Summary
Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.
Abstract
HIV blijft ongeneeslijke als gevolg van het bestaan van een reservoir van cellen die havens stabiel en latente vorm van het virus, dat blijft onzichtbaar voor het immuunsysteem en is niet gericht door de huidige antiretrovirale therapie (cART). Transcriptie, egaliseren en lamineren is aangetoond dat de versterking van de latentie van de HIV-1 bij rust CD4 + T cellen. Omkering van latentie door het gebruik van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) bij de aanpak van "schok en kill" uitvoerig is onderzocht in een poging om te zuiveren van dit reservoir maar heeft tot nu toe niet aangetoond met enig succes in klinische proeven als gevolg van het gebrek aan ontwikkeling van voldoende kleine moleculen die efficiënt dit reservoir kunnen erover. Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode voor betrouwbaar en efficiënt beoordeling van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van een LTR-gedreven dual kleur verslaggever die het effect van een LRA op transcriptie, egaliseren en lamineren gelijktijdig kunt meten van stroom cytometry. Het protocol hier beschreven is geschikt voor zowel Adherente cellen als de cellen in suspensie. Het is handig voor het testen van een groot aantal drugs in een hoge doorvoer systeem. De methode is technisch eenvoudig te implementeren en rendabel. Bovendien is het gebruik van stroom cytometry zodat kan worden nagegaan van de levensvatbaarheid van de cellen en dus drug toxiciteit op hetzelfde moment.
Introduction
Ondanks op lange termijn effectieve antiretrovirale therapie aanhoudt HIV in een latente staat als een geïntegreerde provirus in geheugen CD4 + T cellen1. De structuur van de chromatine van de HIV-1-5' lang terminal herhalen (LTR) promotor en epigenetische aanpassingen zoals Histon methylation en deacetylation door DNA methyltransferases (DNMT) en Histon deacetylases (HDAC) zijn belangrijke mechanismen die leiden tot transcriptionele repressie en dus na integratie latency2,3. Een grote verscheidenheid van latency achteruitrijlicht agenten (lokale en regionale overheden) heeft onderzocht voor hun doeltreffendheid voor het opwekken van de virus productie in vitro en in vivo van latent geïnfecteerde rust CD4 + T cellen4,5,6,7 ,8. Onder de lokale en regionale overheden getest, HDACi (HDAC-remmers) en BET bromodomain remmers (BETis) veroorzaken chromatine-decondensation en de introductie van de positieve transcriptie rek factor b (P-TEFb) respectievelijk, wat leidt tot latere verlichten van de transcriptionele onderdrukking op de 5' LTR en activering van HIV expressie9,10,11,12,13. De omvang van reactivering bereikt door deze lokale en regionale overheden werd echter beperkt omdat slechts een bescheiden toename van cel-geassocieerde unspliced HIV mRNA (ons RNA), indicatieve van virale transcriptie, ex vivo14,15werd waargenomen. Belangrijk is dat deze lokale en regionale overheden ook niet voor het opwekken van een vermindering van de frequentie van latent geïnfecteerde cellen.
HIV expressie kan verder worden beperkt door inefficiënte splicing16 , alsmede gebreken in nucleaire export van vermenigvuldigen afgesplitste HIV RNA (MS RNA)17. Aldus, identificerende nieuwe klassen van lokale en regionale overheden die krachtiger en kunnen invloed hebben op verschillende aspecten van de virus productie na integratie nodig zijn. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe tests die helpen met het bepalen van de optimale verbindingen om om te keren efficiënt latency is vereist.
Hier, wordt een protocol gepresenteerd, die gebruik maakt van een benadering van de hoge gegevensdoorvoer voor functionele beoordeling van het effect van interventies op HIV LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren. Kortom, een nieuwe LTR-gedreven dual color verslaggever systeem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figuur 1) wordt gebruikt om te beoordelen van HIV reactivering stroom cytometry. In deze TL verslaggever leidt de uitdrukking van mRNA van unspliced HIV (4 kb) tot verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) expressie, terwijl de expressie van afgesplitste mRNA (2 kb) tot de fluorescerende eiwituitdrukking Discosoma sp. rood (DsRed leiden zou). Kort, gebruikten we een fluorescerende Env-EGFP fusieproteïne, gp140unc. EGFP, waar de codering opeenvolging van EGFP werd geplaatst in frame met een VN-gekloofd en afgekapte vorm van de envelop (Env). Wijzigingen aangebracht aan de breukzijde voorkomen de dissociatie van Env in gp120 en gp41-EGFP lasertherapie en afkappen van het eiwit gp160 voorafgaand aan de transmembrane domein maakt een oplosbare Env analoog, dat de juiste vouwen vergemakkelijkt en expressie van EGFP. Op de expressie in een cel, Rev lokaliseert aan de kern waar het bemiddelt de nucleaire-cytoplasmatische export van de 4 kb env mRNA via de interactie met het rev responsief element (RRE). Het afkappen van Env doet geen afbreuk aan de RRE, die tussen gp120 gp41 en de A7 3' splice site ligt. In dit systeem, splicing bij HIV-1 splice donor 4 (SD4) en splice acceptor 7 (SA7) resulteert in de productie van een 2 kb mRNA codering van een niet-functionele Rev eiwit afgebroken op aminozuur 38 gesmolten aan DsRed TL proteïne, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed werd ingevoegd in de 2nd exon van Rev op aminozuur 38 overlapping extensie18. Om te vergemakkelijken de nucleaire export van unspliced mRNA, was mede een vector van de zoogdieren expressie codering Rev (pCMV-RevNL4.3) transfected met de fluorescerende verslaggever construct (Figuur 2). Deze unieke verslaggever constructie hier beschreven is nuttig in high-throughput beoordeling van HIV transcriptie, egaliseren en lamineren, zonder de noodzaak om het gebruik van virale vectoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Procedures voor het klonen, transformatie en sequencing zijn elders besproken18,19. Hierin de protocollen beginnen van de transfectie van de zoogdieren expressievectoren (Figuur 3).
1. de transfectie van HEK293T cellen met Dual Color verslaggever bouwen
- Cultiveren van HEK293T cellen in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL) in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Na het ontdooien, passage HEK293T cellen 2 - 3 keer voordat u ze gebruikt in Transfectie experimenten. Hierdoor zou de cellen-tijd om te herstellen van de dooiende procedure.
Let op: Mycoplasma verontreiniging van celculturen blijft een ernstig probleem. Goede laboratoriumpraktijken en routinetests van celculturen zijn essentieel voor het risico van mycoplasma verontreiniging verminderen en voorkomen van verspreiding20. - 1:2 één dag vóór het zaaien van de cellen splitsen en ze vervolgens overbrengen naar verse DMEM medium. Cultiveren van de cellen gedurende 24 uur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- De dag voor transfectie, verwijder het medium van de kolf door aspiratie en wassen van de cellen met Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) oplossing gratis calcium (Ca2 +) en magnesium (Mg2 +) om de sporen van het serum te verwijderen.
- Afzien van 5 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) in het schip van de cultuur en plaats deze bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2 tot en met 5 min.
- Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg 5 mL van DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS aan de trypsine-activiteit die de cellen beschadigen kan verder te remmen.
- Resuspendeer zachtjes door pipetteren de celsuspensie omhoog en omlaag te breken van de bosjes.
- De cellen 1:10 verdunnen in trypan blauwe vlek (0,4%).
- Tellen de levende cellen die doen niet innemen trypan blauw met behulp van een microscoop (10 x doelstelling) en een haemocytometer.
- Het aantal levensvatbare cellen per milliliter te berekenen door het nemen van het gemiddelde van het aantal cellen en vermenigvuldiging met 10.000 en door de verdunningsfactor (1:10) van de trypan blauwe vlekken.
- Plaat met 2 x 104 cellen in 100 μl van DMEM medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica in een 96-Wells flat-bodemplaat gedurende 24 uur.
- Voor elk putje, Verdun 400 ng van pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng van pCMV-RevNL4.3 en 100 ng van pCMV-Tat101AD8-vlag DNA in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig. Voor experimenten zonder Tat, gebruikt u een overeenkomende lege Tat vector pcDNA3.1 (-).
Opmerking: Het gebruik van endotoxinen-gratis DNA wordt sterk aanbevolen. Daarvoor, bereiden endotoxine-gratis DNA met behulp van een midi- of maxiprep nucleïnezuur zuivering kit. Bepalen de zuiverheid van DNA door het meten van de 260/280 OD ratio, die tussen de 1,7 en 1,9 moet. - Meng het lipide-reagens zachtjes vóór gebruik, vervolgens verdund 0,65 μL in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- De verdunde DNA te combineren met de verdunde lipide-reagens.
- Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing lijkt bewolkt.
Opmerking: Ga verder met stap 1.15. binnen 30 min. - Breng 100 μl per putje van de lipide reagens-DNA complexen drop-wise boven aan de cellen.
- Meng voorzichtig door de plaat heen en weer schommelen.
-
Incubeer de plaat voor 5 h in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Elke reactie mix is voldoende voor een transfectie één goed (96-Wells). Pas het bedrag en hoeveelheid componenten volgens het aantal drug en combinatie die zou worden getest en rekeningen voor pipetting variaties. Alle voorwaarden zijn meestal getest in triplicates.
- Extra putjes met 100 transfect ng van CMV-gedreven EGFP en DsRed-Express DNA plasmide ter compensatie.
2. behandeling van Transfected HEK293T cellen met latentie omkering van agenten
Opmerking: Voorafgaand aan elke assay, de fysiologische toestand van elke LRA te bepalen door het meten van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan hoge en lage dosis van het geneesmiddel met cel proliferatie test.
- Verdun elk LRA om de juiste concentratie van het werken met groeimedium (b.v., 1 μM voor JQ1(+)).
Let op: Reconstrueren de gelyofiliseerd drugs met de geschikt oplosmiddel tot een concentratie van 10 mM. Winkel al het materieel lokale en regionale overheden bij-80 ° C in één aliquot (elk 5 μl) gebruiken om te vermijden herhaalde cycli bevriezen-ontdooien. - Zorgvuldig gecombineerd transfectie medium met een multichannel en vervangen met 100 μl medium dat passende LRA (tabel 1). Toevoegen van middellange zeer voorzichtig langs de muur van de waterput om te voorkomen dat het loskoppelen van de transfected cellen van de HEK293T, waarvan bekend is dat het eenvoudig loskoppelen van het oppervlak van de plaat cultuur.
- Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
3. kleuring van Transfected cellen met corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof Stroom Cytometry p.a.
Let op: Het verwijderen van dode cellen en puin is essentieel om valse positieven te elimineren en te verkrijgen van de resultaten van de hoogste kwaliteit.
- Loskoppelen van de cellen in de media met behulp van 100 μl-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje en door zachtjes pipetteren en neergaande (~ 5 keer) met een meerkanaals, terwijl het vermijden van schuimen van de media. Indien nodig, loskoppelen van de cellen van de plaat met behulp van 35 µL per putje trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) en 5 minuten bij 37 ° C, het broeden voordat neutraliseren met medium dat serum.
- De cellen overbrengen in een 96-Wells-V-bodemplaat.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 ° C, dan zorgvuldig de middellange/PBS gecombineerd zonder het aanraken van de cellen.
- Wassen van de cellen ten minste 1 keer met 200 μL van eiwit/serum gratis PBS.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, dan Verwijder het supernatant door het kantelen van de plaat en het verwijderen van de was-buffer zonder het aanraken van de cellen.
- Een werkoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof bereid door verdunning van de levensvatbaarheid kleurstof 1:1000 in eiwit/serum gratis PBS. De verdunde vlek per putje 50 µL voor te bereiden.
Opmerking: Levensvatbaarheid kleurstoffen zijn verkrijgbaar in een waaier van kleuren geschikt voor gebruik met blauw, rood en violet lasers. Bereid een stamoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof door de resuspending van één ampul van het gelyofiliseerd kleurstof (component A) met 50 μl watervrij DMSO (onderdeel B). Opslag bij-20 ° C in een éénpersoons gebruik aliquoot (1 μL elk), beschermd tegen het licht. - Voeg 50 μl van de verdunde levensvatbaarheid kleurstof aan elk putje en meng de cellen door pipetteren op en neer met een multichannel.
- Vlek voor 10-15 min bij 4 ° C, beschermd tegen het licht.
- 1 - 2 keer wassen met 150 μl van was buffer (PBS met 1% boviene serum albumine en 2 mM EDTA).
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Het herstellen van de cellen met de 100 μl van vers bereide 1% formaldehyde in was buffer voor 10-15 min bij 4 ° C in het donker.
Let op: Formaldehyde is zeer giftig. Bereiden 1% formaldehyde-oplossing in een zuurkast te voorkomen van inademing terwijl het dragen van handschoenen en veiligheidsbril voor bescherming. - Wassen van de cellen 1 - 2 keer met 100 μl van was buffer.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 70 μL van was buffer.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Vaste cellen, kon de volgende dag op de stroom cytometer bij 4 ° C in het donker voor analyse worden opgeslagen.
4. EGFP en DsRed metingen door Stroom Cytometry en Data-analyse
Opmerking: Analyseren HIV transcriptie (% EGFP) en DsRed splicing (%) op een cytometer van de stroom. Filteren van het monster vóór de vlucht met een 70 μm cel-zeef of 100 μm nylon gaas om te voorkomen dat verstopt raakt het mondstuk.
- Opstarten van de cytometer en de computer ten minste 10 minuten vóór gebruik om lasers opwarmen.
- Voorafgaand aan de voorbeelden uitvoeren en data-acquisitie te beginnen, de schede tank vullen met zoutoplossing 0,9% en ervoor zorgen dat een tablet natriumhypochloriet is toegevoegd aan de afval tank.
- Controleer de stroom cel voor luchtbellen.
- Controleer of de detectoren en filters geschikt voor het experiment zijn.
Opmerking: Voor EGFP, gebruik van de blauwe laser (488 nm) en 530/30 bandpass, terwijl DsRed Express optimaal wordt gedetecteerd met behulp van de gele laser (561 nm) en 610/20 bandpass. Een blauwe laser (488 nm) en 610/20 bandpass kan ook worden gebruikt om op te sporen van DsRed expressie. - De prestaties van de cytometer en de gevoeligheid in detectoren controleren door kalibratie kralen uit te voeren.
- Aanpassen van de forward (FSC-A) en zijde (WS-A) scatter spanningen met onbevlekt monster zodat de grootste bevolking op het scherm is en duidelijk waarneembaar.
Opmerking: FSC (Forward-strooilicht) is een meting van licht diffractie in een platte hoek, die afhangt van het volume van de cel (cel-oppervlakte of grootte), terwijl de wetenschappelijke stuurgroep (kant-verstrooid licht) is een meting van lichte diffractie in een rechte hoek, die evenredig is met granulariteit van de cel en interne complexiteit. - Uitvoeren van handmatige of automatische compensatie met behulp van de single gebeitste monsters zorgen voor minimale spill-over van EGFP + bevolking in de DsRed detector en vice-versa.
Let op: Gebruik een steekproef van de cellen, uiting geven aan elk van de enkele kleur TL proteïne evenals cellen afzonderlijk gekleurd met de kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid ter compensatie. Gebruik geen FITC en PE compensatie kralen voor EGFP en DsRed fluorescerende eiwitten compensaties door verschillende spectrale eigenschappen. Compensatie besturingselementen moet helder genoeg om op te lossen van positieve en negatieve bevolking. - Maakt van de percelen en stelt de poorten met behulp van fluorescentie minus één (FMO) controles.
- Verwerven en minimaal 10.000 levensvatbare cellen evenementen per monster opnemen. Voorbeelden uitvoeren op medium of lage snelheid om te voorkomen dat paren passeren door het snijpunt van de laser. Gebruik pulse geometrie gating zoals WS-A versus SSC-H te elimineren paren. Controleer de stabiliteit van de run door het uitzetten van tijd versus SSC-A om te zien hoe zelfs de stroom is tijdens de run.
- Aan het einde van de termijn, de stroom cytometry fluidics met geconcentreerde reinigingsmiddelen schoon dan water voor elke 5 min.
- Afsluiten van het systeem, verwijderen de afvalstoffen en opnieuw vullen de tank van de schede na de overname.
- Het analyseren van de gegevens met behulp van een stroom cytometry data-analysesoftware. Cel puin en klomp (paren) op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter uitsluiten en elimineren van de dode cellen met behulp van de levensvatbaarheid kleurstof vlek (negatieve bevolking = levende cellen). Identificeren van de cellen, uiting van EGFP en DsRed (Figuur 4), alsmede het percentage van afgesplitste product DsRed /(DsRed + EGFP) (Figuur 5).
- Vaststellen van het effect van de LRA op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren door het vergelijken van onbehandelde cellen en de cellen die blootgesteld aan individu of een combinatie van lokale en regionale overheden (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 5 voor de expressie van HIV-1 unspliced (EGFP) en verbinding aan de randen (DsRed) producten na behandeling met bromodomain-remmer JQ1. Zowel JQ1(+) als Tat aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van EGFP (2.18 en 4.13 FC over DMSO respectievelijk; n = 3) indicatieve van unspliced afschriften. Bovendien JQ1(+) aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van DsRed (46.6 FC over DMSO) evenals het aandeel van de afgesplitste product (7.37 FC over DMSO) op een vergelijkbaar niveau als Tat (59.6 en 5.83 FC over DMSO, respectievelijk) bevestiging van de mogelijkheid van JQ1(+) om te schakelen op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Aan de andere kant, schaft behandeling met het stereoisomer-besturingselement JQ1(-) JQ1(+) effect op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren bevestigt het succes van het protocol.
In een recente publicatie, hebben wij aangetoond door RNA analyse een opeenstapeling van HIV verbinding aan de randen afschriften na JQ1(+) behandeling21. In feite, bleek onze gegevens consistente verandering in de niveaus van unspliced en afgesplitste afschriften die werden weerspiegeld door de eiwituitdrukking EGFP en DsRed in dit model na behandeling met JQ1(+). Deze resultaten wijzen erop dat EGFP en DsRed cellen uiten het vermogen van de bromodomain-remmer JQ1(+) weerspiegelen voor het opwekken van HIV transcriptie, egaliseren en lamineren.
Kortom, we het gebruik van de pLTR.gp140/EGFP gevalideerd. De verslaggever van de RevΔ38/DsRed in een high-throughput set-up voor de beoordeling van het effect van lokale en regionale overheden op HIV-1 transcriptie, egaliseren en lamineren. Sub-optimale hoeveelheid LRA of verhoogde toxiciteit kan leiden tot scud resultaten. Optimaliseren van de hoeveelheid geneesmiddel dat gebruikt wordt met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen kan het verbeteren van de nauwkeurigheid van de resultaten.
Figuur 1: schematische van het model gebruikt om te bepalen van de effecten van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren. De LTR construct spreekt die beide unspliced envelop (Env) eiwit naar gesmolten enhanced groen fluorescent proteïne (EGFP) of verbinding Δ38rev eiwit met DsRed aan de randen. Dit cijfer is herdrukt van Khoury et al.21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: construeert ontwerp. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed splicing verslaggever staat de expressie van EGFP (gp140-EGFP) en niet-functionele Rev eiwit gesmolten envelop afgekapt op aminozuur 38 gesmolten aan DsRed TL proteïne (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 kunt de uitdrukking van Rev eiwit. (C) pCMV-Tat101AD8-vlag staat de expressie Tat101(AD8) eiwit met een C-terminal vlag-tag. De expressie plasmiden worden geconstrueerd met behulp van PCR overlappingen en beperking verteren. Alle vector kaarten zijn gemaakt met behulp van SnapGene -software, versie 4.1.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: ontwerp voor snelle beoordeling van HIV latentie omkering van agenten Assay. De huidige methode voor de beoordeling van het effect van lokale en regionale overheden op HIV-1 transcriptie, egaliseren en lamineren bevat i) zaaien van HEK293T cellen één dag vóór ii) transfectie met expressies vectoren gevolgd door LRA iii) behandeling. IV) cellen worden geanalyseerd door stroom cytometry 48 h na de behandeling. Met behulp van dit protocol, kon 32 (in drievoud) tot en met 96 voorwaarden worden getest per plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: representatief voorbeeld van de plaat set-up en controles nodig. 1 tot en met 3 kolommen overeenkomen met negatieve (-) controles met geen drug en oplosmiddel enige (DMSO 1:5000) evenals de positieve (+) besturingselementen zoals Tat (100 ng), PMA/PHA = phorbol myristaat acetaat/Phytohemagglutinine (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 μM), VOR = vorinostat () 0,5 μM), en PAN = panobinostat (30 nM). Onbekende lokale en regionale overheden worden getest in drievoud over een aantal uiteenlopende concentraties (15.625 tot 1000 nM). Ter compensatie cellen uiten van elk van de eenkleurige fluorescente proteïne (EGFP + en DsRed +) evenals cellen gekleurd met de kleurstof van de levensvatbaarheid en onbevlekt cellen zijn opgenomen in elke serie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur 4: strategie gebruikt in de stroom cytometry analyse Gating. De eerste stap in de gating strategie is gebaseerd op de voorwaartse en zijdelingse scatter, waarmee het onderscheid van de cellen van belang op basis van de grootte en granulariteit eigenschappen van deze cellen. Het wordt aanbevolen dat deze gating zo genereus mogelijk op te nemen van alle gebeurtenissen, terwijl het verwijderen van cellulaire puin en dode cellen, die zijn gevonden op de bodem verlaten hoek van het perceel van de dichtheid. Verwijder paren uit de dataset met behulp van de geometrie van de pols gating, SSC-A versus SSC-H en verder smalle op de levende cellen met behulp van de kleurstof van de levensvatbaarheid. Tot slot worden een dump kanaal (violet) en EGFP of DsRed gebruikt om te definiëren voor cellen van belang. Het gebruik van fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen zijn kritisch bij het definiëren van de bevolking van belang en het aanpakken van spill-over van een andere fluorescerende in het kanaal van belang. Na de overname, worden de gegevens geanalyseerd met behulp van software van de analyse van de gegevens van stroom cytometry. Dit cijfer is herdrukt in aangepaste vorm Khoury et al.21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: representatieve resultaten van het effect van bromodomain-remmers op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. (A) voorbeelden van twee-parameter dual color fluorescentie EGFP versus DsRed dichtheid van untransfected cellen percelen (-Tat), cellen transfected met 100 ng van pCMV-Tat101AD8-vlag (+ Tat) en cellen behandeld met DMSO, JQ1 (+) of JQ1 (-). (B) het gemiddelde percentage (%) van cellen uiten van EGFP, DsRed of afgesplitste product (DsRed / DsRed + EGFP) uit 3 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven. Vergelijkingen van elke voorwaarde aan DMSO werden gemaakt met behulp van de 2-way ANOVA-test. Alleen worden statistisch significant vergelijkingen weergegeven. p < 0.05; p < 0,01; p < 0,001. De zwarte lijnen geven de mean±SEM. DMSO (1:5000), JQ1 (+) en JQ1(-) (1 μM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de moeilijkheid in het meten van virus reactivering ex vivo, een breed scala van in vitro modellen werden ontwikkeld in de tijd om te bestuderen van HIV latentie met inbegrip van latent geïnfecteerd T-cellijnen (J-Lats, ACH2, U1), primaire modellen van latente infectie van de rust) O'Doherty, Lewin, Greene en Spina modellen) of pre-geactiveerde CD4 + T cellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modellen) met één ronde of replicatie bevoegde verslaggever virussen22. Om het model van de fysiologische omstandigheden van HIV latentie in rust van CD4 + T cellen, volgde dual fluorescerende verslaggever systemen zoals de verslaggever van de RGH (rood-groen-HIV) ontwikkeld door Ivan Sadowski de groep met een LTR-gedreven Gag-eGFP marker en een CMV-gedreven mCherry op zijn plaats van Nef23. Een soortgelijke dual kleur verslaggever virus, Duo-Fluo, werd ontwikkeld door E. Verdin laboratorium met een expressie van EGFP LTR-gedreven en een mCherry fluorescerende marker gedreven door een promotor EF1α24. In dit systeem, is de EGFP ingevoegd aan het einde 3' van de provirus in plaats van Nef. De schrapping in de envelop in beide systemen voorkomt dat meerdere rondes van infecties. Bovendien de combinatie van de twee fluorescerende eiwitten zorgt ervoor dat de detectie van productief (eGFP + mCherry +) en latent (eGFP - mCherry +) geïnfecteerde cellen. Diverse tekortkomingen van de dubbele kleur verslaggever virussen waren echter merkbaar in CD4 + T-cellen, zoals de directe infectie van latent geïnfecteerde cellen grotendeels afhankelijk van de cellulaire activeringsstatus van de T-cellen23,24 is. In feite, zeer laag tarief van infectie werd waargenomen met behulp van deze twee verslaggever virussen in de rust van CD4 + T cellen: 0,1% voor RGH23 en 0.2% voor DuoFluo25. Bovendien, als de CMV worden uitgedrukt op lagere niveaus in niet-geactiveerde cellen26,27,28, een inactieve CMV promotor is aangetoond of EF1α promotor zou leiden tot onderschatting van de latent geïnfecteerde populaties.
Wij hebben gegenereerd en een nieuwe HIV verslaggever vector om te bestuderen van de oprichting van latentie en reactivering van virus in een hoge doorvoersnelheid assay gekenmerkt. Verschillende voordelen aan onze screeningmethode i) de kosteneffectiviteit omvatten de mogelijkheid om te beoordelen van de transcriptie, egaliseren en lamineren gelijktijdig, ii) de mogelijkheid om een groot aantal geneesmiddelen of combinaties testen in een één experiment, iii) snelle beoordeling van de effect van lokale en regionale overheden door stroom cytometry (30-45 min typische Lees tijd voor 96 goed plaat onafhankelijk van het aantal fluorescerende parameters), iv) hoog dynamisch bereik, v) geschikt voor geautomatiseerde hoge doorvoer transfectie en stroom cytometry met behulp van robot armen en HTS platform, VI) snelhardend van gegevens met behulp van een sjabloon voor stroom cytometry vergaderwerkruimte, vii) optimaal voor opschorting en Adherente cellen, viii) eenvoud van het model en de aanpasbaarheid aan luminescentie en plaat lezer metingen (dubbele luciferase Firefly en Renilla) en ix) schaalbaarheid (96 - en 384-well pate formaten).
De neiging van een LRA of een combinatie van lokale en regionale overheden te activeren HIV LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren dus expressie van EGFP en DsRed fluorescerende eiwitten kan worden bestudeerd door cytometry van de stroom met behulp van onze splicing verslaggever van HIV. Echter, voor het testen van de synergie van de roman lokale en regionale overheden, is het sterk aanbevolen om de fysiologische omstandigheden van elke LRA bepalen door het meten van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan een aantal uiteenlopende concentraties van de enkele drug. Daarom is het essentieel te heffen van valse positieven en te verkrijgen van de resultaten van de hoogste kwaliteit met inbegrip van een marker van levende en dode cellen. Een ander belangrijk aspect van stroom cytometry analyse is de compensatie besturingselementen of de FMO. Het is sterk aanbevolen om afzonderlijk gebeitst monsters zorgen voor minimale spill-over van EGFP + bevolking in de DsRed en vice-versa gebruiken. Bovendien is het essentieel aan account voor autofluorescence van de cellen door onbevlekt cellen. Ten slotte, is een regelmatige controle van de prestaties van de cytometer en de gevoeligheid in de detectoren kritische meestal meten wanneer monsters voor een studie die verspreid over een lange periode van tijd.
Hoewel niet besproken in de sectie protocol, zijn er enkele beperkingen van onze splicing verslaggever systeem. Voor een grondiger bespreking, zie onze eerdere publicatie (Khoury et al., 2018). Exporteren van de gedeeltelijk of unspliced varianten van HIV mRNA wordt vergemakkelijkt door de virale eiwitten Rev en de associatie met de Rev responsief Element (RRE) in deze mRNA soorten29,30,31,32. De overexpressie van Rev in ons systeem toegestaan ons te omzeilen de groot blok van nucleaire eigendomsvoorbehoud vermenigvuldigen verbinding aan de randen en unspliced mRNAs waargenomen in latent geïnfecteerde T cellen17 en focus op inzicht in hoe de lokale en regionale overheden induceren transcriptie, egaliseren en lamineren dus de reactivering van virus. Bovendien, gezien het feit dat ons systeem de transfectie van 3 plasmiden vereist, kozen we HEK293T cellen omdat de hoge transfectie efficiëntie van deze cellen. Ten gevolge van de verschillende temporele en ruimtelijke beschikbaarheid van cellulaire factoren in T-cellen ten opzichte van een kanker cellijn, is het belangrijk voor het valideren van de resultaten van de splicing verslaggever verworven in de HEK293T cellen in T-cell lijnen en primaire cellen, die zou kunnen grote bieden technische uitdagingen als gevolg van hun beperkte transfectability. Dus, het gebruik van alternatieve DNA levering reagentia voor Transfectie zoals DMRIE-C, waarin is aangetoond dat het bijzonder effectief zijn voor de transfectie van schorsing cellen (bijvoorbeeld Jurkat), of nucleofection methodes zoals Amaxa nucleofector of Neon transfectie systeem dat zijn bewezen om efficiënte en betrouwbare levering van één of meerdere plasmiden aan moeilijk-aan-transfect cellen, met inbegrip van de primaire CD4 + T cellen. Anderzijds zou het interessant zijn om te testen deze verslaggever-systeem in het kader van full-length virus in een model van de oplaadbare batterij van latentie met de bovengenoemde transfectie methoden. In feite, de verschillen in de beschikbaarheid van host transcriptie, rek, egaliseren en lamineren factoren in een rCD4 + T cel kunnen gevolgen hebben voor de capaciteit van een LRA te activeren van de latente provirus. Ten slotte, ons model verhelpt niet of het LRA transcriptie en splitsen van cellen van de omstander kan beïnvloeden, en of het bevoegde virus replicatie kan veroorzaken. Wij zouden echter vermoeden dat door het meten van een toename van de cel-geassocieerde HIV U.S. en MS RNA, dit tot de productie van de bevoegde virus replicatie in het supernatant van cultuur leiden zou. Dit kan worden bevestigd door het uitvoeren van de goudstandaard kwantitatieve virus uitgroei assay (QVOA)33.
Vanwege de complexe aard van latentie en om ervoor te zorgen efficiënte virus reactivering, mogelijk een veelzijdige combinatorische strategie vereist34. Mogelijke behandeling moet stimuleren meerdere trajecten met inbegrip van transcriptie, egaliseren en lamineren, die eerder is aangetoond dat het spelen een essentiële rol in de oprichting van latency16,35,,36, 37. onze LTR-gedreven splicing verslaggever zou een hoge throughput screening van drugs die optimaal zijn op zowel stappen, transcriptie, egaliseren en lamineren gericht kan, verhogen de kans op het vinden moleculen die kan synergize efficiënt, hetgeen tot een lagere leiden zou dosisniveaus en dus toxiciteit van elk medicijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door projectsubsidie APP1129320 en program grant, APP1052979 van de NHMRC van Australië. Wij danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson en Michelle Y. Lee voor het verstrekken van essentiële constructies en advies voor de succesvolle voltooiing van dit werk. Wij danken het personeel van de DMI Flow faciliteit voor hun advies en genereuze bijstand bij het handhaven van de cytometer van de stroom gebruikt in deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
