने प्रोटीन से इनकार करने पर भरोसा करते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की लगातार विकसित सूची (एफपीएस) यह फ्लोरोसेंट फ्यूजन डिजाइन करने के लिए आता है जब कई विकल्प के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रस्तुत करता है । प्रत्येक FP विशिष्ट ऑप्टिकल और भौतिक गुण है कि जैव रासायनिक, सेलुलर, और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट फ्यूजन के कार्यात्मक गुणों को प्रभावित कर सकते है । उदाहरण के लिए, कई एफपीएस के लिए विशिष्ट oligomers कि फ्यूजन साथी के समारोह पर बाधा संभावना है फार्म के लिए करते हैं । दुर्भाग्य से, केवल कुछ तरीकों फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए मौजूद हैं । यहां, हम एक सरल तरीका है कि polyglutamine (polyQ) नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें विषाक्तता परख का उपयोग एफपीएस के प्रभाव का तेजी से मूल्यांकन में सक्षम बनाता है वर्णन । PolyQ-विस्तारित huntingtin प्रोटीन Huntington की बीमारी (एचडी) की शुरुआत के साथ जुड़े होते हैं, जहां विषैले oligomers और समावेशी निकायों में विस्तारित huntingtin समुच्चय होता है । एकत्रीकरण और खमीर में polyQ विस्तार की विषाक्तता अत्यधिक फ्लोरोसेंट टैग की उपस्थिति सहित polyQ क्षेत्र, पार्श्व अनुक्रम पर निर्भर कर रहे हैं, इस प्रकार एक आदर्श प्रयोगात्मक मंच प्रदान करने के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का अध्ययन फ्यूजन साथी ।

Introduction

के बाद से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रारंभिक लक्षण वर्णन (GFP) विक्टोरिया Aequorea1, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एफपीएस की एक विस्तृत पैलेट विकसित किया गया है, की अनुमति सेल जीव एक साथ स्थानीयकरण और ट्रैक एकाधिक सेलुलर घटनाओं में जीवित कोशिकाओं2,3। एफपीएस कई जीवों से प्राप्त कर रहे हैं, जेलिफ़िश से कोरल करने के लिए, और इसलिए, प्रदर्शन विशिष्ट भौतिक गुण है कि उनके संबंधित फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम से परे बड़े पैमाने पर डायवर्ट । इन गुणों में चमक, photostability, और अंय2,4के बीच oligomerize करने की प्रवृत्ति शामिल है । monomeric एफपीएस का चयन एक उपयुक्त टैग के चयन में एक महत्वपूर्ण पहलू है जब एक फ्लोरोसेंट संवाददाता डिजाइनिंग, में आदेश अनुचित बातचीत और फ्यूजन साथी समारोह के परिवर्तन को कम करने और एक के लिए रिपोर्टर दक्षता को अधिकतम करने के लिए सेलुलर कम्पार्टमेंट4,5,6दिया । जबकि GFP है, समय के साथ, फ्यूजन साथी के लिए फ्लोरोसेंट टैग जोड़ने के प्रभाव को कम करने के लिए विकसित किया गया है5,7,8, कैसे नए FP वेरिएंट GFP की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल रहता है ।

कुछ तरीकों को एफपीएस के व्यवहार की विशेषताएं मौजूद हैं । उनमें से ज्यादातर ऐसे ultracentrifugation और जेल निस्पंदन प्रोटोकॉल9,10,11,12के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण, का उपयोग कर एफपीएस के भौतिक गुणों का परीक्षण शामिल है । इस तरह के तरीकों समाधान में शुद्ध एफपीएस का उपयोग कर की चेतावनी है, बरकरार कोशिकाओं में उनके व्यवहार में थोड़ा अंतर्दृष्टि की पेशकश की । संगठित चिकनी endoplasmic जालिका (OSER) परख के विकास oligomerize endoplasmic जालिका में पुनर्गठित एफपीएस की क्षमता का परीक्षण करके13 कोशिकाओं में रहने वाले नलिकाओं के लिए एफपीएस प्रवृत्ति का quantifiable आकलन प्रदान करता है OSER whorls14. इस तकनीक को सफलतापूर्वक GFP और अंय एफपीएस के monomeric और oligomeric वेरिएंट के बीच परिवर्तन का पता लगा सकते हैं । हालांकि, यह क्षणिक transfected कोशिकाओं में व्यक्त पर ज्यादातर निर्भर करता है, और quantitation और छवि विश्लेषण समय लेने वाली हो सकता है जब तक कि तकनीक एक स्वचालित डेटा संग्रह और विश्लेषण कार्यप्रवाह के रूप में अपनाया है ।

आदेश में इन दृष्टिकोण पूरक करने के लिए, हम एक परख है कि विषाक्तता और खमीर में polyQ विस्तार के एकत्रीकरण पर फ्लोरोसेंट टैग के प्रभाव का लाभ लेता है की स्थापना की15,16। huntingtin प्रोटीन (Htt) Huntington रोग17,18के साथ जुड़ा हुआ है जीन एंकोडिंग के पहले एक्सॉन के भीतर अधिक से अधिक ३६ दोहराता के साथ polyQ खिंचाव के विस्तार । विस्तृत Httex1 के एक मजबूत एकत्रीकरण में खमीर परिणामों में Htt की अभिव्यक्ति एक गंभीर वृद्धि दोष के लिए युग्मित प्रोटीन । दिलचस्प है, इन phenotypes जोरदार polyQ खिंचाव, एफपीएस15सहित,16के पार्श्व अनुक्रम से प्रभावित हैं । यह तर्क दिया था कि एफपीएस के विभिंन गुणों को विभेदक खमीर में polyQ विषाक्तता को प्रभावित कर सकते हैं । वास्तव में, GFP की तुलना में एफपीएस की तरह, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और उनके विकसित रूपों एक कम विषाक्तता और एकत्रीकरण16दिखाया गया है । यह पांडुलिपि खमीर में polyQ विषाक्तता और एकत्रीकरण पर एफपीएस की अगली पीढ़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस परख के लिए अनुमति देता है एक तेजी से और संभवतः उच्च FP संस्करण है कि समानांतर में नए एफपीएस के इष्टतम लक्षण वर्णन के लिए तकनीक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की सामग्री का विश्लेषण और आकलन कर सकते है कि वे कैसे GFP की तुलना में प्रदर्शन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. खमीर में एक अभिव्यक्ति के लिए नई फ्लोरोसेंट टैग Httex1 पत्रकारों की पीढ़ी

नोट: यह खंड जियांग एट अल द्वारा प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है । 16 और Albakri एट अल. 19. शी.

  1. डिजाइन प्राइमरों को पीसीआर द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन या ब्याज एंकोडिंग अनुक्रम बढ़ाना । आगे प्राइमर एक नेता अनुक्रम पाचन के दौरान प्रतिबंध एंजाइम की सहायता (GATC), एक SpeI प्रतिबंध साइट (ACTAGT) और ATG के 20 कुर्सियां बहाव (ATG को छोड़कर) फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज की जीन के द्वारा पीछा शामिल होना चाहिए । रिवर्स प्राइमर नेता अनुक्रम (GATC), एक SalI प्रतिबंध स्थल (GTCGAC) और 20 कुर्सियां (बंद सहित) एफ पी अनुक्रम के स्टॉप codon के ऊपर के पूरक के बाद से पीछा शामिल करना चाहिए ।
  2. १.१ चरण में डिजाइन प्राइमरों का उपयोग करना, पीसीआर प्रतिक्रिया निंनलिखित सेटिंग्स के साथ एक thermocycler का उपयोग कर: 1 मिनट और चक्र के लिए ९५ ° c पर 30 एस, 30 एस के लिए ६० ° c के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी, और पीसीआर उत्पाद के प्रति kB 2 मिनट के लिए ७२ ° c । 18 चक्र प्रदर्शन पर्याप्त है ।
  3. एक agarose जेल (Tris-एसीटेट-EDTA में ०.५%) पर पीसीआर रिएक्शन चलाते हैं । कोई एकल बैंड अपेक्षित उत्पाद आकार करने के लिए संगत होना चाहिए । एक जेल शोधन किट का उपयोग कर टुकड़ा अलग ।
  4. प्रोटोकॉल एक Httex1 25 (विषाक्त) और ७२ (HD-जुड़े, एक मजबूत एकत्रीकरण प्रदर्शित) polyQ दोहराता ले जा वेक्टर कार्यरत हैं । दोनों पीसीआर टुकड़े और वेक्टर SpeI और SalI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए डाइजेस्ट ।
  5. यह चरण १.३ में के रूप में एक agarose जेल पर चलाकर पचा वेक्टर शुद्ध ।
  6. एक पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर पच पीसीआर टुकड़ा शुद्ध ।
  7. Ligate के परिणामस्वरूप पचता पीसीआर टुकड़ा और p415-GAL1-झंडा-25/72QpolyQ plasmids1 टी-4 ligase (कमरे के तापमान पर 1 एच) का उपयोग कर । एक 10 µ एल प्रतिक्रिया (टी-4 एंजाइम के 1 µ एल, 10x बफर के 1 µ एल, पीसीआर टुकड़ा के 6 µ एल का उपयोग करें, और वेक्टर के 2 µ एल) ।
  8. ई कोलाईके ५० µ एल में बंधाव प्रतिक्रिया के 2 µ एल बदलने-सक्षम कोशिकाओं और 30 मिनट के लिए बर्फ पर उंहें गर्मी । फिर, गर्मी सदमे में कोशिकाओं के लिए ४२ ° c 30 s. समाज वृद्धि मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक शेखर में 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । प्लेट २०० १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त एक पौंड-आगर प्लेट पर प्रतिक्रिया के µ एल. रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
  9. तीन व्यक्तिगत बैक्टीरियल कॉलोनियों का चयन करें, उंहें पौंड के 3 मिलीलीटर-शोरबा में १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन युक्त ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर में और प्लाज्मिड डीएनए एक प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर निकालने में रातोंरात विकसित ।
  10. SpeI और SalI प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए डीएनए के ५०० एनजी को पचाने और एक agarose जेल (०.५% में Tris-एसीटेट-EDTA) पर प्रतिक्रिया चलाने के द्वारा प्लाज्मिड की जांच करें । वहां सदिश के सही आकार में दो बैंड होना चाहिए (~ 7 केबी) और डालने के आकार (ब्याज की जीन के अनुसार बदलता है) । उसके बाद, sequencing द्वारा प्लाज्मिड की जाँच करें ।
  11. एक मानक खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल2निंनलिखित खमीर तनाव W303 में p415-GAL1-झंडा-polyQ-FP plasmids रूपांतरण ।

2. खोलना परख

  1. लकीर 25Q ले जाने के खमीर क्लोनों/72Q खमीर चयन मीडिया युक्त एक आगर प्लेट पर ब्याज की FP के साथ टैग की गईं (सिंथेटिक पूर्ण-SC leucine के बिना) कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज के साथ । एक ही समय में, यह भी लकीर 25Q/72Q-ymsfGFP एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए ।
    नोट: 25Q/72Q constructs नहीं है कि एक फ्लोरोसेंट टैग शामिल नहीं विषाक्त और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
  2. 2-3 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन ।
  3. प्लेट से तीन एकल कॉलोनियों तक का चयन करें ।
  4. Inoculate अनुसूचित जाति के 5 मिलीलीटर कार्बन स्रोत के रूप में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक ।
  5. गोली २०० प्रत्येक रात संस्कृति के µ एल और यह बाँझ आसुत पानी के साथ 3x धो लो ।
  6. अनुसूचित जाति के मीडिया में कोशिकाओं को resuspend कार्बन स्रोत के रूप में 2% गैलेक्टोज polyQ फ्यूजन की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए । एक ट्यूब रोटेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गैलेक्टोज मीडिया मशीन । नियंत्रण के रूप में, ग्लूकोज-युक्त मीडिया का उपयोग करके इस चरण को दोहराएँ ।
  7. अगली सुबह, बराबर सेल घनत्व ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में ०.२ के १०० µ एल में अजा मीडिया के एक बाँझ ९६-अच्छी तरह से थाली में ऑप्टिकल घनत्व करने के लिए ।
  8. अगले अच्छी तरह से ८० µ एल में मीडिया के पिछले अच्छी तरह से नमूने के 20 µ एल pipetting द्वारा बाँझ पानी के साथ प्रत्येक नमूने के चार पंचगुना कमजोरियां तैयार करें ।
  9. चुनिंदा प्लेटों (ग्लूकोज या गैलेक्टोज युक्त) पर कोशिकाओं को हाजिर करने के लिए एक खमीर लगाए उपकरण का उपयोग करें और 2 डी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  10. छवि एक छवि प्रलेखन डिवाइस के साथ प्लेटें ।

3. तरल संस्कृति में कोशिका वृद्धि का ठहराव

  1. इस प्रोटोकॉल के चरण २.१-२.५ के बाद, कक्ष संस्कृतियों को तैयार करें ।
  2. एक spectrophotometer का उपयोग६०० आयुध डिपो को मापने ।
  3. ०.१ के एक आयुध डिपो६०० में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में मीडिया के ३०० µ एल में कोशिकाओं को पतला ।
  4. प्रत्येक नमूना तपसिल में चलाएँ ।
  5. हिलती क्षमताओं के साथ एक प्लेट रीडर में थाली मशीन/ नमूनों की संख्या, 30 डिग्री सेल्सियस पर तापमान, ६०० एनएम पर अवशोषित, 24 घंटे के लिए प्रयोगों की लंबाई, और माप अंतराल 15 मिनट के लिए सेट करें, और लगातार मिलाते हुए मोड का चयन.
  6. वृद्धि वक्र बनाएं और वक्र के तहत क्षेत्र वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । GraphPad चश्मे 7 की सिफारिश की है । डेटा को किसी XY तालिका में तीन दोहराने वाले मानों के साथ चिपकाएं । वृद्धि वक्र रेखांकन फ़ोल्डर के तहत बाईं ओर दिखाया जाएगा । वक्र के तहत क्षेत्र का अंदाजा लगाने के लिए, ऊपरी बाईं ओर विश्लेषण का चयन करें और XY विश्लेषणमें वक्र के अंतर्गत क्षेत्र क्लिक करें ।

4. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी

  1. इस प्रोटोकॉल के चरण २.१-२.५ के बाद, कक्ष संस्कृतियों को तैयार करें ।
  2. वृद्धि मीडिया में 10x कोशिकाओं को पतला और 8-अच्छी इमेजिंग मंडलों के लिए प्रत्येक नमूने के २०० µ एल हस्तांतरण ।
  3. छवि कक्ष के तापमान पर एक 63X योजना Aprochromoat उद्देश्य (१.४ NA) से सुसज्जित एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं.
    नोट: एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग वैकल्पिक है । एक मानक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप भी कार्यरत किया जा सकता है ।
  4. इष्टतम छवि अधिग्रहण के लिए pinhole और लेजर शक्ति को समायोजित करें । चूंकि 72Q समुच्चय बहुत फैलाना 25Q संकेत से उज्जवल हैं, यह अक्सर फ्लोरोसेंट संकेत के संतृप्ति से बचने के लिए विभिन्न plasmids के बीच एक अलग अधिग्रहण सेटिंग का उपयोग करने के लिए आवश्यक है.
  5. ImageJ20 या किसी अंय छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को संसाधित । इस चरण में, कुल प्रदर्शित कक्षों का प्रतिशत मैन्युअल रूप से परिकलित किया जा सकता है वांछित है ।

5. बिंदी ब्लाटर

नोट: इस प्रोटोकॉल में, डॉट ब्लाट प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल के चरण २.१-२.५ के बाद, कक्ष संस्कृतियों को तैयार करें ।

  1. lysis बफर में काँच के मोतियों का प्रयोग प्रोटीन lysates उत्पन्न करें (१०० mm Tris, pH ७.५; २०० mm NaCl; 1 mm EDTA; 5% ग्लिसरॉल, 1 mm dithiothreitol [डीटीटी]). , सीधे उपयोग करने से पहले, टीज़ अवरोधकों, 4 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PSMF) और चिढ़ाने संकोची कॉकटेल जोड़ें । रात भर संस्कृति के 5 मिलीलीटर गोली और ग्लास मोतियों की २०० µ एल और २०० lysis बफर के µ एल में यह resuspend । भंवर ने 12 फेरे लिए 30 एस. 10 मिनट के लिए 4 ° c पर १२,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant इकट्ठा ।
  2. एक microfiltration तंत्र का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली पर कुल प्रोटीन की एक बराबर राशि हाजिर । Prewet पंजाबियों के साथ झिल्ली और उपकरण इकट्ठा । एक वैक्यूम स्रोत से कनेक्ट और सुनिश्चित करें कि शिकंजा कस रहे हैं । निर्वात पर बारी और गुरुत्वाकर्षण द्वारा झिल्ली के माध्यम से नमूना फिल्टर करते हैं ।
  3. पंजाब में झिल्ली ब्लॉक-०.०५% के बीच/5% वसा मुक्त दूध ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन । मोनोक्लोनल एंटी-फ्लैग M1 अनुशंसित है ।
  5. 10 मिनट PSB-०.०५% के बीच के साथ प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लो ।
  6. पंजाब में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए एक फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी माउस आईजीजी) के साथ झिल्ली की मशीन-०.०५% के बीच/
  7. धो झिल्ली 3x 10 PSB के साथ मिन-०.०५% के बीच ।
  8. छवि एक immunoblot प्रलेखन प्रणाली का उपयोग दाग ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एफपीएस विभिंन भौतिक गुण है, oligomerize करने के लिए अपनी प्रवृत्ति सहित, कि फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में उनके संलयन भागीदारों के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल एक सरल तरीका है जहां एकाधिक एफपीएस विषाक्त polyQ विस्तार करने के लिए जुड़े हो सकते है वर्णन करता है । चूंकि polyQ विषाक्तता polyQ खिंचाव15पार्श्व दृश्यों पर अत्यधिक निर्भर है, इस परख फ्लोरोसेंट polyQ फ्यूजन पत्रकारों के एक तेजी से और प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है (चित्रा 1) । एक गैर-HD-संबद्ध polyQ लंबाई (25Q) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और महत्वपूर्ण विषाक्तता या एकत्रीकरण15,16,21,22प्रदर्शित नहीं करता है । 72Q HD की तरह phenotypes प्राप्त करने के लिए कार्यरत है, मजबूत वृद्धि अवरोध और polyQ एकत्रीकरण सहित. महत्वपूर्ण बात, Httex1 कोडन अनुक्रम कार्यरत है कि polyQ खिंचाव इस प्रकार है लाइन अमीर डोमेन कमी है । लाइन अमीर डोमेन की उपस्थिति में, Httex1 खमीर15में विषाक्त नहीं है । इस परख में, एक Httex1 superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 के एक खमीर अनुकूलित monomeric संस्करण के लिए जुड़े एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पहले16वर्णित के रूप में प्रयोग किया जाता है । Httex1के एन-टर्मिनस पर एक ध्वज epitope टैग भी होता है । यह जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक ही एंटीबॉडी (विरोधी झंडा) के साथ अलग संलयन का पता लगाने की अनुमति देता है । के एक सबूत के सिद्धांत के रूप में, 72Q Httex1 खमीर के लिए जुड़े-अनुकूलित TagBFP2 (yomTagBFP2)23 धीमी गति से नहीं आगर प्लेटों या तरल मीडिया (चित्रा 2) में वृद्धि पर जगह परख द्वारा मापा विकास में परिणाम नहीं है, यह दर्शाता है कि प्रकृति फ्लोरोसेंट टैग के वास्तव में कोशिकाओं में polyQ विस्तार व्यवहार में बाधा उत्पंन कर सकते हैं ।

फ्लोरोसेंट polyQ संलयन का समुच्चय फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । 72Q-ymsfGFP 25Q की तुलना में महत्वपूर्ण एकत्रीकरण प्रदर्शित करता है । हालांकि, ७२-yomTagBFP फ्लोरोसेंट संकेत कोशिका द्रव्य भर में फैलाना रहता है (चित्रा 3) । अधिकांश मामलों में, यह अनुशंसित नहीं है कि दोनों 25Q और 72Q छवियों को प्राप्त करने के लिए समान छवि प्राप्ति सेटिंग्स (लेज़र पावर, एक्सपोज़र समय) का उपयोग करें । 72Q-व्यक्त कोशिकाओं में समुच्चय प्रसार 25Q संकेत की तुलना में बहुत उज्जवल हैं । इसलिए, 72Q छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयुक्त इमेजिंग शर्तों के तहत, फैलाना 25Q संकेत बहुत कमज़ोर दिखाई दे सकता है या बिल्कुल भी दिखाई नहीं देगा । उपयुक्त प्राप्ति सेटिंग्स भी 72Q-एक्सप्रेस कक्षों की इमेजिंग के दौरान संतृप्ति को कम करने के लिए लागू किया जाना चाहिए ।

विभिंन polyQ संलयन के अभिव्यक्ति स्तर विषाक्तता को प्रभावित कर सकता है । डिटर्जेंट-अघुलनशील amyloids, जैसे polyQ समुच्चय, जैव रासायनिक अध्ययन करने के लिए बेहद मुश्किल हैं और standerd एसडीएस-पृष्ठ द्वारा एक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं. इसलिए, डॉट दाग प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए किया जा सकता है । Httex1 के एमिनो टर्मिनस अंत में ध्वज टैग के शामिल किए जाने की अनुमति देता है सभी फ्लोरोसेंट संलयन का पता लगाने के साथ ही, एफपीएस (चित्रा 4) की उपस्थिति के बावजूद । वैकल्पिक रूप से, अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट agarose जेल ट्रो (SDD-आयु) polyQ oligomers16के गठन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है । एक विस्तृत प्रोटोकॉल और वीडियो Halfmann और Lindquist24में उपलब्ध हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एकत्रीकरण और खमीर में polyQ विस्तार प्रोटीन की विषाक्तता पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के प्रभाव के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह आरेख । सबसे पहले, एफपीएस खमीर अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन कर रहे है ध्वज के एक गैलेक्टोज-inducible संस्करण एंकोडिंग-टैग Httex1 या तो 25Q (नशा) या 72Q (एच. डी.-जुड़े, एकत्रीकरण और विषाक्त) को दोहराता है । क्लोनों चयनित और अनुक्रमण द्वारा सत्यापित कर रहे हैं और, बाद में, खमीर में तब्दील । गैलेक्टोज में मशीन द्वारा polyQ फ्यूजन अभिव्यक्ति की प्रेरण-मीडिया युक्त के बाद, या तो आगार प्लेटों या विकास तरल मीडिया पर परख खोलना polyQ विषाक्तता का आकलन कर सकते हैं । PolyQ एकत्रीकरण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जाता है । अलग निर्माण की एक रिश्तेदार अभिव्यक्ति डॉट ब्लाट का उपयोग कर मूल्यांकन किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि विकास परख खमीर में Httex1 फ्लोरोसेंट फ्यूजन की अभिव्यक्ति के बाद परिणाम । खमीर या तो 25Q या 72Q Httex1 ymsfGFP या yomTagBFP करने के लिए जुड़े व्यक्त ग्लूकोज (नियंत्रण) या गैलेक्टोज मीडिया (polyQ-प्रेरित) रात भर में और या तो (क) आगर प्लेटों पर देखा या (ख) में सुसंस्कृत किया गया था और तरल में आगे की मशीन मीडिया के विभिंन स्थितियों के तहत विकास का आकलन करने के लिए । जबकि 72Q-ymsfGFP एक महत्वपूर्ण वृद्धि दोष लाती है, 72Q-yomTagBFP एक विकास phenotype को विषाक्त 25Q समकक्षों के समान प्रदर्शित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
3 चित्रा: Httex1 फ्लोरोसेंट संलयन के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां खमीर में । खमीर या तो 25Q या 72Q Httex1 ymsfGFP या yomTagBFP से जुड़े व्यक्त ग्लूकोज में संस्कृति (नियंत्रण) या गैलेक्टोज मीडिया (polyQ-प्रेरित) रातोंरात और एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ imaged था । जबकि 72Q-ymsfGFP अभिव्यक्ति एक मजबूत polyQ प्रोटीन एकत्रीकरण में परिणाम, 72Q-yomTagBFP एक फैलाना cytoplasmic विषाक्त 25Q समकक्षों के समान संकेत प्रदर्शित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि डॉट दाग खमीर में Httex1 फ्लोरोसेंट फ्यूजन अभिव्यक्ति का विश्लेषण । खमीर व्यक्त 25Q, 46Q, 72Q, या 103Q Htt ex1 के लिए एक दूसरे से जुड़े गैलेक्टोज मीडिया में संस्कृति (polyQ-प्रेरित) रातोंरात और डॉट दाग विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया । कोशिका lysates के पंचगुना कमजोरियां दिखाई जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अनुच्छेद में, विभिंन परख Httex1 polyQ विस्तार और खमीर विकास पर उनके प्रभाव के एकत्रीकरण को मापने के लिए एक मॉडल के रूप में कार्यरत थे अध्ययन कैसे अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में उनके संलयन भागीदारों बदल . एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक GFP संस्करण (ymsfGFP) का प्रयोग, हमें पता चला है कि यह polyQ विषाक्तता और विभिंन फ्लोरोसेंट टैग के बीच एकत्रीकरण में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाता है और polyQ-FP फ्यूजन प्रदर्शन के खिलाफ एक प्रत्यक्ष और तेजी से तुलना के लिए अनुमति देता है GFP-tagged construction16,19.

जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल के विभिंन भागों को आसानी से अंय प्रोटीन टैग के प्रभाव का परीक्षण अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल कम कॉपी खमीर centromeric वैक्टर कि प्रति संख्या के मामले में भिंन हो सकते है रोजगार (आम तौर पर एक दो प्रतियां)25कोशिकाओं में मौजूद । एकीकृत वैक्टर का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों में एक समान अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए इस समस्या को दरकिनार सकता है । हालांकि इस प्रोटोकॉल W303 पृष्ठभूमि में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, अंय एस cerevisiae उपभेदों कार्यरत किया जा सकता है । हालांकि, polyQ विषाक्तता को संवेदनशीलता ymsfGFP का उपयोग कर निर्धारित किया जाना चाहिए-वैक्टर नए निर्माण डिजाइन करने से पहले टैग । कुछ मामलों में, यह उच्च-प्रतिलिपि (2 µ) वैक्टर एक महत्वपूर्ण वृद्धि दोष उत्पंन करने के लिए काम करने के लिए उपयुक्त हो सकता है । यह भी एक कम polyQ विषाक्तता दिखा सहज दमन का चयन से बचने के लिए polyQ वैक्टर के साथ खमीर परिवर्तन के बाद कई अलग परीक्षण करने के लिए सुझाव दिया है. नोट की, W303 खमीर तनाव26 आम तौर पर प्रयोग किया जाता है के रूप में यह और अधिक polyQ विषाक्तता के प्रति संवेदनशील है जैसे अंय S288C डेरिवेटिव, जैसे BY4741/BY474227, इस प्रकार वृद्धि phenotypes की एक व्यापक श्रेणी के लिए अनुमति । महत्वपूर्ण बात, इस परख के लिए कार्यरत उपभेदों Rnq1Δ कोशिकाओं polyQ विषाक्तता और एकत्रीकरण28प्रदर्शित नहीं करते के बाद से Rnq1 prion प्रोटीन ले जाने की जरूरत है । यह भी Httex1 का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है अमीनो-टर्मिनल झंडा टैग ले जाने और लाइन की कमी संपंन डोमेन का निर्माण । फ्यूजन डिजाइन के अंय रूपों विषाक्त phenotypes15बदल सकते हैं । अंत में, गैलेक्टोज-युक्त मीडिया में polyQ फ्यूजन अभिव्यक्ति की प्रेरण प्रोटोकॉल21के एक महत्वपूर्ण कदम है । ग्लूकोज से गैलेक्टोज-मीडिया युक्त कोशिकाओं को स्थानांतरित करते हैं, यह Gal1 प्रमोटर29की प्रेरण दमन करने के लिए योगदान कर सकता है कि ग्लूकोज के सभी निशान को खत्म करने के लिए कोशिकाओं को कम बाँझ पानी के साथ धोने के लिए महत्वपूर्ण है. जब परख खोलना प्रदर्शन, संवर्धन गैलेक्टोज मीडिया में रात भर कोशिकाओं फ्यूजन की अभिव्यक्ति 72Q फ्यूजन के विषाक्त phenotype ख़राब कर सकते हैं और विभिन्न फ्यूजन16भर में विकास में भेदभाव परिवर्तन में मदद करने के लिए प्रेरित करने के लिए.

एक सीमा के रूप में, पिछले अध्ययन के एक nonmonomeric संस्करण के बीच विभेदक प्रभाव का पालन नहीं किया (एक GFP व्युत्पंन) और16ymsfGFP । इस प्रकार, कम से GFP वेरिएंट के लिए, इस परख पर्याप्त संवेदनशील monomeric और oligomeric वेरिएंट के बीच भेदभाव नहीं हो सकता है, के लिए अंय मानक तरीकों के साथ polyQ विषाक्तता परख पूरक की आवश्यकता पर प्रकाश डाला, जैसे OSER परख13 और जैव रासायनिक विश्लेषण9,10,11,12 कि सीधे oligomerization का आकलन कर सकते हैं । इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एफपीएस खमीर में इन विट्रो परख या अन्य जीवों23में उनकी अभिव्यक्ति की तुलना में अलग ढंग से व्यवहार कर सकते हैं ।

सामूहिक रूप से, इन तरीकों शोधकर्ताओं तेजी से नए एफपीएस विशेषताएं और उनके फ्यूजन साथी पर उनके प्रभाव को मापने के लिए अनुमति देते हैं । भविष्य में, इस प्रोटोकॉल को पहले विशेषता एफपीएस के नए डेरिवेटिव के त्वरित स्क्रीनिंग के लिए म्यूटेंट कि GFP वेरिएंट, जो अभी भी FP पत्रकारों के लिए सोने के मानक उपाय कर रहे है इसी तरह के व्यवहार की पहचान करने में सक्षम हो जाएगा । हालांकि इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर केंद्रित है, यह आसानी से ऐसे स्नैप के रूप में अंय आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग टैग के प्रभाव के लिए स्क्रीन अनुकूलित किया जा सकता है,30 और31SunTag टैग ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल एक तेजी से और आसानी से स्केलेबल परख के लिए एफपीएस और अंय आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग टैग की नई पीढ़ी के लक्षण वर्णन सक्षम करने के लिए फ्यूजन प्रोटीन डिजाइन में अनुसंधान गाइड प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन M.L.D. और P.L. के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से एक ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है काम यहां प्रस्तुत एक जॉन आर इवांस नेता निधि पुरस्कार कनाडा की नींव से नवाचार के लिए और ओंटारियो अनुसंधान कोष से एक मिलान कोष से P.L. Y.J. के लिए एक एमएससी द्वारा समर्थित है एम के Schulich स्कूल के डीन से पीएचडी स्थानांतरण छात्रवृत्ति के लिए समर्थन किया है edicine और दंत चिकित्सा के पश्चिमी ओंटारियो विश्वविद्यालय में । S.D.G. ALS कनाडा से पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  3. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  4. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  5. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
  6. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  7. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  9. Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
  10. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  11. Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
  12. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  14. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
  15. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
  16. Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
  17. Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
  18. Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
  19. Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
  20. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  21. Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
  22. Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
  23. Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
  24. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
  25. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  26. Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
  27. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  28. Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
  29. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
  30. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  31. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).

Tags

जीव विज्ञान १४१ अंक फ्लोरोसेंट प्रोटीन polyglutamine विषाक्तता खमीर विकास परख एकत्रीकरण ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी
फ्यूजन भागीदारों पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रभाव खमीर में Polyglutamine विषाक्तता परख का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, … More

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter