Summary
Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.
Abstract
VIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de "choque y muerte" se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.
Introduction
A pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5' promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir la producción de virus in vitro y en vivo de latente infectados descanso CD4 + T células4,5,6,7 ,8. Entre las LRAs probado, HDACi (inhibidores de la HDAC) y apuesta bromodominios inhibidores (BETis) inducen la decondensation de la cromatina y la liberación de la transcripción positivo alargamiento factor b (P-TEFb) respectivamente, dando lugar a posteriores aliviar de la transcripcional represión en el LTR 5' y la activación del VIH expresión9,10,11,12,13. Sin embargo, la magnitud de reactivación alcanzada por estos LRAs fue limitada como sólo un modesto aumento en células asociadas unspliced VIH mRNA (RNA), indicativo de la transcripción viral, observó ex vivo14,15. Importante, estos LRAs también no pudieron inducir una reducción en la frecuencia de las células infectadas latente.
Expresión de VIH puede ser más restringido por empalme ineficiente16 así como defectos en la exportación nuclear de multiplicar empalmado HIV RNA (RNA MS)17. Así, se necesitan identificables nuevas clases de LRAs que son más potentes y pueden afectar distintos aspectos de la integración después de la producción de virus. Además, se requiere el desarrollo de nuevos ensayos que ayudan a definir los compuestos óptimos para invertir eficientemente latencia.
Aquí, se presenta un protocolo, que utiliza un enfoque de alto rendimiento para la evaluación funcional del impacto de intervenciones basadas en LTR del VIH transcripción y splicing. En Resumen, un nuevo dual basada en LTR color reportero sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figura 1) se utiliza para evaluar reactivación de VIH mediante citometría de flujo. En este reportero fluorescente, la expresión de mRNA de VIH unspliced (4 kb) conduce a la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), mientras que la expresión de mRNA empalmado (2 kb) daría lugar a la expresión de la proteína fluorescente Discosoma SP rojo (DsRed). Brevemente, hemos utilizado una proteína fluorescente de fusión Env-EGFP, gp140unc. EGFP, donde la secuencia de codificación de EGFP fue colocada en el marco de forma truncada y no hendida de la envoltura (Env). Cambios fueron introducidos para ablar del sitio de la hendidura evitando la disociación de la Env gp120 y gp41-EGFP y truncar la proteína gp160 antes el dominio de la transmembrana creando un análogo soluble de la Env, que facilita el plegamiento correcto y expresión de EGFP. A la expresión dentro de una célula, Rev se localiza en el núcleo donde interviene en la exportación nuclear-citoplásmico de la env de 4 kb mRNA mediante la interacción con el elemento de respuesta rev (RRE). El truncamiento de la Env no comprometiera RRE, que se encuentra entre gp120 y gp41 y el A7 3' sitio del empalme. En este sistema, que empalma en el VIH-1 empalme donante 4 (SD4) y el empalme aceptador 7 (SA7) resultados en la producción de 2 kb mRNA que codifican una proteína Rev no funcional truncada en el aminoácido 38 unida a proteína fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed fue insertado en el exón 2nd de Rev en el aminoácido 38 por superposición extensión18. Para facilitar la exportación nuclear de mRNA unspliced, un vector de expresión mamífero codificación Rev (pCMV-RevNL4.3) fue co transfectado con el constructo de reportero fluorescente (figura 2). Esta construcción única reportera aquí descrita es útil en la evaluación de alto rendimiento de la transcripción del VIH y empalme, sin necesidad de usar vectores virales.
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Protocol
Nota: Procedimientos de clonación, transformación y la secuencia son discutidas en otra parte18,19. Los protocolos aquí a partir de la transfección de los vectores de expresión mamíferos (figura 3).
1. construcción de transfección de células HEK293T con la reportera de Color Dual
- Cultivar células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Después de descongelar, los experimentos de células HEK293T de paso 2 - 3 veces antes de usarlos en la transfección. Esto le daría el tiempo de las células para recuperarse del procedimiento de descongelación.
PRECAUCIÓN: Contaminación por micoplasma de cultivos celulares sigue siendo un grave problema. Buenas prácticas de laboratorio y la prueba rutinaria de cultivos celulares son esenciales para disminuir el riesgo de contaminación por micoplasma y evitar difusión20. - Dividir las celdas 1:2 un día antes de sembrar y transferirlas en medio DMEM fresco. Cultivar las células durante 24 h en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
- El día antes de la transfección, quitarlo del medio del frasco de aspiración y lavar las células con tampón fosfato (DPBS) solución salina de Dulbecco libre de calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg2 +) para eliminar los restos de suero.
- Dispensar 5 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) en el recipiente de la cultura y colocar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 2 a 5 min.
- Cuando las células son separadas, añadir 5 mL de DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS para inhibir aún más la actividad de tripsina, que puede dañar las células.
- Resuspender suavemente transfiriendo la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.
- Diluir las células 1:10 en tinción de azul de tripán (0.4%).
- Contar las células vivas que no toman trypan azules usando un microscopio (objetivo de 10 x) y una hematimetría.
- Calcular el número de células viables por mililitro tomando el promedio de lo recuento de células y multiplicando por 10.000 y por el factor de dilución (1:10) desde el trypan blue stain.
- Placa de 2 x 104 células en 100 μL de medio DMEM suplementado con 10% de SBF sin antibióticos en una placa de 96 pozos de fondo plano para 24 h.
- Para cada bien, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 y 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera ADN en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente. Para los experimentos sin Tat, use un vacío emparejado Tat vector pcDNA3.1 (-).
Nota: Se recomienda el uso de ADN libre de endotoxinas. Por eso, preparar ADN libre de endotoxina mediante un kit de purificación de ácidos nucleicos midi o maxiprep. Determine la pureza de ADN midiendo la relación 260/280 de OD, que debe estar entre 1.7 y 1.9. - Mezclar el reactivo de lípidos antes de su uso, luego diluir 0.65 μL en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Combinar el ADN diluido con el reactivo de lípidos diluidos.
- Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. La solución puede aparecer turbia.
Nota: Proceda al paso 1.15. dentro de 30 minutos. - Dispensar 100 μL por pocillo de los complejos de ADN reactivo lipídico mediante goteo sobre las células.
- Mezclar suavemente, meciendo la placa hacia adelante y hacia atrás.
-
Incube la placa durante 5 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.
- Cada mezcla de reacción es suficiente para la transfección de un solo bien (96 pocillos). Ajustar la cantidad y volumen de los componentes según el número de fármacos y la combinación que sería probado y cuentas para variaciones de pipeteo. Todas las condiciones se prueban generalmente en triplicado.
- Transfectar pozos adicionales con 100 ng de plásmido EGFP y DsRed-Express ADN CMV-conducido por compensación.
2. tratamiento de HEK293T Transfected las células con latencia agentes de inversión
Nota: Antes de cada ensayo, determinar la condición fisiológica de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a dosis altas y bajas de la droga en ensayo de proliferación celular.
- Diluir cada ERS la concentración adecuada de trabajo con medio de cultivo (por ejemplo,, 1 μM para JQ1(+)).
PRECAUCIÓN: Reconstituir los fármacos liofilizados con el solvente apropiado a una concentración de 10 mM. Guarde todo stock LRAs a-80 ° C en una alícuota de solo uso (5 μ) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. - Cuidadosamente aspirar el medio de transfección con un multicanal y reemplace por 100 medio μL conteniendo ERS apropiado (tabla 1). Añadir medio muy suavemente junto a la pared del pozo para evitar el desprendimiento de las células HEK293T transfected, que desprenda fácilmente de la superficie de la placa de cultivo.
- Incube la placa durante 48 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.
3. tinción de células Transfected con el tinte de viabilidad pueden corregir para el análisis de citometría de flujo
PRECAUCIÓN: Eliminación de desechos y células muertas es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad.
- Separar las células en los medios de comunicación con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pozo y transfiriendo suavemente hacia arriba y abajo (~ 5 veces) con un multicanal, evitando la formación de espuma de los medios de comunicación. Si es necesario, separar las células de la placa utilizando 35 μl por pocillo de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar con medio que contiene el suero.
- Transferir las células a una placa de 96 pocillos fondo V.
- Girar las células durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C, y luego aspirar con cuidado el medio/PBS sin tocar las células.
- Lavar las células al menos 1 vez con 200 μL de PBS libre de suero, proteína.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante inclinando la placa y retirando el tampón de lavado sin tocar las células.
- Preparar una solución de trabajo de viabilidad pueden corregir tinte diluyendo la viabilidad tinte 1: 1000 en PBS libre de suero, proteína. Preparar 50 μl de la mancha diluida por pozo.
Nota: Tintes de viabilidad están disponibles en una gama de colores adecuadas para el uso con láser azul, rojo y violeta. Preparar una solución stock de viabilidad pueden corregir tinte resuspender un frasco de la tintura liofilizada (componente A) con 50 μL de DMSO anhidro (componente B). Conservar a-20 ° C en un solo uso alícuota (1 μL cada), protegido de la luz. - Añadir 50 μL de colorante diluido viabilidad a cada pozo y mezclar las células pipeteando arriba y abajo con un multicanal.
- Tinción para 10-15 min a 4 ° C, protegido de la luz.
- Lavar 1 - 2 veces con 150 μL de tampón de lavado (PBS con 1% bovinos albúmina sérica y 2 mM EDTA).
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Fijar las células con 100 μL de formaldehído al 1% recién preparado en tampón de lavado durante 10-15 min a 4 ° C en la oscuridad.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es muy tóxico. Preparar la solución de formaldehído 1% en una campana de humos para evitar la inhalación mientras que usa guantes y gafas de seguridad para la protección. - Lavar las células 1 - 2 veces con 100 μL de tampón de lavado.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 70 μL de tampón de lavado.
Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Células fijas podrían ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad para el análisis al día siguiente en el citómetro de flujo.
4. EGFP y mediciones DsRed por citometría de flujo y análisis de datos
Nota: Analizar la transcripción del VIH (% EGFP) y empalme (% DsRed) en un citómetro de flujo. Filtrar la muestra antes de la carrera con un celular-filtro 70 μm o 100 μm de malla de nylon para evitar la obstrucción de la boquilla.
- Poner en marcha el citómetro y la computadora por lo menos 10 minutos antes para calentar los láseres.
- Antes de correr las muestras y comenzar la adquisición de datos, llenar el depósito de la vaina con solución salina 0.9% y aseguran que una pastilla de hipoclorito de sodio se agrega al tanque de residuos.
- Compruebe la célula de flujo para las burbujas de aire.
- Verificar que los detectores y los filtros son adecuados para el experimento.
Nota: Para EGFP, uso del láser azul (488 nm) y 530/30 paso de banda, mientras que DsRed Express óptimo se detecta usando el laser amarillo (561 nm) y paso de banda de 610/20. Un láser azul (488 nm) y paso 610/20 también puede ser utilizado para detectar DsRed expresión. - Comprobar el funcionamiento del citómetro y sensibilidad a través de detectores ejecutando el cuentas de calibración.
- Ajustar el avance (FSC-A) y voltajes de scatter (SSC-A) de lado con mancha muestra que la población principal es en la pantalla y claramente discernible.
Nota: FSC (luz dispersada hacia delante) es una medida de la luz difracción en un ángulo plano, que depende del volumen de la célula (célula superficie o tamaño), mientras que SSC (lado dispersada luz) es una medida de la difracción de la luz en un ángulo recto, que es proporcional a granularidad de la célula y complejidad interna. - Realizar compensación manual o automática mediante las muestras teñidas solo asegurar mínimo contagio de EGFP + población en el detector DsRed y viceversa.
PRECAUCIÓN: Por compensación, utilice una muestra de las células que expresan cada una de la proteína fluorescente de color único como células teñidas con el tinte de viabilidad pueden corregir individualmente. No utilice cuentas de compensación FITC y PE para compensaciones de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed debido a diferentes características espectrales. Controles de compensación deben ser lo suficientemente brillantes para resolver positiva y negativa de la población. - Crear parcelas y fijar las puertas usando la fluorescencia menos uno controla (FMO).
- Adquirir y registrar un mínimo de 10.000 eventos de células viables por muestra. Ejecutar ejemplos a velocidad media o baja para evitar dobletes pasando por la intercepción de láser. Utilizar pulso de compuerta geometría como SSC-A frente a SSC-H para eliminar dobletes. Comprobar la estabilidad del funcionamiento mediante el trazado de tiempo versus SSC-A ver cómo incluso el flujo es durante el funcionamiento.
- Al final de la carrera, limpiar los fluidos de citometría de flujo con detergentes concentrados y agua durante 5 minutos.
- Apagar el sistema, deseche la basura y volver a llenar el tanque de la vaina después de la adquisición.
- Analizar los datos utilizando un software de análisis de datos de citometría de flujo. Excluyen restos celulares y mata (dobletes) basado en la dispersión hacia delante y lateral, a continuación, eliminar las células muertas con la mancha de tinte de viabilidad (negativa población = células vivas). Identificar las células que expresan EGFP y DsRed (figura 4), así como el porcentaje de producto empalmado DsRed /(DsRed + EGFP) (figura 5).
- Determinar el efecto del LRA en la transcripción del VIH y empalmar mediante la comparación de las células no tratadas y las células expuestas al individuo o a una combinación de LRAs (figura 5).
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Representative Results
Resultados representativos se muestran en la figura 5 para la expresión del VIH-1 unspliced (EGFP) y empalma (DsRed) productos después del tratamiento con el inhibidor de bromodominios JQ1. JQ1(+) y Tat aumentaron significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP (FC 2.18 y 4,13 sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de unspliced transcripciones. Por otra parte, JQ1(+) aumentó significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed (46,6 FC sobre DMSO) así como la proporción de producto empalmado (7,37 FC sobre DMSO) a un nivel similar como Tat (59,6 y 5.83 FC sobre DMSO, respectivamente) lo que confirma la capacidad de JQ1(+) para activar la transcripción del VIH y empalme. Por otro lado, el tratamiento con el control del stereoisomer JQ1(-) suprime JQ1(+) efecto sobre la transcripción del VIH y empalme confirmando el éxito del protocolo.
En una publicación reciente, hemos demostrado por análisis de ARN, una acumulación de VIH empalmado las transcripciones siguientes JQ1(+) tratamiento21. De hecho, nuestros datos revelaron cambios constantes en los niveles de transcritos de unspliced y empalmados que se reflejaban la expresión de proteína EGFP y DsRed en este modelo después del tratamiento con JQ1(+). Estos resultados indican que EGFP y DsRed expresando las células reflejan la capacidad de inducir la transcripción del VIH y empalme bromodominios del inhibidor de la JQ1(+).
En Resumen, hemos validado el uso de la pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reportero en un montaje de alto rendimiento para la evaluación del efecto de LRAs en la transcripción del VIH-1 y empalme. Cantidad óptima de LRA o aumento de la toxicidad podría conducir a resultados de scud. Optimización de la cantidad de medicamento que se usa mientras que preserva la viabilidad de las células puede mejorar la exactitud de los resultados.
Figura 1: esquema del modelo utilizado para determinar los efectos de latencia de inversión de los agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme. El expresa de construcción LTR a que o proteína (Env) unspliced fusionada mayor proteína verde fluorescente (EGFP) o empalma de la proteína Δ38rev con DsRed. Esta figura ha sido reimpreso de Khoury et al21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: construye diseño. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed reportero empalme permite la expresión de fundido a la EGFP (gp140-EGFP) y no funcional de la proteína Rev envolvente truncado en el aminoácido 38 fusionado a la proteína fluorescente DsRed (RevΔ38-DsRed). (B) Rev pCMVNL4.3 permite la expresión de la proteína Rev. (C) pCMV Tat101AD8-permite la expresión de la proteína Tat101(AD8) con una etiqueta C-terminal de la bandera. La plásmidos de expresión están construida con traslapos PCR y digestión de restricción. Todos los vectores mapas fueron creados utilizando el software SnapGene , versión 4.1.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de diseño para la evaluación rápida de la latencia del VIH invertir agentes. El método actual para la evaluación del efecto de LRAs en la transcripción del VIH-1 y empalme incluye i) siembra de células HEK293T un día antes de la ii) transfección con vectores de expresiones seguidos por iii) ERS el tratamiento. IV) las células son analizadas por el flujo cytometry 48 h de post-treatment. Mediante este protocolo, 32 (por triplicado) a 96 condiciones podría probarse por placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: ejemplo de la configuración de la placa y controles necesarios. Columnas 1 a 3 corresponden a los controles negativos (-) con ninguna droga y el solvente solo (DMSO 1: 5000) así como controles positivo (+) tales como Tat (100 ng), PMA/PHA = forbol miristato acetato/fitohemaglutinina (10 nM PMA, 10 μg/mL de PHA), JQ1 (+-) (1 μM), VOR = (vorinostat 0,5 μM) y PAN = panobinostat (30 nM). LRAs desconocidos se analizan por triplicado en un rango de concentraciones (15.625 a 1000 nM). Por compensación, las células que expresan cada uno de la solo-color proteína fluorescente (EGFP + y DsRed +) así como de las células teñidas con el tinte de la viabilidad y células sin manchas están incluidas en cada serie. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura 4: estrategia que se utiliza en el análisis de citometría de flujo que bloquean. El primer paso en la estrategia bloquea se basa en la dispersión hacia delante y lateral, que permite la distinción de las células de interés basándose en las propiedades de tamaño y granularidad de estas células. Se recomienda que este control sea tan generoso como sea posible incluir todos los eventos, mientras que la eliminación de detritos celulares y células muertas, que se encuentran en la esquina inferior izquierda de la trama de la densidad. Luego eliminar dobletes del conjunto de datos con la geometría de pulso bloquea SSC-A frente a SSC-H y más estrecha en las células vivas utilizando el tinte de viabilidad. Por último, un canal de descarga (violeta) y EGFP o DsRed se utilizan para definir a las células de interés. El uso de fluorescencia menos uno controla (FMO) son críticos en la definición de la población de interés y abordar los problemas de contagio de otro fluorocromo en el canal de interés. Después de la adquisición, los datos se analizan usando software de análisis de datos de citometría de flujo. Esta figura ha sido reimpreso en forma adaptada Khoury et al21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: resultados representativos del efecto de inhibidores bromodominios en VIH transcripción y splicing. (A) ejemplos de dos parámetros doble color fluorescencia EGFP versus DsRed parcelas de densidad de las células untransfected (-Tat), las células transfected con 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera (+ Tat) y las células trataron con DMSO, JQ1 (+) o JQ1 (-). (B) la media de porcentaje (%) de las células que expresan EGFP, DsRed o producto empalmado (DsRed / DsRed + EGFP) aparece de 3 experimentos independientes. Se hicieron comparaciones de cada condición a DMSO utilizando la prueba ANOVA de 2 vías. Sólo se muestran las comparaciones estadísticamente significativas. p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001. Las líneas negras representan los ±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 (+) y JQ1(-) (1 μM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Dada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ' Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para modelar las condiciones fisiológicas de la latencia del VIH en la reclinación de las células T CD4 +, sistemas de doble fluorescente reportera sobrevinieron como el reportero RGH (rojo-verde-VIH) desarrollado por grupo de Ivan Sadowski con un marcador de basada en LTR Gag-eGFP y un mCherry impulsado por CMV en lugar de Nef23. Un similar virus reportero de color dual, Duo-Fluo, fue desarrollado por laboratorio E. Verdin con una expresión de EGFP impulsado por litro y un marcador fluorescente mCherry conducida por un promotor de EF1α24. En este sistema, la EGFP fue insertado en el extremo 3' de los provirus en lugar de Nef. La eliminación en la dotación en ambos sistemas previene múltiples rondas de infecciones. Por otra parte, la combinación de las dos proteínas fluorescentes permite la detección de manera productiva (eGFP mCherry +) y latente (eGFP - mCherry +) las células infectadas. Sin embargo, varias deficiencias de los virus de la reportera de color dual eran sensibles en células T CD4 + como la infección directa de las células infectadas latente es en gran parte dependiente en el estado de activación celular de los linfocitos T23,24. De hecho, observó muy baja tasa de infección con estos virus dos reportero en la reclinación de las células CD4 + T: 0.1% para RGH23 y 0.2% para el DuoFluo25. Además, como el CMV promotor se ha demostrado que se expresa en bajos niveles en células no activadas26,27,28, un CMV inactiva o promotor de EF1α daría lugar a la subestimación de la latente infectados poblaciones.
Hemos generado y caracterizado un nuevo vector reportero de VIH para estudiar el establecimiento de latencia y reactivación del virus en un ensayo de alto rendimiento. Ventajas de nuestro método de detección incluyen i) costo efectividad con la capacidad de evaluar la transcripción y splicing simultáneamente, ii) la capacidad de probar una gran cantidad de drogas o combinaciones en un solo experimento, iii) rápida evaluación de la efecto de LRAs por citometría de flujo (30-45 min típico tiempo de lectura para 96 placa bien independientemente del número de parámetros fluorescentes), iv) alto rango dinámico, v) conveniente para la transfección de alto rendimiento y citometría de flujo utilizando brazos de robot y plataforma HTS, automatizados de curado VI) rápida de los datos mediante una plantilla de área de trabajo de citometría de flujo, vii) óptima para la suspensión y las células adherentes, viii) la simplicidad del modelo y capacidad de adaptación a medidas de luminiscencia y placa lector (dual luciferasa de luciérnaga y Renilla) y ix) escalabilidad (formatos de pate de 96 y 384 pocillos).
La propensión de un LRA o una combinación de LRAs para activar la transcripción basada en el LTR del VIH y empalmar así expresión de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed podría ser examinada mediante citometría de flujo utilizando nuestro reportero que empalma del VIH. Sin embargo, antes de probar la sinergia de novela LRAs, es altamente recomendable para determinar las condiciones fisiológicas de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a una gama de concentraciones de la droga sola. Por lo tanto, es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad incluyendo un marcador de células vivas y muertas. Otro aspecto importante de análisis de citometría de flujo es los controles de compensación o FMO. Se recomienda utilizar muestras solo manchadas asegurando mínimo contagio de EGFP + población en la DsRed y viceversa. Además, es esencial a cuenta de la autofluorescencia de las células incluyendo las células sin manchas. Por último, un control regular del funcionamiento del citómetro y la sensibilidad a través de los detectores es fundamental sobre todo cuando mide las muestras para un estudio que abarca un largo período de tiempo.
Aunque no se discute en la sección de protocolo, hay varias limitaciones de nuestro sistema que empalma del reportero. Para una discusión más completa, por favor vea nuestra publicación anterior (Khoury et al., 2018). Exportación de la parcialmente o unspliced variantes del mRNA del VIH es facilitada por la proteína viral Rev y su asociación con elemento de respuesta Rev (RRE) en estos mRNA especie29,30,31,32. La sobreexpresión de Rev en nuestro sistema nos ha permitido sortear el mayor bloque de retención nuclear de multiply empalmado y mRNAs unspliced observado en latente infectados de células T17 y foco en la comprensión de cómo las LRAs inducen transcripción y splicing así la reactivación del virus. Además, dado que nuestro sistema requiere la transfección de 3 plásmidos, elegimos HEK293T células porque la eficiencia de transfección alta de estas células. Debido a la diferente disponibilidad temporal y espacial de factores celulares en células de T respecto a una línea celular de cáncer, es importante validar los resultados del empalme reportero adquirida en células HEK293T en líneas de células T y células primarias, que podría proporcionar gran problemas técnicos debido a su limitada transfectability. Por lo tanto, el uso de reactivos de entrega ADN alternativa para transfección como DMRIE-C, que se ha demostrado para ser particularmente eficaz para la transfección de células de suspensión (por ejemplo, Jurkat) o métodos nucleofection como Amaxa nucleofector o neón sistema de transfección que se han demostrado para facilitar la entrega eficiente y confiable de uno o varios plásmidos difícil para transfectar las células incluyendo primaria de células T CD4 +. Por otra parte, sería interesante probar este sistema de reportero en el contexto del virus de larga duración en un modelo de célula primaria de latencia mediante los métodos antes mencionados de la transfección. De hecho, las diferencias en la disponibilidad de host, alargamiento y transcripción factores en una celda de rCD4 + T de empalme pueden afectar la capacidad de una LRA para reactivar el provirus latente. Por último, nuestro modelo no responde a si puede afectar LRA transcripción y empalme de las células del espectador, y si puede inducir virus competentes de replicación. Sin embargo, sospechamos que al medir un aumento de células asociadas VIH U.S. y MS RNA, Esto conduciría a la producción de virus competentes de replicación en el sobrenadante de cultivo. Esto podía ser confirmado mediante la realización del patrón oro virus cuantitativo consecuencia ensayo (QVOA)33.
Debido a la naturaleza compleja de latencia y reactivación del virus eficaz, una estrategia multifacética combinatoria puede ser necesario34. Tratamiento potencial necesita estimular múltiples vías incluyendo transcripción y splicing, que previamente se ha demostrado que desempeñan un papel esencial en el establecimiento de latencia16,35,36, 37. impulsado por litro nuestro reportero empalme permitiría una proyección de alto rendimiento de procesamiento de drogas que puede perfectamente ambos pasos, transcripción y splicing, aumentando la posibilidad de encontrar moléculas que pueden sinergizar de manera eficiente, que daría lugar a una menor niveles de dosis y toxicidad de cada droga.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
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