Summary
通过测试干预措施对艾滋病毒转录和剪接的影响, 描述并应用了一种用于艾滋病毒高效再激活和清除的高通量协议。给出了延迟反转剂对 ltr 驱动的转录和剪接的影响的代表性结果。
Abstract
由于存在着大量的细胞, 这些细胞储存着病毒的稳定和潜在形式, 免疫系统对此仍然是看不见的, 而且目前的抗逆转录病毒疗法没有针对艾滋病毒。转录和剪接已被证明可以加强 hiv-1 延迟静止 cd4 + t 细胞。在 "冲击和杀死" 方法中使用潜伏期反转剂 (lra) 引起的潜伏期逆转已被广泛研究, 试图清除这个水库, 但由于缺乏足够的小分子, 可以有效地干扰这个水库。这里介绍的协议提供了一种可靠、高效地评估 hiv 转录和剪接延迟逆转剂 (lra) 的方法。这种方法是基于使用 cytometry 驱动的双色记者, 可以同时测量上帝军的影响转录和剪接流细胞学。这里描述的协议对粘附细胞以及悬浮细胞来说都是足够的。它对于在高吞吐量系统中测试大量药物非常有用。该方法在技术上易于实现, 成本效益高。此外, 流式细胞仪的使用可以同时评估细胞的活力, 从而评估药物毒性。
Introduction
尽管有效的长期抗逆转录病毒疗法, 艾滋病病毒仍然在潜在的状态作为一个综合提供在记忆 cd4+ t 细胞1。hiv-1 5 长端重复 (ltr) 启动子的染色质结构和表观遗传修饰, 如基因组化和 dna 甲基转移酶 (dnmt) 和组蛋白去乙酰化酶 (hdac) 等修饰, 是导致导致转录抑制, 从而整合后潜伏期2,3。对多种潜伏期逆转剂 (lra) 进行了研究, 以研究其诱导病毒体外和体内产生病毒的有效性, 这些药物可诱导病毒在体外和体内产生, 这些药物的作用是诱导潜在感染的静息 cd4 + t 细胞4、5、6、7 ,8。在测试的 lra 中, hdaci (hdac 抑制剂) 和 bet 溴瘤抑制剂 (betis) 分别诱导染色质去密度和释放阳性转录伸长率因子 b (p-tefb), 从而导致随后缓解转录在 5 ' ltr 的镇压和激活艾滋病毒表达9,10,11, 12,13.然而, 这些 lra 所实现的再激活幅度有限, 因为在体内14, 15 观察到的细胞相关的未切片 hiv mrna (美国 rna) 仅略有增加, 表明病毒转录。重要的是, 这些 lra 也未能导致潜在感染细胞频率的降低。
hiv 的表达可能会受到效率低下的拼接16以及多重拼接 hiv rna (ms rna)17的核出口缺陷的进一步限制。因此, 需要确定更有效且可能影响病毒生产后集成的不同方面的新类型 lra。此外, 还需要开发新的检测方法, 帮助定义最佳化合物, 以有效地反向延迟。
在这里, 提出了一个协议, 其中采用高通量的方法, 功能评估干预措施对艾滋病毒 ltr 驱动转录和拼接的影响。总之, 一种新的 ltr 驱动的双色记者系统rev 38/dsred (图 1) 用于通过流式细胞术评估 hiv 的再激活。在本荧光记者中, 无拼接 hiv mrna (4kb) 的表达导致绿色荧光蛋白 (egfp) 表达增强, 而拼接 mrna (2kb) 的表达会导致争议病毒 sp.红色 (dsred) 荧光蛋白的表达。简单地说, 我们使用了荧光 env-egfp 融合蛋白, gp140unc。egfp, 其中 egfp 的编码序列被放置在框架与一个未切割和截断的形式的信封 (环境)。引入了一些改变, 以消融可防止 env 分离成 gp120 和 gp41-egfp, 并在跨膜域之前截断 gp120 蛋白, 从而形成可溶性 env 类似物, 从而促进正确折叠和egfp 的表达。在细胞内的表达时, rev 定位到细胞核, 通过与 rev 反应元件 (rre) 的相互作用, 介导 4 kb env mrna 的核细胞质出口。env 的截断不会损害位于 gp120 和 gp120 之间的 rre 和 a7 3 ' 拼接站点。在该系统中, 在 hiv-1 拼接供体 4 (sd4) 和拼接受体 7 (sa7) 处进行拼接, 导致产生一种 2kb mrna 编码的非功能性 rev 蛋白, 该蛋白编码在氨基酸38融合到 dsred 荧光蛋白时被截断,。简单地说 , dsred 入到在氨基酸 38 的 rev 的第 2外显子重叠引伸 18 。为了促进无拼接 mrna 的核出口, 将哺乳动物表达载体编码 rev (pcmv-revnl4.3) 与荧光记者结构 (图 2) 共同转染。这里描述的这个独特的记者结构是有用的高通量评估的 hiv 转录和拼接, 而无需使用病毒载体。
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Protocol
请注意:克隆、转化和测序程序在其他地方讨论 18、19。本文的协议从哺乳动物表达载体的转染开始 (图 3)。
1. 采用双色记者构建 hek293t 细胞转染
- 在 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 中培养 hek293t 细胞, 并在37°c 的 5% co 2 孵化器中补充 10% (v/v) 胎儿牛血清 (fbs)、青霉素 (100 v/v) 和链霉素 (100μgml).解冻后, 将 hek293t 细胞通过2-3 次, 然后在转染实验中使用。这将使细胞有时间从解冻过程中恢复。
注意事项:支原体对细胞培养物的污染仍然是一个严重的问题。良好的实验室实践和细胞培养的常规测试对于降低支原体污染风险和避免扩散20至关重要。 - 在播种前一天将细胞 1: 2 拆分, 并将其转移到新鲜的 dmem 介质中。在37°c 的 5% co2 孵化器中培养细胞 24小时 。
- 在转染前一天, 通过吸入从烧瓶中取出培养基, 用没有钙 (ca2 +) 和镁 (mg 2+) 的 dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 清洗细胞, 以去除血清的痕迹。
- 将色氨酸 edta 溶液5毫升 (pbs 中 0.05%-10mm) 放入培养容器中, 并将其置于37°c 的 5% co2 孵化器中, 2-5分钟.
- 当细胞分离时, 加入5毫升的 dmem, 再加上 10% (v/v) fbs, 以进一步抑制胰蛋白酶活性, 这可能会损害细胞。
- 通过将细胞悬浮液向上和向下移液以分解团块, 轻轻地重新拔毛。
- 稀释色氨酸蓝染色中的细胞 1:10 (0.4%)。
- 用显微镜 (10倍目标) 和血细胞仪对不占去色氨酸蓝的活细胞进行计数。
- 计算每毫升可行细胞的数量, 方法是取细胞计数的平均值, 并将其乘以 10, 000, 并通过色氨酸蓝色染色的稀释系数 (1:10) 计算。
- 在96井平板24小时内, 在 dmem 介质100μl 中的板 2 x10 4 细胞在没有抗生素的情况下补充10% 的 fbs。
- 每口井稀释400纳克的 pltr. gp140/egfp。revd38/dsred, 20 ng 的 pcmv-revnl4.3和 100 ng 的 pcmv-tat101 ad8-旗dna 50μl的无血清培养基。轻轻混合。对于不使用 tat 的实验, 请使用匹配的空 tat 向量 pcdna3.1 (-)。
请注意:强烈建议使用不含内毒素的 dna。为此, 使用 midi 或 max-p护酸纯化试剂盒制备不含内毒素的 dna。通过测量 26/280 od 比确定 dna 纯度, od 比率应在1.7 到1.9 之间。 - 使用前将脂质试剂轻轻混合, 然后在50μl 的无血清培养基中稀释0.65μl。在室温下轻轻混合, 孵育5分钟。
- 将稀释后的 dna 与稀释的脂质试剂结合使用。
- 在室温下轻轻混合, 孵育20分钟。溶液可能会出现多云。
请注意:继续执行步骤1.15。30分钟内 - 每口液中每口液中每口液中的单脂血症-dna 复合物滴在细胞顶部。
- 通过来回摇晃盘子, 轻轻混合。
-
在37°c 的 5% co2 加湿孵化器中孵育板5小时。
- 每个反应组合对于单口井 (96 井) 转染都足够了。根据要测试的药物和组合的数量, 调整成分的数量和体积, 并考虑移液变化。所有条件通常都是以三元形式进行测试的。
- 为补偿目的, 用 100 ng 驱动的 Transfect 和 dsred-express dna 质粒转染额外的油井。
2. 延迟反转剂治疗转染 hek293t 细胞
请注意:在每次检测之前, 通过细胞增殖试验测量接触高剂量和低剂量药物后细胞的活力来确定每个上帝抵抗军的生理状况。
- 用生长介质 (例如, 1μm 为 JQ1(+) 将每个上帝抵抗军稀释到适当的工作集中度。
注意事项:将冻干药物与适当的溶剂重新合成为浓度为 10 mm。将所有库存 lra 存储在-80°c 的一次性使用的 aliquot (每个 5μl) 中, 以避免重复的冻融循环。 - 小心吸气转染介质与多通道, 并替换为100μl 介质, 其中包含适当的上帝军 (表 1)。在井壁旁边非常温和地添加培养基, 以避免分离转染的 hek293t 细胞, 已知这些细胞很容易从培养板表面分离。
- 在37°c 的 5% co2 加湿孵化器中孵育板48小时。
3. 流式细胞术中可固定活体染料转染细胞的染色
注意事项:清除死细胞和碎片对于消除误报和获得最高质量的结果至关重要。
- 每口使用100μl 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 将细胞分离到介质中, 并通过多通道轻轻移液上下 (~ 5次), 同时避免介质起泡。如有必要, 使用每口 3 5μl 的色氨酸 edta 溶液 (pbs 中的 0.05%-10mm) 将细胞从板上分离, 并在37°c 孵育 5分钟, 然后用含血清中和。
- 将细胞转移到96层 v 型底板上。
- 在4°c 的 500 x 克下旋转细胞 5分钟, 然后在不接触细胞的情况下小心吸气。
- 用200μl 的不含蛋白的 pbs 清洗细胞至少1次。
- 在4°c 下以 500 x g离心 5分钟, 然后通过倾斜板和取出洗涤缓冲液而不接触细胞来丢弃上清液。
- 通过稀释不含蛋白质的肽中的活力染料 1: 1000, 制备固定活力染料的工作溶液。每口井准备50μl 的稀释污渍。
请注意:活力染料有多种颜色可供选择, 适合与蓝色、红色和紫色激光一起使用。用50μl 无水 dmso (组分 b) 重新悬浮一小瓶冻干染料 (组分 a), 制备固定活力染料的库存溶液。在-20°c 的温度下储存在一次性的阿利夸特 (每种 1μl) 中, 不受光线的影响。 - 在每口井中加入50μl 的稀释活力染料, 并用多通道向上和向下移液混合细胞。
- 在4°c 下染色 10-15, 免受光线影响。
- 用150μl 洗涤缓冲液清洗1-2 次 (pbs 与1% 的牛血清白蛋白和 2 mm edta)。
- 在4°c 下以 500 x g 离心5分钟。放弃上清液。
- 在4°c 的黑暗中, 用新鲜制备的1% 甲醛100μl 将细胞固定在洗涤缓冲液中10-15。
注意事项:甲醛是非常有毒的。在烟罩中准备1% 的甲醛溶液, 以避免在戴手套和安全眼镜时吸入。 - 用100μl 的洗涤缓冲液清洗细胞1-2 次。
- 在4°c 下以 500 x g 离心5分钟。放弃上清液。
- 在70μl 的洗涤缓冲液中重新填充细胞颗粒。
请注意:协议可以在这里暂停。固定细胞可以在4°c 的黑暗中储存, 第二天在流动细胞仪上进行分析。
4. 用流式细胞仪和数据分析测量 egfp 和 dsred
请注意:分析在流式细胞仪上的 hiv 转录 (% egfp) 和剪接 (% dsred)。在运行前使用70μm 的细胞过滤器或100μm 的尼龙网对样品进行过滤, 以避免堵塞喷嘴。
- 在使用前至少10分钟启动细胞仪和计算机, 以确保激光预热。
- 在运行样品和开始数据采集之前, 请在护套槽中加入0.9% 的盐水溶液, 并确保在废物槽中添加次氯酸钠片。
- 检查流动单元是否有气泡。
- 验证探测器和过滤器是否适合实验。
请注意:对于 egfp, 使用蓝色激光 (488 nm) 和530带通, 而 dsred express 使用黄色激光 (561 nm) 和 610/20个带通进行最佳检测。蓝色激光 (488 nm) 和61020带通也可用于检测 dsred 表达。 - 通过运行校准磁珠, 检查检测器的性能和灵敏度。
- 使用未染色样品调整正向 (fsc-a) 和侧 (ssc-a) 散射电压, 使主群体在屏幕上清晰可辨。
请注意:fsc (前向散射光) 是一种以平面角度测量光衍射的方法, 它取决于电池的体积 (电池表面积或大小), 而 ssc (侧散射光) 则是以直角测量光衍射的方法, 这与之成正比。细胞粒度和内部复杂性。 - 使用单染色样本进行手动或自动补偿, 确保 egfp + 人群最小地溢出到 dsred 检测器中, 反之亦然。
注意事项:为了补偿的目的, 使用一个细胞样本表达每个单色荧光蛋白, 以及细胞单独染色的可修复的活力染料。由于光谱特性的不同, 不要使用 fitc 和 pe 补偿珠进行 egfp 和 dsred 荧光蛋白补偿。薪酬控制应该足够聪明, 以解决积极和消极的人口问题。 - 使用荧光减 1 (fmo) 控件创建图并设置门。
- 每个样本获取并记录至少 10, 000个活细胞事件。以中低速运行样品, 以避免双片通过激光拦截。使用脉冲几何门控, 如 ssc-a 和 ssc-h, 以消除双。通过绘制时间与 ssc-a 相比, 检查运行的稳定性, 以查看在运行过程中, 即使是流也是如何运行的。
- 在运行结束时, 用浓缩的清洁剂清洗流式细胞仪, 然后每次水5分钟。
- 关闭系统, 丢弃废物, 并在采集后重新填充护套槽。
- 使用流式细胞术数据分析软件对数据进行分析。根据前向和侧面散射排除细胞碎片和团块 (双块), 然后使用活性染料染色 (阴性群体 = 活细胞) 消除死细胞。识别表示 egfp 和 dsred 的单元格 (图 4), 以及拼接产品 dsrede/(dsred + egfp) 的百分比 (图 5)。
- 通过比较未经治疗的细胞和暴露在个人或 lra 组合中的细胞, 确定上帝抵抗军对艾滋病毒转录和剪接的影响 (图 5)。
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Representative Results
图 5显示了用溴蒙丹抑制剂 jq1 治疗后 hiv-1 无拼接 (egfp) 和拼接 (dsred) 产品的表达的代表性结果。JQ1(+) 和 tat 都显著增加了表达 egfp 的细胞百分比 (分别为2.18 和 4.13 fc, 高于 dmso; n = 3) 表明没有拼接的转录。此外, JQ1(+) 显著提高了表达 dsred (46.6 fc 高于 dmso) 的细胞比例, 以及拼接产品 (7.37 fc 高于 dmso) 的比例, 达到与 tat (分别为29.6 和 5.83 fc 高于 dmso) 确认 JQ1(+ 能力的比例。打开 hiv 转录和剪接。另一方面, 立体异构体控制 jq1 (-) 治疗 JQ1(+) 消除了对艾滋病毒转录和剪接的影响, 证实了该协议的成功。
在最近的一份出版物中, 我们通过 rna 分析显示, 在 JQ1(+) 治疗21之后,hiv 拼接记录的积累。事实上, 我们的数据显示, 在这个模型中, 在用 JQ1(+) 治疗后, egfp 和 dsred 蛋白表达反映了无拼接和拼接转录的水平的一致变化。这些结果表明, egfp 和 dsred 表达细胞反映了溴瘤抑制剂 JQ1(+) 诱导 hiv 转录和剪接的能力。
总之, 我们验证了 pltr. gp140/egfp 的使用。rev 38/dsred 记者在一个高通量设置中, 用于评估 lra 对 hiv-1 转录和拼接的影响。上帝军数量不理想或毒性增加可能导致飞毛腿的结果。在保持细胞活力的同时优化药物用量可以提高结果的准确性。
图 1: 用于确定延迟反转代理对 ltr 驱动的转录和拼接的影响的模型示意图.ltr 结构表达了与增强绿色荧光蛋白 (egfp) 融合的无拼接包络 (env) 蛋白, 或与 dsred 拼接的38反转蛋白。这一数字已从 khoury 等人21人重印。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 构造设计.(a) pltr. gp140/egfp。rev 38/dsred 拼接记者允许在与 dsred 荧光蛋白 (rev 38-dsred) 融合的氨基酸38中, 将非功能性的 rev 蛋白与 egfp (gp140-egfp) 和非功能性的 rev 蛋白结合在一起。(b) pcmv-revnl4.3允许rev 蛋白的表达。(c) pcmv-tat101ad8 旗允许用 c-末端旗杆标记表达 Tat101(AD8) 蛋白。表达质粒是利用 pcr 重叠和限制性消化构建的。所有的矢量地图都是使用snapgene软件, 版本4.1.9 创建的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 用于快速评估艾滋病毒潜伏期反转剂的检测设计.目前评估 lra 对 hiv-1 转录和剪接的影响的方法包括: i) 在 ii) 转染前一天, 用表达载体进行 hek29t 细胞的移植, 然后是 iii) 上帝军的治疗。(四) 治疗48小时后, 用流式细胞术对细胞进行分析。使用该协议, 每个板可以测试32到96个条件 (一式三份)。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1: 所需板材设置和控制的代表性实例.第1至第3栏对应的是负 (-) 对照, 仅无药物和溶剂 (dmso 1:5000), 以及正 (+) 控制, 如 tat (100 ng), pma/phha = phorbol myrristate 乙酰/植物血凝素 (10 nm pma, 10μgml pha)、jq1 (+/-) (1:5000)、vor = vorinostat (0.5 微米) 和 pan = panobinostat (30 nm)。未知的 lra 在一系列浓度 (15.625 至 1000 nm) 范围内测试一式三份。为了补偿起见, 表达每种单色荧光蛋白 (egfp + 和 dsred +) 的细胞以及染色的细胞都含有活力染料和未染色的细胞。请点击此处下载此文件.
图 4: 流式细胞术分析中使用的作法策略.门控策略的第一步是基于正向和侧面散射, 它允许根据这些细胞的大小和粒度属性区分感兴趣的细胞。建议这次门控尽可能慷慨, 包括所有事件, 同时清除在密度图左下角发现的细胞碎片和死亡细胞。然后使用脉冲几何门控、ssc-a 与 ssc-h 从数据集中去除双数, 并使用活力染料进一步缩小活细胞。最后, 转储通道 (紫色) 和 egfp 或 dsred 用于定义感兴趣的单元格。使用荧光减 1 (fmo) 控制装置对于界定感兴趣的人群和解决感兴趣的通道中另一个含氟铬的溢出问题至关重要。采集后, 使用流式细胞仪数据分析软件对数据进行分析。这一数字已以 Khoury 等人的改编形式重印.请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 溴瘤抑制剂对 hiv 转录和剪接的影响的代表性结果.(a) 双参数双色荧光 egfp 与 dsred 密度图的例子, 这些细胞与未转染的细胞 (-tat)、用 100 ng pcmv-tat101 ad8-旗 (+ tat) 转染的细胞以及用 dmso、jq1 (+) 或 jq1 (-) 处理的细胞。(b) 显示了3个独立实验中表达 egfp、dsred 或拼接产物 (dredsredsred + egfp) 的细胞的平均百分比 (%)。采用双向方差分析试验, 对各条件与 dmso 进行了比较。仅显示具有统计意义的比较。*p < 0.05;* *p < 0.01;p < 0.001。黑线表示平均± sem. dmso (1:5000)、jq1 (+) 和 jq1 (-) (1 微米)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
鉴于在体内测量病毒再激活的困难, 为了研究 hiv 潜伏期, 包括潜伏期感染的 t 细胞系 (j-lats、ach2、u1)、主要的静息感染模型 (o ' deherty, lewin, greene 和脊柱模型) 或预激活的 cd4 + t 细胞 (sahu, marini, planelles, siliciano, karn 模型) 与单轮或复制主管记者病毒22。为了模拟静止 cd4+ t 细胞中 hiv 潜伏期的生理条件, 随后出现了双荧光记者系统, 如 ivan sadowski 小组开发的 rgh (红绿艾滋病毒) 记者, 该报告程序有 ltr 驱动的 Gag-eGFP 标记和 cv 驱动的 mcherry。内夫23。一个类似的双色记者病毒, 过本病毒, 由 e. verdin 实验室开发了与 ltr 驱动的 egfp 表达和 mcherry 荧光标记驱动的 ef1 α启动子24。在这个系统中 , egfp 入到了供给的 3 ' 端 , 代替了 nef 。在这两个系统的信封中的删除可防止多轮感染。此外, 这两种荧光蛋白的组合可以有效地检测到受感染的细胞 (egfp + mcherry +) 和潜在的 (egfp-mcherry +)。然而, 双色记者病毒的几个缺点在 cd4+ t 细胞中是显而易见的, 因为潜伏期感染细胞的直接感染在很大程度上取决于 t 细胞23,24的细胞激活状态。事实上, 在静止 cd4 + t 细胞中使用这两种报告病毒观察到的感染率非常低: rgh23为 0.1%, 多氟度25为 0.2%.此外, 由于 cmv 启动子已被证明在未激活细胞26、27、28的较低水平表达, 不活跃的 cmv 或 ef1 α启动子将导致对早期感染的低估人口。
我们已经生成并表征了一个新的 hiv 报告载体, 以研究在高通量检测中建立潜伏期和病毒再激活的问题。我们筛选方法的几个优点包括: (a) 具有同时评估转录和剪接的能力, (ii) 在单个实验中测试大量药物或组合的能力, (三) 快速评估流式细胞术对 lra 的影响 (96 孔板的30-45 典型读取时间不受荧光参数的影响), iv) 高动态范围, v) 适用于使用机器人手臂和 hts 平台的自动高通量转染和流式细胞术,(vi) 使用流式细胞仪工作区模板快速固化数据, vii) 最佳悬浮液和粘附细胞, viii) 模型的简单性和对发光和板材读取器测量 (双荧光素酶萤火虫和 renilla) 的适应性, 以及九)可扩展性 (96 和384孔 pate 格式)。
通过流式细胞仪检测上帝抵抗军或 lra 组合激活 hiv cytometry 驱动的转录和剪接的倾向, 从而利用我们的 hiv 拼接记者检测 egfp 和 dsred 荧光蛋白的表达。然而, 在测试新型 lra 的协同作用之前, 强烈建议通过测量接触一系列单一药物后细胞的生存能力来确定每个上帝军的生理条件。因此, 包括活细胞和死细胞的标记对于消除假阳性和获得最高质量的结果至关重要。流式细胞术分析的另一个重要方面是补偿控制或 fmo。强烈建议使用单独染色的样本, 以确保 egfp + 种群向 dsred 的溢出最小, 反之亦然。此外, 重要的是要考虑到细胞的自体荧光, 包括未染色的细胞。最后, 在测量样品以进行长时间的研究时, 定期控制整个探测器的细胞仪性能和灵敏度至关重要。
虽然在协议部分没有讨论, 但我们的拼接记者系统有几个局限性。关于更彻底的讨论, 请看我们以前的出版物 (khoury 等人, 2018年)。病毒蛋白 rev 及其与这些 mrna 物种29、30、31、32中的 rev 反应性元素 (rre) 的关联促进了 hivmrna 的部分或未拼接变异体的出口。rev 在我们系统中的过度表达使我们能够绕过在潜伏期感染的 t 细胞17中观察到的多接拼接和不拼接 mrna 的核保留的主要块, 并专注于了解 lra 是如何诱导转录和剪接的因此病毒重新激活。此外, 考虑到我们的系统需要3个质粒的转染, 我们选择了 hek293t 细胞, 因为这些细胞的转染效率很高。由于 t 细胞中的细胞因子与癌细胞系相比具有不同的时间和空间可用性, 因此验证 t 细胞系和原代细胞的 hek293t 细胞中获得的剪接记者的结果是非常重要的, 这可能会提供很大的信息。由于其可扩展性有限, 因此面临技术挑战。因此, 使用替代 dna 传递试剂进行转染, 如 dmrie-c, 已被证明对悬浮细胞 (如 jurkat) 或核裂变方法 (如 amax 核细胞或霓虹灯) 的转染特别有效。经证明, 转染系统可促进将单个或多个质粒高效可靠地传递给难以转染的细胞, 包括原代 cd4 + t 细胞。或者, 在使用上述转染方法的主细胞延迟模型中, 在全长病毒的上下文中测试这个记者系统也是很有趣的。事实上, rcd4+ t 细胞中宿主转录、伸长率和剪接因子的可用性差异可能会影响上帝军重新激活潜在补给的能力。最后, 我们的模型没有解决上帝军是否会影响旁观者细胞的转录和剪接, 以及它是否能诱发可复制的病毒。然而, 我们怀疑, 通过测量细胞相关的艾滋病毒美国和 ms rna 的增加, 这将导致在培养中产生具有复制能力的病毒。这可以通过进行金标准定量病毒生长检测 (qvoa)33来证实。
由于延迟的复杂性, 并确保有效的病毒重新激活, 可能需要一个多方面的组合策略34。潜在的治疗需要刺激多种途径, 包括转录和剪接,这在先前已被证明在建立潜伏期16,35,36方面发挥着至关重要的作用。37. 我们的 ltr 驱动的剪接记者将允许对药物进行高通量筛选, 从而以最佳方式针对转录和剪接两个步骤, 从而增加找到能够有效协同的分子的机会, 从而降低剂量水平, 因此每种药物的毒性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了澳大利亚国家住房改革委员会项目赠款 app1129320 和 app1052979 方案赠款的支持。我们感谢亚当·惠特利博士、玛丽娜·亚历山大博士、珍妮·安德森博士和米歇尔·y·李先生为圆满完成这项工作提供了必要的结构和建议。我们还感谢 dmi 流动设施工作人员在维持本研究中使用的流式细胞仪方面提供的建议和慷慨的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
