Summary
Denne artikkelen beskriver for å vurdere effekten av fluorescerende proteiner på aggregering og toksisitet av misfolded polyglutamine utvidelse for rask vurdering av en nylig uncharacterized fluorescerende protein i konteksten av fluorescerende journalister.
Abstract
For etterforskningen av protein lokalisering og handel med levende celle imaging, stole forskere ofte på smelte deres protein interesse fluorescerende reporter. Listen stadig utvikling av genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) gir brukerne flere alternativer når det gjelder fluorescerende fusion design. Hver FP har bestemte optisk og Biofysiske egenskaper som kan påvirke biokjemiske mobilnettet og funksjonelle egenskapene til de resulterende fluorescerende fusjoner. For eksempel flere FPs tendens til å danne spesifikke oligomers som er utsatt for hindre på funksjon av fusion partneren. Dessverre finnes bare noen metoder for å teste effekten av FPs på oppførselen til fluorescerende reporteren. Her beskriver vi en enkel metode som lar rask vurdering av virkningen av FPs med polyglutamine (polyQ) toksisitet analyser i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-utvidet huntingtin proteiner er forbundet med utbruddet av Huntingtons sykdom (HD), hvor den utvidede huntingtin samler inn giftig oligomers og inkludering organer. Aggregering og toksisitet av polyQ utvidelser i gjær er svært avhengig av sekvenser flankert polyQ regionen, inkludert tilstedeværelse av fluorescerende koder, noe som gir en ideell eksperimentelle plattform for å studere virkningen av FPs på oppførselen til deres Fusion-partner.
Introduction
Siden første karakterisering av grønne fluorescerende protein (GFP) fra Aequorea victoria1, et stort palett av genetisk kodet FPs er utviklet, slik at celle biologer samtidig lokalisere og spore flere mobilnettet hendelser/proteiner i levende celler2,3. FPs er avledet fra flere organismer, fra maneter koraller, og derfor bestemte Biofysiske Skjermegenskaper som avlede mye utover deres respektive fluorescerende spektrum. Disse egenskapene inkluderer lysstyrke, photostability og en tendens til å oligomerize blant annet2,4. Velge monomerisk FPs er et viktig aspekt ved valg av en passende koden når du utformer fluorescerende reporter, for å minimere upassende interaksjoner og endringer av fusion partnerens funksjon og maksimere effektiviteten reporter for en gitt mobilnettet seksjon4,5,6. Mens GFP har over tid utviklet seg til å minimere virkningen av å legge fluorescerende koden til fusion partner5,7,8, hvordan nye FP varianter utfører i forhold til GFP er vanskelig å vurdere.
Noen metoder finnes for å karakterisere opptreden av FPs. De fleste av dem involverer testing Biofysiske egenskaper fps med biokjemiske tilnærminger, slik som ultracentrifugation og gel filtrering, protokoller,9,,10,,11,,12. Slike metoder har påminnelse om bruker renset FPs i løsning, tilbyr inn i deres atferd i intakt celler. Utviklingen av organisert glatte endoplasmatiske retikulum (OSER) analysen tilbyr en kvantifiserbare vurdering av FPs' tendens til å oligomerize i levende celler13 ved å teste muligheten for overexpressed FPs å omorganisere endoplasmatiske retikulum tubules i OSER kranser14. Denne teknikken kan oppdage endringer mellom monomerisk og oligomeric varianter av GFP og andre FPs. Men den avhenger mest overuttrykte i transiently transfekterte celler, og kvantifisering og bildeanalyse kan være tidkrevende hvis teknikken er vedtatt som en automatisert innsamling og analyse arbeidsflyt.
For å utfylle disse tilnærmingene, etablerte vi en analyse som drar nytte av effekten av fluorescerende koder på toksisitet og samling av polyQ utvidelser i gjær15,16. Utvidelse av polyQ strekningen med mer enn 36 gjentar innen den første ekson genet koding huntingtin protein (Htt) er assosiert med Huntingtons sykdom17,18. Uttrykk for utvidet Httex1 i gjær fører til en sterk samling av misfolded Htt protein kombinert en alvorlig vekst defekt. Interessant, er disse fenotyper sterkt påvirket av sekvenser flankert polyQ strekningen, inkludert FPs15,16. Det var rasjonaliserte at de forskjellige egenskapene til FPs ulikt kan påvirke polyQ toksisitet i gjær. Faktisk, sammenlignet med GFP-lignende FPs, røde fluorescerende proteiner og utviklet former har vist en redusert giftighet og aggregering16. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere effekten av neste generasjon av FPs på polyQ giftighet og aggregering i gjær. Denne analysen gir en rask og potensielt høy-innhold analyse av FP varianter som kan brukes parallelt med tidligere preget teknikker for optimal karakterisering av nye FPs og kan vurdere hvordan de utfører i forhold til GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon av nye Fluorescently merket Httex1 journalister for et uttrykk i gjær
Merk: Denne delen har blitt endret fra protokollen av Jiang et al. 16 og Albakri et al. 19.
- Utforme primere å forsterke sekvensen koding fluorescerende protein eller interesse PCR. Fremover primer bør inneholde en leder sekvens for å hjelpe begrensning enzymet under fordøyelsen (GATC), etterfulgt av en SpeI begrensning nettsted (ACTAGT) og 20 baser nedstrøms av ATG (unntatt ATG) av fluorescerende protein genet av interesse. Omvendt primer bør inkludere de leder sekvens (GATC), etterfulgt av et SalI begrensning nettsted (GTCGAC) og omvendt komplement 20 baser oppstrøms av stopp codon av FP sekvensen (inkludert stopp).
- Bruke primerne designet i trinn 1.1, utføre PCR reaksjonen bruker en thermocycler med følgende innstillinger: varme til 95 ° C i 1 min og syklus til 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 2 minutter per kB PCR produkt. Utføre 18 sykluser er rikelig.
- Kjøre PCR reaksjonen på en agarose gel (0,5% i Tris acetate EDTA). Det bør et enkelt band tilsvarer den forventede produktstørelse. Isolere fragmentet bruker en gel rensing kit.
- Protokollen bruker en Httex1 vektor bærer 25 (talt ikke toksisk) og 72 (HD-tilknyttet, viser en sterk samling) polyQ gjentas. Fordøye både PCR fragmenter og vektor med SpeI og SalI begrensning enzymer for 3t på 37 ° C.
- Rense fordøyd vektoren ved å kjøre den på en agarose gel som i trinn 1.3.
- Rense fordøyd PCR fragmentet bruker en PCR rensing kit.
- Ligate resulterende fordøyd PCR fragmentet og p415 -GAL1-flagg-25/72QpolyQ plasmider1 bruker T4 ligase (1 time i rom temperatur). Bruk en 10 µL reaksjon (1 µL av T4 enzym, 1 µL 10 X bufferen, 6 µL av PCR fragment og 2 µL av vektor).
- Transformere 2 µL av hemorroider reaksjon til 50 µL Escherichia coli-kompetent celler og Inkuber dem på is 30 min. Deretter varme-sjokk cellene på 42 ° C for 30 s. Legg til 1 mL av SOC utvekst media og Inkuber ved 37 ° C i 1 time i en shaker. Plate 200 µL av reaksjonen på en LB-agar plate inneholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber platen på 37 ° C over natten.
- Velg tre individuelle bakteriell koloniene, dyrke dem over natten i 3 mL LB-buljong med 100 µg/mL ampicillin på 37 ° C i en shaker og ekstra plasmider DNA ved å bruke en plasmider rensing kit.
- Sjekk plasmider ved fordøye 500 ng DNA ved hjelp av SpeI og SalI begrensning enzymer 1t på 37 ° C og kjøre reaksjonen på en agarose gel (0,5% i Tris acetate EDTA). Det skal være to band på riktig størrelsen på vektoren (~ 7 kb) og sette (størrelsen avhenger av genet av interesse). Deretter bekrefte plasmider ved sekvensering.
- Transformere den p415 -GAL1-flagg- polyQ-FP plasmider til gjær belastningen W303 etter en standard gjær transformasjon protokollen2.
2. se analysen
- Strek gjær kloner bærer 25Q/72Q merket med FP rundt på en agar plate med gjær utvalg media (syntetiske fullføre-SC uten leucine) glukose som karbon kilde. På samme tid, også strek 25Q/72Q-ymsfGFP for å tjene som en positiv.
Merk: 25Q/72Q konstruksjoner som ikke inneholder en fluorescerende kode er ikke giftig og kan tjene som negativ kontroll. - Inkuber platene på 30 ° C i 2-3 d.
- Velg opptil tre enkelt kolonier fra platen.
- Vaksinere 5 mL av FM med 2% glukose som karbon kilde.
- Pellets 200 µL av hver natten kultur og vaske det 3 x med sterilt destillert vann.
- Resuspend cellene i SC mediet som inneholder 2% galaktose karbon kilde til induserer uttrykk for polyQ fusjoner. Inkuber galaktose media overnatting på 30 ° C i en tube rotator. Gjenta dette trinnet ved hjelp av glukose inneholder medier som en kontroll.
- Neste morgen, utjevne celle-tettheten optisk tetthet på 600 nm (OD600) av 0,2 i 100 µL SC medier i et sterilt 96-brønns plate.
- Forberede fire femdoblet fortynninger av hvert utvalg med sterilt vann av pipettering 20 µL av utvalget fra forrige godt inn 80 µL av media i neste godt.
- Bruk en gjær låsing verktøyet å oppdage cellene på selektiv plater (inneholder glukose eller galaktose) og ruge på 30 ° C for 2 d.
- Bilde platene med en bildeenhet dokumentasjon.
3. kvantifisering av cellevekst i flytende kultur
- Forberede cellekulturer, følgende trinn 2.1-2.5 av denne protokollen.
- Måle OD600 bruker et spektrofotometer.
- Fortynne cellene til en OD600 av 0,1 i 300 µL av media i en 96-brønns plate.
- Kjøre hvert utvalg i tre eksemplarer.
- Inkuber platen i en plate leser/inkubator risting evner. Angi antall eksempler, temperaturen på 30 ° C, absorbansen på 600 nm, lengden på eksperimentene til 24 h og måling intervallene 15 min, og velg den risting kontinuerlig.
- Opprett vekstkurve og kvantifisere området under kurven med vitenskapelige grafisk programvare. GraphPad prisme 7 anbefales. Lime inn dataene i en XY bordet med tre Repliker verdier. Vekstkurven vises under mappen grafer på venstre side. Kvantifisere området under kurven, velger analyser øverst til venstre og klikker området under kurven i XY analyser.
4. fluorescerende mikroskopi
- Forberede cellekulturer, følgende trinn 2.1-2.5 av denne protokollen.
- Fortynne cellene 10 x i vekst medier og overføringen 200 µL av hvert utvalg til 8-og bildebehandling kamre.
- Bilde celler ved hjelp av en AC confocal mikroskop utstyrt med en 63 X planlegger Aprochromoat målsetting (1,4 NA) i romtemperatur.
Merk: Bruk av AC confocal mikroskop er valgfritt. Standard wide-field fluorescerende mikroskop kan også anvendes. - Justere pinhole og laser makt for optimal bildeopptak. Siden 72Q-aggregater er mye lysere enn diffus 25Q signalet, kreves det ofte å bruke en annen oppkjøpet innstilling mellom forskjellige plasmider for å unngå metning av fluorescerende.
- Behandle bildene benytter ImageJ20 eller en annen bildebehandling programvare. På dette trinnet, er prosentandelen av celler at skjermen samlet kan beregnes manuelt ønsket.
5. dot Blot
Merk: I denne protokollen, dot blot brukes til å undersøke protein uttrykk nivåene. Forberede cellekulturer, følgende trinn 2.1-2.5 av denne protokollen.
- Generer protein lysates bruke glassperler i lyseringsbuffer (100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glyserol, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Legg proteasehemmere, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PSMF) og protease hemmer cocktail, rett før bruk. Pellets 5 mL av natten kultur og resuspend det i 200 µL av glassperler og 200 µL av lyseringsbuffer. Vortex 30 s 12 runder. Sentrifuge 12.000 x g ved 4 ° C i 10 min og samle nedbryting.
- Spot en lik mengde totale proteiner på en nitrocellulose membran med en microfiltration apparater. Prewet membran med PBS og montere apparatet. Koble til et vakuum kilde og kontroller at skruene strammes. Slå på vakuum og la utvalg filteret gjennom membran av tyngdekraften.
- Blokkere membranen i PBS - 0,05% Tween/5% fettfri melk.
- Inkuber membranen med primære anti-flagg antistoff overnatting på 4 ° C. Monoklonalt anti-flagg M1 anbefales.
- Vask membranen 3 x i 10 min hver med PSB - 0,05% mellom.
- Inkuber membranen med et fluorescently merket sekundære antistoff (anti-mus IgG) 1t ved romtemperatur i PBS - 0,05% Tween/5% fettfri melk.
- Vask membran 3 x 10 min med PSB - 0,05% mellom.
- Bilde-blot bruke en immunoblot dokumentasjon system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FPs har forskjellige Biofysiske egenskaper, inkludert deres tendensen å oligomerize, som kan påvirke deres fusion partnere i sammenheng med fluorescerende journalister. Denne protokollen beskriver en enkel metode der flere FPs kan være smeltet sammen til giftige polyQ utvidelser. Siden polyQ toksisitet er svært avhengig av sekvenser flankert polyQ strekk15, gir denne analysen en rask og direkte sammenligning av fluorescerende polyQ fusion journalister (figur 1). En ikke-HD-tilknyttede polyQ lengde (25Q) brukes som en negativ kontroll og viser ikke betydelig toksisitet eller aggregering15,16,21,22. 72Q er ansatt å få HD-lignende fenotyper, inkludert sterk vekst hemming og polyQ aggregering. Viktigere, Httex1 koding sekvens ansatt mangel proline-rik domenet som etterfølger polyQ strekningen. I nærvær av proline-rik domenet er Httex1 ikke giftig i gjær15. I denne analysen brukes en Httex1 smeltet på en gjær-optimalisert monomerisk variant av superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 som en positiv som beskrevet tidligere16. Konstruerer inneholder også en flagg epitope kode på N-terminus av Httex1. Dette gjør påvisning av de forskjellige fusjoner med samme antistoffer (anti-flagg) for biokjemiske analyse. Som et bevis-av-prinsipp, 72Q Httex1 del gjær-optimalisert TagBFP2 (yomTagBFP2)23 ikke resulterer i langsom vekst målt ved enten spot analyser på agar plater eller vekst i flytende media (figur 2), som angir at naturen av fluorescerende koden kan faktisk hemme polyQ ekspansjon atferd i celler.
Samling av fluorescerende polyQ fusjoner kan vurderes med fluorescerende mikroskopi. 72Q-ymsfGFP viser betydelig samling i forhold til 25Q. 72-yomTagBFP fluorescerende signalet imidlertid diffus gjennom cytoplasma (Figur 3). I de fleste tilfeller, det anbefales ikke å bruke de samme bilde oppkjøp innstillingene (laser makt, eksponeringstid) å skaffe både 25Q og 72Q. Mengdefunksjoner i 72Q-uttrykke cellene er mye lysere enn diffust 25Q signalet. Derfor under imaging forhold til hente 72Q bilder, kan diffust 25Q signalet vises veldig svak eller ikke være synlig på alle. Aktuelle oppkjøpet innstillinger bør også brukes for å redusere metning under avbilding av 72Q-uttrykke cellene.
Uttrykket nivåer av de ulike polyQ fusjoner kan påvirke toksisitet. Vaskemiddel-uløselig amyloids, som polyQ aggregat, er notorisk vanskelig å studere biokjemisk og er ikke egnet for en analyse av standerd SDS-side. Derfor kan dot blots utføres for å vurdere protein nivå. Inkludering av flagg koden nederst amino terminus Httex1 tillater påvisning av alle fluorescerende fusjoner samtidig, til tross for tilstedeværelsen av FPs (Figur 4). Alternativt kan semi denaturing vaskemiddel agarose gel geleelektroforese (SDD-alder) utføres for å vurdere dannelsen av polyQ oligomers16. En detaljert protokollen og video er tilgjengelig i Halfmann og han24.
Figur 1: arbeidsflytdiagram for analyse av effekten av fluorescerende protein kode på aggregering og toksisitet av polyQ ekspansjon proteiner i gjær. Først FPs er klonet i gjær uttrykk vektorer koding en galaktose-induserbart versjon av flagg-merket Httex1 skjuler enten 25Q (talt ikke toksisk) eller 72Q (HD-assosiert, samles og giftig) gjentar. Kloner er valgt og bekreftet av sekvensering og deretter forvandlet gjær. Etter induksjon av polyQ fusion uttrykk av inkubasjon i galaktose inneholder medier, enten småblødninger analyser på agar plater eller vekst flytende media kan vurdere polyQ toksisitet. PolyQ aggregering analyseres av fluorescerende mikroskopi. En relativ uttrykk for de ulike konstruksjoner vurderes med prikk blot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant vekst analyseresultatene etter uttrykk for Httex1 fluorescerende fusjoner i gjær. Gjær uttrykke enten 25Q eller 72Q Httex1 smeltet til ymsfGFP eller yomTagBFP ble kultivert i glukose (kontroll) eller galaktose media (polyQ-indusert) over natten og enten (A) oppdaget på agar plater eller (B) inkubert videre i væske Media å vurdere vekst under forskjellige betingelser. Mens 72Q-ymsfGFP induserer en betydelig vekst defekt, viser 72Q-yomTagBFP en vekst fenotypen ligner talt ikke toksisk 25Q kolleger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant bilder fluorescerende av Httex1 fluorescerende fusjoner i gjær. Gjær uttrykke enten 25Q eller 72Q Httex1 smeltet til ymsfGFP eller yomTagBFP ble kultivert i glukose (kontroll) eller galaktose media (polyQ-indusert) over natten og fotografert med AC confocal mikroskop. Mens 72Q-ymsfGFP uttrykket resulterer i en sterk polyQ protein aggregering, viser 72Q-yomTagBFP et diffust cytoplasmatiske signal ligner talt ikke toksisk 25Q kolleger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant dot blot analyse av Httex1 fluorescerende fusion uttrykk i gjær. Gjær uttrykke 25Q, 46Q, 72Q eller 103Q Httex1 del CFP ble kultivert i galaktose medier (polyQ-indusert) over natten og behandlet for dot blot analyse. Femdoblet fortynninger av celle lysates vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen, ulike analyser måle aggregering av Httex1 polyQ utvidelser og deres effekt på gjær vekst ble ansatt som modell å studere hvordan ulike fluorescerende proteiner endre deres fusion partnere i sammenheng med fluorescerende journalister . Bruker en GFP variant (ymsfGFP) som en positiv, viste vi at dette oppdager betydelige endringer i polyQ giftighet og aggregasjonen mellom ulike fluorescerende koder og tillater en direkte og rask sammenligning av polyQ-FP fusion ytelse mot GFP-merket konstruksjoner16,19.
Mens den nåværende protokollen fokuserer på fluorescerende proteiner, kan ulike deler av protokollen tilpasses lett å teste effekten av andre protein koder. I tillegg bruker finnes protokollen lav-kopi gjær centromeric vektorer som kan variere i form av Kopier antall (vanligvis en til to eksemplarer) i cellene25. Bruke integrerende vektorer for å sikre et ensartet uttrykk over eksperimentelle forhold kan omgå dette problemet. Mens denne protokollen er optimalisert for bruk i W303 bakgrunnen, kan andre S. cerevisiae stammer anvendes. Imidlertid bør mottakelighet for polyQ toksisitet fastsettes ved hjelp av ymsfGFP-merket vektorer før utforme nye konstruksjoner. I enkelte tilfeller kan det være hensiktsmessig å ansette høy-kopi (2µ) vektorer å generere en betydelig vekst defekt. Det anbefales også for å teste flere isolerer etter gjær transformasjonen med polyQ vektorer å unngå å velge spontan suppressors viser en redusert polyQ toksisitet. Av notatet, W303 gjær belastning26 brukes vanligvis som det er mer følsomme for polyQ toksisitet enn andre S288C derivater, som BY4741/BY474227, slik at for et bredere spekter av vekst fenotyper. Viktigere, vil stammer ansatt for denne analysen bære Rnq1 prion protein siden rnq1Δ celler ikke vises polyQ giftighet og aggregering28. Det er også viktig å bruke Httex1 konstruksjoner bærer amino-terminal flagg koden og mangler proline-rik domenet. Andre varianter av fusion kan endre giftige fenotyper15. Til slutt, induksjon av polyQ fusion uttrykket i galaktose inneholder medier er et kritisk punkt protokollen21. Når du overfører celler fra glukose til galaktose-som inneholder mediet, er det viktig å vaske cellene minst tre ganger med sterilt vann å fjerne alle spor av glukose som kan bidra til repressing induksjon av Gal1 promoter29. Når du utfører småblødninger analyser, kan dyrking cellene over natten i galaktose medier induserer uttrykk for fusion forverre giftige fenotypen av 72Q fusion og hjelp diskriminere endringer i vekst over forskjellige fusjoner16.
Som en begrensning observerer tidligere studier ikke differensial effekter mellom en nonmonomeric versjon av CFP (en GFP derivat) og ymsfGFP16. Dermed minst for GFP varianter, denne analysen kan ikke være sensitive nok til å skille mellom monomerisk og oligomeric, fremhever behovet for å utfylle polyQ toksisitet søk med andre standard metoder, slik som OSER analysen13 og biokjemiske analyse9,10,11,12 som kan direkte vurdere oligomerization. Det bør også bemerkes at FPs kan fungerer annerledes i gjær sammenlignet i vitro analyser eller deres uttrykk i andre organismer23.
Samlet tillater disse metodene forskere å raskt karakterisere nye FPs og måle deres effekt på deres fusion partner. I fremtiden, gir denne protokollen rask screening av nye derivater av tidligere preget FPs å identifisere mutanter som fungerer på samme måte GFP varianter som er fortsatt en gull-standard måleenhet for FP journalister. Mens denne protokollen fokuserer på fluorescerende proteiner, kan det lett tilpasses skjermen for virkningene av andre genetisk kodet koder, for eksempel SNAPIN-tag30 og SunTag31.
Avslutningsvis gir denne protokollen en rask og lett skalerbar analysen for å aktivere flere karakteristikk av den nye generasjonen av FPs og andre genetisk kodet koder å lede forskning fusion protein design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien er støttet av en drift tilskudd fra den kanadiske institutter for Health Research M.L.D. og P.L. Arbeidet presentert her er støttet av en John R. Evans leder Fund award fra det kanadiske stiftelsen for innovasjon og en matchende fondet fra Ontario Research Fund P.L. Y.J. støttes av en MSc til PhD overføring stipend fra dekan ved Schulich School of M edicine og odontologi på The University of Western Ontario. S.D.G. støttes av PhD stipend fra ALS Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
