Summary
Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.
Abstract
Protein yerelleştirme ve canlı hücre Imaging'i kullanma kaçakçılığı soruşturma için araştırmacılar çoğunlukla onların protein flüoresan muhabir ilgi eritme üzerinde kullanır. Floresan füzyon tasarım için geldiğinde genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (FPs) sürekli gelişen listesi kullanıcılar ile çeşitli alternatifler sunar. Her FP elde edilen floresan füzyon biyokimyasal, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini etkileyen belirli optik ve biyofiziksel özellikler vardır. Örneğin, birkaç FPs füzyon ortağının işlevini üzerinde engel duyarlı nonspesifik reaksiyonlar formu eğilimindedir. Ne yazık ki, sadece birkaç yöntem FPs etkisi floresan muhabir davranışını sınamak için mevcut. Burada, polyglutamine (polyQ) toksisite deneyleri tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaekullanarak FPs etkisinin hızlı değerlendirme sağlar basit bir yöntem açıklanmaktadır. Huntingtin PolyQ-genişletilmiş proteinler nerede toksik reaksiyonlar ve dahil organları genişletilmiş huntingtin toplayan Huntington hastalığı (HD), başlangıcı ile ilişkilidir. Toplama ve Maya polyQ açılımları toksisite yüksek floresan Etiketler, böylece FPs davranışı üzerindeki etkisini incelemek için ideal bir deneysel platform sunan varlığı da dahil olmak üzere polyQ bölge kanat dizileri bağlı onların Füzyon ortağı.
Introduction
Aequorea victoria1, genetik olarak kodlanmış FPs geniş bir palet yeşil flüoresan protein (GFP) ilk karakterizasyonu geliştirilen beri hücre biyologları aynı anda yerelleştirilmesine ve izlemek birden çok izin verme hücresel olaylar/proteinler yaşayan hücreleri2,3. FPs denizanası mercan ve bu sayede, görüntü belirli biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde onların anılan sıraya göre floresan spektrum aktarma üzerinden birden çok organizmalar den türemiş. Bu özellikler parlaklık, photostability ve diğerleri arasında2,4oligomerize eğilimi içerir. Monomeric FPs seçmek uygun bir etiket seçiminde önemli bir yönü floresan muhabir uygunsuz etkileşimleri ve füzyon ortağının işlev değişiklikleri en aza indirmek ve muhabir verimliliği en üst düzeye çıkarmak için tasarlarken olur bir hücresel yuvası4,5,6verilen. GFP kez, Füzyon ortağı5,7,8' e, floresan etiket ekleme etkisini en aza indirmek için değişmiştir iken yeni FP türevleri ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek nasıl GFP değerlendirmek zor kalır.
FPs davranışını tanımlamak için birkaç yöntem vardır. Bunların çoğu FPS ultrasantrifüj gibi biyokimyasal yaklaşımları kullanarak biyofiziksel özellikleri test içerir ve filtrasyon protokolleri9,10,11,12jel. Böyle yöntemlerinin davranışlarını olduğu gibi hücrelerde küçük içgörü sunan çözümünde, saflaştırılmış FPs kullanımının bilmeniz gereken vardır. Organize Pürüzsüz endoplazmik retikulum (OSER) tahlil teklifler gelişimi FPs eğilim'da yaşayan oligomerize ölçülebilir bir değerlendirme13 overexpressed FPs endoplazmik retikulum tübüllerin içine yeniden düzenleme yeteneğini test ederek hücreleri OSER gözlemleyebileceğiniz14. Bu tekniği başarıyla GFP monomeric ve oligomeric türevleri ve diğer FPs arasındaki değişiklikleri algılayabilir. Ancak, bu çoğunlukla overexpression geçici transfected hücrelerdeki erişimine ve teknik bir otomatik veri toplama ve analiz iş akışı olarak kabul edilen sürece Nefelometri ve görüntü analizi zaman alıcı olabilir.
Sipariş bu yaklaşımlar tamamlamak için Maya15,16' floresan etiketleri toksisite etkisi ve polyQ açılımları agregasyon yararlanır bir tahlil kurduk. PolyQ streç fazla 36 ile genişleme huntingtin protein (Htt) Huntington hastalığı17,18ile ilişkili gen kodlama ilk exon içinde yineler. Genişletilmiş Httex1 Maya sonucu ciddi büyüme kusur birleştiğinde misfolded Htt protein güçlü bir toplama ifadesi. İlginçtir, bu fenotipleri şiddetle FPs15,16dahil olmak üzere polyQ germek kanat dizileri tarafından etkilenmiştir. FPs farklı özelliklerini differentially Maya polyQ toksisite etkileyebilir rasyonalize. Nitekim, GFP benzeri FPs için karşılaştırıldığında, kırmızı floresan proteinler ve gelişmiş formlarını bir azaltılmış toksisite ve toplama16göstermiştir. Bu el yazması FPs yeni nesil polyQ toksisite ve Maya toplamada etkisini değerlendirmek için detaylı bir protokol sağlar. Bu tahlil ile paralel olarak daha önce karakterize kullanılabilir FP türevleri hızlı ve potansiyel olarak yüksek içeriği analiz için nasıl GFP ile karşılaştırıldığında performans teknikleri yeni FPs ve -ebilmek en uygun karakterizasyonu için değerlendirmek sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nesil yeni Fluorescently öğesini Httex1 Maya bir ifadede muhabirleri
Not: Bu bölüm iletişim kuralından Jiang vd tarafından değiştirildi. 16 ve Albakri vd. 19.
- Floresan protein veya ilgi PCR tarafından kodlama sırası yükseltmek için astar tasarım. İleri astar Restriksiyon enzimi SpeI kısıtlama sitesi (ACTAGT) ve (ATG hariç) ATG floresan protein gen ilgi 20 üsleri akıntı yönünde takip sırasında sindirim (GATC), yardımcı olmak için bir lider sıra içermelidir. Ters astar lideri sıra (GATC), ardından bir SalI kısıtlama site (GTCGAC) ve 20 üsleri akıntıya karşı kodonu (durdurmak da dahil olmak üzere) FP sırasının ters tamamlayıcı içermelidir.
- Adım 1.1, tasarlanmış primerler kullanılarak gerçekleştirmek aşağıdaki ayarlara sahip bir thermocycler kullanarak PCR reaksiyon: ısı ile 95 ° C için 1 dk ve 95 ° C'de çevriminde 30 s, 30 60 ° C s ve PCR ürünü kB başına 2 dk 72 ° C. 18 devir yapmak yeterli.
- PCR reaksiyon bir özel jel (%0,5 Tris-asetat-EDTA içinde) çalıştırın. Beklenen ürün boyutuna karşılık gelen tek bir bant gerekir. Bir jel arıtma kit kullanarak parçası yalıtmak.
- Protokol 25 (nontoxic) taşıyan bir Httex1 vektörü kullanır ve 72 (HD-ilişkili, güçlü bir toplama görüntüleme) polyQ tekrar eder. PCR parçaları ve 37 ° C'de 3 h için SpeI ve SalI enzimleri ile vektör sindirmek
- Sindirilir vektör adım 1.3 olduğu gibi bir özel jel üzerinde çalıştırarak arındırmak.
- PCR arıtma kiti kullanılarak sindirilir PCR parçası arındırmak.
- Elde edilen sindirilir PCR parçası ligate ve p415 -GAL1-bayrak-25/72QpolyQ plazmid1 kullanarak T4 ligaz (Oda sıcaklığında 1 h). 10 µL reaksiyon (1 µL T4 enzim, 10 X arabelleği 1 µL, 6 µL PCR parçasının ve vektör 2 µL) kullanın.
- 50 µL içine tüp ligasyonu tepki Escherichiacoli 2 µL dönüşümü-yetkili hücreleri ve onları 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Sonra ısı-30 42 ° C'de hücreler Ekle SOC sonucu kitle 1 mL s. ve 1s bir shaker için 37 ° C'de kuluçkaya şok. Reaksiyon 100 µg/mL ampisilin içeren bir LB-agar plaka üzerinde 200 µL plaka. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya.
- Üç bireysel bakteri kolonileri seçin, onları gecede 3 ml LB-suyu bir shaker 37 ° C'de 100 µg/mL ampisilin içeren büyümek ve plazmid DNA bir plazmid arıtma kit kullanarak ayıklayın.
- Plazmid 500 sindirerek tarafından kontrol için 1 h 37 ° C ve bir özel jel (%0,5 Tris-asetat-EDTA içinde) tepki kaçak olarak SpeI ve SalI enzimleri kullanılarak DNA'ın ng. Vektör (~ 7 kb) ve INSERT doğru boyutları iki grup olmalıdır (boyutu faiz gen göre değişir). Ardından, plazmid tarafından sıralama doğrulayın.
- P415 -GAL1-bayrak- polyQ-FP plazmid standart Maya dönüştürme Protokolü2takip Maya zorlanma W303 içine dönüşümü.
2. tahlil lekelenme
- Çizgi Maya taşıma 25Q/72Q FP ile glikoz karbon kaynağı olarak Maya seçim ortamı (sentetik tamamlamak-SC lösin olmadan) içeren bir agar plaka üzerinde ilgi tagged klonlar. Aynı zamanda, aynı zamanda olumlu bir denetim olarak hizmet etmek için 25Q/72Q-ymsfGFP çizgi.
Not: floresan bir etiket içermeyen 25Q/72Q yapıları toksik değildir ve negatif kontrol hizmet verebilir. - 2-3 d için 30 ° C'de plakaları kuluçkaya.
- En çok üç tek kolonileri plaka seçin.
- 5 mL karbon kaynağı olarak % 2 glikoz ile takıma SC de aşılamak.
- Her gece kültür 200 µL cips ve yıkayın 3 x ile steril distile su.
- SC medya polyQ füzyon ifade ikna etmek için karbon kaynağı olarak % 2 galaktoz içeren hücrelerde resuspend. Bir tüp rotator içinde 30 ° C'de medya gecede galaktoz kuluçkaya. Bir denetim olarak glikoz içeren medyayı kullanarak bu adımı yineleyin.
- Ertesi sabah, hücre yoğunluğu 600 optik yoğunluk için eşitlemek nm 0,2 100 µL SC medya steril bir 96-şey plaka (OD600).
- Dört hazırlamak her örnek önceki örneğinin pipetting 20 µL tarafından steril su ile beş kat dilutions de içine sonraki şey medya 80 µL.
- Araç sabitleme bir Maya hücreleri (glikoz veya galaktoz içeren) seçmeli plakalar üzerine spot ve 2 d için 30 ° C'de kuluçkaya kullanın.
- Tabakları bir görüntü belgelerine aygıtla görüntü.
3. hücre büyümesini sıvı kültüründe miktar
- Hücre kültürleri, aşağıdaki adımları 2.1-2,5 Bu protokol hazırlayın.
- Bir spektrofotometre kullanarak OD600 ölçmek.
- OD600 0.1 300 µL medya bir 96-şey plaka itibaren hücrelere sulandırmak.
- Her örnek nüsha çalıştırın.
- Bir plaka okuyucu/kuluçka sallama yetenekleri ile plaka kuluçkaya. Kümesi örnekleri, 30 ° C sıcaklıkta, absorbans sayısı 600 nm, süresi 24 h deneyler ve ölçüm aralıkları 15 dk ve sürekli sallayarak modunu seçin.
- Büyüme eğrileri oluşturma ve bilimsel grafik yazılımı kullanarak eğri altındaki alan ölçmek. GraphPad prizma 7 tavsiye edilir. Verileri üç çoğaltma değerleri olan bir XY tabloya yapıştırın. Büyüme eğrisi sol tarafındaki grafikler klasörünün altında görünür. Eğri altındaki alan ölçmek için sol üst kısmında analiz seçin ve eğri altındaki alan XYanalizlerde tıklatın.
4. Floresan Mikroskobu
- Hücre kültürleri, aşağıdaki adımları 2.1-2,5 Bu protokol hazırlayın.
- Seyreltik hücreleri 10 x 8-şey görüntüleme chambers için her örneğinin büyüme medya ve transfer 200 µL.
- Oda sıcaklığında 63 X Aprochromoat planı amaç (1.4 NA) ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak hücreleri görüntü.
Not: Confocal mikroskop kullanımı seçime bağlıdır. Standart geniş alanlı floresan mikroskop da istihdam edilebilir. - İğne deliği ve lazer güç en iyi resim alma için ayarlayın. 72Q toplamları diffüz 25Q sinyal çok daha parlak olduğundan, doygunluk floresan sinyal önlemek için farklı plazmid arasında farklı satın alma ayarı kullanmak için genellikle gereklidir.
- ImageJ20 veya başka bir görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri işlemek. Bu adımda, görüntü toplama el ile hesaplanabilir hücre yüzdesi isteniyorsa.
5. nokta leke
Not: Bu protokol için nokta leke protein ifade düzeyleri incelemek için kullanılır. Hücre kültürleri, aşağıdaki adımları 2.1-2,5 Bu protokol hazırlayın.
- Protein lysates lizis arabellek (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA; %5 gliserol, 1 mM dithiothreitol [DTT]) cam küreciği kullanarak oluşturun. Proteaz inhibitörleri, 4 mM phenylmethylsulfonyl florür (PSMF) ve proteaz inhibitörü doğrudan kullanmadan önce kokteyl ekleyin. 5 mL gecede kültür de cips ve 200 µL cam boncuk ve 200 µL lizis arabelleği resuspend. Girdap 30 s 12 tur için. 12.000 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant toplamak.
- Toplam proteinler eşit miktarda mikrofiltrasyon cihazları kullanarak nitroselüloz membran üzerinde spot. Membran PBS ile prewet ve aparatı monte. Bir vakum kaynağına bağlanmak ve vidalar sıkılır emin olun. Vakum üzerine çevirmek ve membran örnek filtreden tarafından yerçekimi.
- PBS - %0,05 Tween/5% yağsız süt membran engelleyin.
- Membran ile birincil Anti-bayrak antikor gecede 4 ° C'de kuluçkaya Monoklonal Anti-bayrak M1 önerilir.
- Membran 3 yıkama x PSB - %0,05 ara ile her 10 min için.
- Membran ile bir fluorescently etiketli ikincil antikoru (Anti-fare IgG) PBS - %0,05 Tween/5% yağsız süt içinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Membran 3 x 10 min PSB - %0,05 ara ile yıkayın.
- Resim-leke immunoblot dokümantasyon sistemi kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Füzyon eşleri floresan gazetecilere bağlamında davranışını etkileyen onların eğilimi oligomerize de dahil olmak üzere farklı biyofiziksel özellikleri, fPs var. Bu iletişim kuralı birden fazla FPs için toksik polyQ açılımları nerede erimiş basit bir yöntem açıklanır. PolyQ toksisite polyQ streç15kanat dizileri son derece bağımlı olduğundan, bu tahlil floresan polyQ füzyon gazetecilere (Şekil 1) hızlı ve doğrudan karşılaştırma sağlar. Bir HD ilişkili polyQ (25Q) bir negatif kontrol kullanılan ve önemli toksisite veya toplama15,16,21,22görüntülemez. 72Q güçlü büyüme inhibisyonu ve polyQ toplama dahil HD benzeri fenotipleri elde etmek için istihdam edilmektedir. Önemlisi, sıra kodlama Httex1 olmaması polyQ streç izler prolin zengin etki alanı istihdam. Prolin zengin etki huzurunda Httex1 Maya15dakika içinde zehirli değil. Bu tahlil, bir Maya için optimize edilmiş monomeric türevi superfolder GFP12 (ymsfGFP)16 erimiş bir Httex1 yukarıda açıklanan16olarak pozitif kontrol olarak kullanılır. Yapıları da N-terminus Httex1, bir bayrak epitope etiketi içerir. Bu biyokimyasal analiz için aynı antikoru (Anti-bayrak) ile farklı füzyon olarak algılanmasını sağlar. Bir kanıtı-of-ilke olarak, 72Q Httex1 erimiş Maya için optimize edilmiş TagBFP2 (yomTagBFP2)23 tam yol gösteren iki nokta deneyleri agar plakaları veya sıvı medya (resim 2), büyüme tarafından ölçülen yavaş büyüme doğa Floresan etiket-in gerçekten polyQ genişleme davranış hücrelerdeki engelleyebilir.
Floresan polyQ füzyon agregasyon floresan mikroskopisi kullanılarak değerlendirilebilir. 72Q-ymsfGFP 25Q için karşılaştırıldığında önemli toplama görüntüler. Ancak, 72-yomTagBFP floresan sinyal sitoplazma (Şekil 3) dağınık kalır. Olguların çoğunda, bu aynı görüntü alma ayarlarını kullanmak için tavsiye edilmez (lazer gücü, pozlama süresi) 25Q ve 72Q görüntüleri. 72Q ifade hücreleri toplamları kadar dağınık 25Q sinyal parlak görünürler. Bu nedenle, 72Q görüntüleri elde etmek için kullanılan görüntüleme koşullarında dağınık 25Q sinyal çok zayıf görünür olup olmadığı hiç görünür değil. Uygun satın alma ayarlarını görüntüleme sırasında doygunluk 72Q ifade hücre en aza indirmek için aynı zamanda uygulanmalıdır.
Çeşitli polyQ füzyon ifade düzeyde toksisite etkileyebilir. PolyQ toplayan gibi deterjan çözünmez amyloids biyokimyasal olarak çalışmaya Rootkitler zor ve var SDS-sayfa göre yapılan analiz için uygun değildir. Bu nedenle, nokta lekeleri protein düzeyleri değerlendirmek için gerçekleştirilir. Httex1 amino terminus sonunda bayrak etiketi eklenmesi floresan füzyon tespiti aynı anda, kare/sn (Şekil 4) varlığı rağmen sağlar. Alternatif olarak, yarı denaturing deterjan özel jel elektroforez (SDD-yaş) polyQ reaksiyonlar16oluşumu değerlendirmek için gerçekleştirilir. Detaylı iletişim kuralı ve video Halfmann ve Lindquist24içinde kullanılabilir.
Şekil 1: iş akışı diyagramı floresan protein etiketi toplama üzerinde etkisi ve toksisite Maya olarak polyQ genişleme proteinlerin analizi için. İlk olarak, FPs Maya ifade vektörel çizimler ya 25Q yataklık bayrak öğesini Httex1 galaktoz-indüklenebilir bir sürümünü kodlama klonlanmış (nontoxic) veya 72Q (HD ilişkili, toplayarak ve toksik) tekrarlar. Klonlar seçilir ve sıralama tarafından doğrulanmadı ve, daha sonra Maya dönüştürdü. Kuluçka galaktoz içeren medya, agar plakaları edindiği deneyleri ya da büyüme sıvı medya tarafından polyQ füzyon ifade indüksiyon takip polyQ toksisite değerlendirebilirsiniz. PolyQ toplama tarafından floresan mikroskopi analiz edilir. Farklı yapıları, göreli bir ifade kullanarak nokta leke değerlendirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Httex1 floresan füzyon Maya içinde ifade aşağıdaki temsilcisi büyüme tahlil sonuçları. Ya 25Q ya da 72Q Httex1 ifade Maya erimiş ymsfGFP için veya yomTagBFP glikoz (kontrol) kültürlü veya galaktoz medya (polyQ kaynaklı) bir gecede ve ağar kaplamalar veya (B) her iki (A) benekli daha fazla sıvı içinde inkübe Medya büyüme farklı koşullar altında değerlendirmek için. 72Q-ymsfGFP önemli bir büyüme kusur neden olmaktadır, 72Q-yomTagBFP bir büyüme fenotip nontoxic 25Q karşıtları benzer görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Temsilcisi floresan görüntülerini Httex1 floresan füzyon Maya içinde. Ya 25Q ya da 72Q Httex1 ifade Maya erimiş için ymsfGFP veya yomTagBFP glikoz (kontrol) kültürlü veya galaktoz medya (polyQ kaynaklı) bir gecede ve confocal mikroskop görüntüsü. 72Q-ymsfGFP ifadesi bir güçlü polyQ protein toplamada sonuçlar, 72Q-yomTagBFP dağınık sitoplazmik sinyal nontoxic 25Q karşıtları benzer görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Temsilcisi nokta leke Httex1 floresan füzyon Maya ifadede analizi. İfade 25Q, 46Q, 72Q veya 103Q Httex1 erimiş CFP için Maya galaktoz (polyQ kaynaklı) medya gecede kültürlü ve dot blot analizi için işlenir. Hücre lysates beş kat dilutions gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, toplama Httex1 polyQ açılımları ve Maya büyüme üzerindeki etkileri ölçmek için çeşitli deneyleri, bir model olarak ne kadar farklı floresan çalışmaya istihdam edildi proteinler alter füzyon eşleri floresan gazetecilere bağlamında . GFP değişken (ymsfGFP) olumlu bir denetimi kullanarak, biz bu polyQ toksisite ve toplama farklı floresan etiketleri arasındaki önemli değişiklikleri algılar ve polyQ-FP füzyon performans karşı doğrudan ve hızlı karşılaştırması için sağlar gösterdi GFP öğesini yapıları16,19.
Mevcut Protokolü floresan proteinler üzerinde duruluyor, çeşitli yerlerinde Protokolü'nün diğer protein Etiketler etkilerini test etmek için kolayca adapte olabilir. Buna ek olarak, mevcut Protokolü kopya numaraları (genellikle bir veya iki kopya) hücreleri25içinde mevcut açısından değişebilir düşük-kopya Maya centromeric vektörler istihdam etmektedir. Bütünleştirici vektörel çizimler arasında deneysel koşullar tek tip bir ifade kullanarak bu sorunu aşmak. Bu iletişim kuralı W303 arka planda kullanım için optimize edilmiş iken, diğer S. cerevisiae suşları istihdam edilebilir. Ancak, polyQ toksisite duyarlılık yeni yapıları tasarlama önce ymsfGFP öğesini vektörel çizimler kullanarak tespit edilmelidir. Belirli durumlarda, bir önemli bir büyüme kusur oluşturmak için vektör yüksek-Kopyala (2µ) istihdam uygun olabilir. Aynı zamanda birden fazla yalıtır spontan bastırıcılarının azaltılmış polyQ toksisite gösterilen seçmekten kaçının için polyQ vektörler ile Maya dönüştürme aşağıdaki test etmek için önerilmektedir. Dikkat, daha polyQ toksisite için BY4741/BY474227, diğer S288C türevleri daha duyarlı olduğu gibi Maya zorlanma26 genellikle kullanılan W303, böylece büyüme fenotipleri daha geniş bir aralığı için izin. Önemlisi, bu tahlil için istihdam suşları rnq1Δ hücre polyQ toksisite ve toplama28görüntüleme beri Rnq1 prion protein taşımak gerekir. Amino-terminal bayrak etiketi taşıyan ve prolin zengin etki alanı eksik Httex1 yapıları kullanmak önemlidir. Füzyon tasarım diğer varyasyonları toksik fenotipleri15değiştirebilir. Son olarak, galaktoz içeren polyQ füzyon ifadede indüksiyon medya iletişim kuralı21kritik bir adımdır. Hücreleri glikoz ve galaktoz içeren medya aktarırken, bu hücreleri Gal1 organizatörü29indüksiyon bastırmak için katkıda bulunabileceğini glikoz tüm izlerini ortadan kaldırmak için en az üç kez steril su ile yıkamak önemlidir. Edindiği deneyleri yapılırken, Füzyon ifade ikna etmek için gecede galaktoz medya hücrelerde kültür 72Q füzyon toksik fenotip azdırmak ve büyüme değişimler farklı füzyon16arasında ayırımcılık yardım.
Bir sınırlama önceki çalışmalarda CFP (GFP türevi) nonmonomeric sürümü ve ymsfGFP16arasında fark etkileri gözlemleme. Böylece, en azından GFP türevleri için bu tahlil monomeric ve oligomeric türevleri arasında ayırımcılık için duyarlı olmayabilir, polyQ tamamlayıcı gerektiğini vurgulayarak toksisite OSER tahlil13 gibi diğer standart yöntemlerle deneyleri ve doğrudan Oligomerizasyonda değerlendirebilir biyokimyasal analiz9,10,11,12 . Ayrıca, vitro deneyleri veya diğer organizmaların23yılında onların ifade göre Maya içinde FPs farklı davranır unutulmamalıdır.
Toplu olarak, bu yöntemleri araştırmacılar hızla yeni FPs karakterize ve onların füzyon ortak üzerindeki etkileri ölçmek için izin vermek. Gelecekte, bu iletişim kuralı hala FP gazeteciler için altın standart ölçü vardır GFP türevleri için benzer şekilde davranır mutantlar tanımlamak için önceden karakterize FPs yeni türevlerini hızlı tarama sağlayacaktır. Bu iletişim kuralı floresan proteinler üzerinde duruluyor olsa da, kolayca ekrana ek-etiket30 ve SunTag31gibi diğer genetik olarak kodlanmış Etiketler etkileri için adapte edilebilir.
Sonuç olarak, daha fazla FPs ve diğer genetik olarak kodlanmış Etiketler füzyon protein tasarım araştırma rehberlik için yeni nesil karakterizasyonu etkinleştirmek için hızlı ve kolayca ölçeklenebilir bir tahlil bu iletişim kuralı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada sağlık araştırma M.L.D. ve P.L. Kanada Enstitüleri çalışma bir hibe tarafından desteklenmektedir Burada sunulan iş John R. Evans lideri Fonu Ödülü yenilik için Kanada Vakfı tarafından desteklenen ve P.L. yj Ontario araştırma fonundan eşleşen bir fon tarafından bir MSc M Schulich okul Dekanı doktora transfer burs için desteklenir son sürümü ve diş hekimliği, University of Western Ontario'dan. S.D.G. ALS Kanada'dan bir Doktora Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
