Summary
פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.
Abstract
HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה "הלם ולהרוג" נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.
Introduction
למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5' מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,7 ,8. בין LRAs נבדק, HDACi (מעכבי HDAC), מעכבי bromodomain ההימור (בו בטיס) זירוז כרומטין decondensation ושחרור של b גורם התארכות שעתוק חיובי (P-TEFb) בהתאמה, שמוביל הבאים להקל על תעתיק דיכוי-5' LTR והפעלה של HIV ביטוי9,10,11,12,13. עם זאת, סדר הגודל של הפעלה מחדש מושגת על ידי אלה LRAs היה מוגבל רק עלייה צנועה הקשורים תא unspliced HIV mRNA (אותנו RNA), מעידה על שעתוק ויראלי, נצפתה ex-vivo14,15. חשוב לציין, LRAs אלה גם נכשל לזירוז ירידה בשכיחות של תאים נגועים לחשוף.
הביטוי HIV עשוי מוגבלת עוד יותר באמצעות splicing לא יעיל16 , כמו גם פגמים גרעיני הייצוא של הכפל משולבים HIV RNA (MS RNA)17. לפיכך, נדרשים זיהוי שיעורים חדשים של LRAs זה יותר חזקות והוא יכול להשפיע על היבטים שונים של נגיף אינטגרציה שלאחר הייצור. בנוסף, נדרש הפיתוח של מבחני הרומן המסייעים הגדרת תרכובות האופטימלית להפוך ביעילות את זמן השהיה.
. הנה, פרוטוקול מוצג, אשר משתמשת בגישה תפוקה גבוהה להערכה תפקודית של ההשפעה של התערבויות על שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור. בקצרה, דואלי מונחה-LTR חדש צבע הכתב מערכת pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (איור 1) משמש כדי להעריך HIV הפעלה מחדש על ידי cytometry זרימה. כתבת פלורסנט, הביטוי של HIV unspliced mRNA (4kb) מוביל לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP), ואילו הביטוי של mRNA משולבים (2 kb) יוביל ביטוי חלבון פלואורסצנטי Discosoma sp. אדום (DsRed). בקצרה, השתמשנו של חלבון כימרי פלורסנט Env-EGFP, gp140unc. ? EGFP, איפה רצף קידוד של EGFP בוצעה במסגרת עם צורה cleaved האו ם, קטום של המעטפה (מעטפה). הוכנסו שינויים כדי ablate האתר המחשוף מונע את הדיסוציאציה של מעטפה עבה לתוך gp120, gp41-EGFP, וכדי לעגל את החלבון gp160 לפני התחום transmembrane יצירת אנלוגי Env מסיסים, המאפשרת את הקיפול הנכון, ביטוי של EGFP. על הביטוי בתוך תא, Rev. רגישה את הגרעין איפה זה שמתווכת גרעיני cytoplasmic הייצוא של 4 kb env mRNA דרך האינטראקציה עם הרכיב להגיב rev (הכנה). העיגול של מעטפה לא מתפשרים על הכנה, הנמצא בין gp120, gp41 A7 3' אחוי באתר. במערכת זו, החדרת ב- HIV-1 אחוי התורם 4 (SD4), אחוי מקבל 7 (SA7) תוצאות בייצור של 2 קילובתים mRNA קידוד חלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה חלבון פלואורסצנטי DsRed, RevΔ38-DsRed. בקצרה, DsRed הוכנס לתוך אקסון 2nd של Rev-חומצת אמינו 38 מאת חפיפה סיומת18. כדי להקל על הייצוא הגרעין של unspliced mRNA, וקטור ביטוי בתרבית של קידוד Rev (pCMV-RevNL4.3) היה שותף transfected עם הבונה כתב פלורסנט (איור 2). המבנה הזה, כתב ייחודי המתוארים כאן הוא שימושי תפוקה גבוהה הערכה של HIV שעתוק שחבור, ללא הצורך להשתמש וקטורים ויראלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: נהלי שכפול, שינוי, רצף הם דנו במקום18,19. הפרוטוקולים בזאת מתחילים מ תקנים של הווקטורים בתרבית של הביטוי (איור 3).
1. תרביות תאים תאים HEK293T עם כתבת צבע כפול לבנות
- לטפח HEK293T תאים הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 μg/מ"ל) בחממה2 CO 5% ב 37 º C. לאחר מפשיר, מעבר תאים HEK293T 2 - 3 פעמים לפני השימוש בהם תקנים ניסויים. זה ייתן את הזמן תאים כדי להתאושש מההליך שהביקושים.
התראה: Mycoplasma זיהום של תרביות תאים נשאר בעיה רצינית. מעבדה ובדיקות שגרתיות של תרביות תאים חיוניים כדי להקטין את הסיכון של זיהום mycoplasma למנוע דיפוזיה20. - לפצל את התאים 1:2 יום אחד לפני זריעה, להעביר אותם לתוך בינוני DMEM טריים. לטפח את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
- יום לפני תרביות תאים, להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם פוספט buffered (DPBS) תמיסת Dulbecco חינם של סידן (Ca2 +), מגנזיום (Mg2 +) כדי להסיר שאריות של סרום.
- לוותר על 5 מ של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) לתוך כלי תרבות ולמקם אותו ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 5% למשך 2-5 דקות.
- כאשר התאים מנותקים, הוסף 5 מ של DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS נוסף לעכב פעילות טריפסין אשר עלולה לגרום נזק לתאים.
- Resuspend בעדינות על-ידי pipetting התליה תא למעלה ולמטה כדי לשבור את הגושים.
- לדלל 1:10 תאים ב- trypan blue הכתם (0.4%).
- לסמוך על תאים חיים זה לא תופסים trypan blue באמצעות מיקרוסקופ (המטרה x 10) ו- haemocytometer.
- לחשב את מספר התאים קיימא למיליליטר על-ידי לקיחת הממוצע של ספירת הכפלת זה 10,000, על-ידי הגורם דילול (1:10) מ trypan blue כתם.
- לוחית רישוי 2 x 10 תאים4 ב 100 μL בינוני DMEM בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה עבור 24 שעות.
- עבור כל טוב, לדלל 400 ננוגרם של pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng של pCMV-RevNL4.3 ו- 100 ננוגרם של pCMV-Tat101AD8-דגל DNA ב μL 50 בינוני חינם סרום. מערבבים בעדינות. לניסויים ללא Tat, להשתמש שהותאמו ריק Tat וקטור pcDNA3.1 (-).
הערה: השימוש של DNA ללא אנדוטוקסין מומלץ מאוד. בשביל זה, להכין ללא אנדוטוקסין DNA באמצעות ערכת טיהור חומצת גרעין midi או maxiprep. לקבוע את הטוהר DNA על ידי מדידת היחס OD 260/280, אשר צריכה להיות בין 1.7 1.9. - לערבב הכימית השומנים בעדינות לפני השימוש, ולאחר מכן לדלל 0.65 μL ב μL 50 בינוני חינם סרום. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשלב את ה-DNA מדולל עם הכימית השומנים מדולל.
- לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון עשוי להופיע מעונן.
הערה: המשך לצעוד 1.15. בתוך 30 דקות. - לוותר על μL 100 לכל טוב של מתחמי ריאגנט-DNA השומנים drop-wise על גבי התאים.
- מערבבים בעדינות במוזיקת את הצלחת אחורה וקדימה.
-
דגירה את הצלחת. בשביל 5 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.
- כל תערובת התגובה מספיקה עבור תרביות תאים ובכן יחיד (96-ובכן). התאימו את כמות הנפח של רכיבים לפי מספר תרופות ושילוב זה להיבדק ואת חשבונות עבור וריאציות pipetting. כל התנאים נבדקים בדרך כלל ב- triplicates.
- Transfect בארות נוספות עם 100 ננוגרם של מונחי-CMV פלסמיד EGFP ו- DsRed-אקספרס DNA למטרות פיצויים.
2. טיפול Transfected HEK293T תאים עם השהיה היפוך סוכנים
הערה: לפני כל assay, לקבוע מצב פיזיולוגי כל איירה על ידי מדידת הכדאיות של התאים לאחר חשיפה למינון גבוה ונמוך של התרופה עם תא התפשטות וזמינותו.
- לדלל כל איירה לריכוז עבודה המתאימה עם מדיום הגידול (למשל, μM 1 עבור JQ1(+)).
התראה: לשקם את הסמים lyophilized עם הממס המתאים כדי ריכוז של 10 מ מ. החנות כל המניות LRAs ב-80 מעלות צלזיוס אחת להשתמש aliquot (5 μL כל אחד) על מנת להימנע חזר מחזורי מפשיר לקפוא. - בזהירות תשאף תרביות תאים בינוני עם רב-ערוצי והחלף 100 בינוני μL המכיל המתאים איירה (טבלה 1). הוסף בינוני מאוד בעדינות לצד הקיר היטב כדי למנוע ניתוק התאים HEK293T transfected, אשר ידועים להתנתק בקלות מהמשטח צלחת תרבות.
- דגירה את הצלחת. בשביל 48 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.
3. צביעת תאי Transfected עם הכדאיות ניתן לתיקון צבע לניתוח Cytometry זרימה
התראה: הסרת תאים מתים ופסולת חיוני כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות וכדי להשיג תוצאות באיכות הגבוהה ביותר.
- ניתוק התאים לתוך המדיה באמצעות μL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב ועל ידי בעדינות pipetting שיהיה (~ 5 פעמים) עם רב-ערוצי תוך הימנעות קצף של המדיה. אם יש צורך, ניתוק התאים מהצלחת באמצעות 35 µL לאדם טוב של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) ו המקננת 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני נטרול בינונית המכיל סרום.
- העבר את התאים צלחת V-התחתון 96-ובכן.
- לסובב את התאים עבור 5 דקות ב x 500 גרם ב 4 ° C, אז בזהירות וארוקן את בינוני/PBS בלי לגעת בתאים.
- לשטוף את התאים זמן לפחות 1 עם μL 200 ל- PBS חינם חלבון/סרום.
- צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע על-ידי הטיית הלוח והסרה המאגר שטיפת בלי לגעת בתאים.
- הכן הפתרון עובד של צבע הכדאיות ניתן לתיקון על ידי דילול 1:1000 לצבוע את הכדאיות ב- PBS חינם חלבון/סרום. להכין µL 50 של הכתם מדולל לכל טוב.
הערה: הכדאיות צבעים זמינים במגוון צבעים מתאים לשימוש עם לייזרים כחול, אדום וסגול. להכין פתרון מניות של צבע הכדאיות שניתן לתקן על-ידי resuspending בקבוקון אחד של לצבוע lyophilized (רכיב A) עם 50 μL נטול מים דימתיל סולפוקסיד (רכיב B). חנות ב-20 ° C בשימוש אחד aliquot (1 μL כל), מוגן מפני האור. - להוסיף 50 μL של צבע מדולל הכדאיות כל טוב ומערבבים את התאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עם רב-ערוצי.
- . הכתם למשך 10-15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני האור...
- לשטוף 1 - 2 פעמים עם 150 μL שטיפת מאגר (PBS עם EDTA אלבומין ו- 2 מ מ פרה 1%).
- צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- לתקן את התאים μL 100 פורמלין 1% שזה עתה הוכנו במאגר שטיפת למשך 10-15 דקות ב 4 ° C בחושך.
התראה: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד. להכין 1% פתרון פורמלדהיד ברדס fume כדי למנוע שאיפת בעת לבישת כפפות ומשקפיים בטיחות להגנה. - לשטוף את התאים 1 - 2 פעמים עם 100 μL שטיפת מאגר.
- צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב- 70 μL שטיפת המאגר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. תאים קבוע עשויה להיות מאוחסנת ב 4 ° C בחושך לניתוח למחרת על cytometer הזרימה.
4. EGFP ומדידות DsRed על ידי Cytometry זרימה וניתוח נתונים
הערה: לנתח HIV שעתוק (% EGFP) ו- splicing (% DsRed) על cytometer זרימה. לסנן את הדגימה לפני ההפעלה עם תא-מסננת 70 μm או 100 μm רשת ניילון כדי להימנע שחוסמים את הזרבובית.
- להתחיל את cytometer ואת המחשב לפחות 10 דקות לפני השימוש, כדי להבטיח לייזרים להתחמם.
- לפני הפעלת דגימות, מתחיל קירור והקפאה, למלא את מיכל הנרתיק עם תמיסת 0.9%, לוודא לוח נתרן תת-כלורי מתווספת למיכל פסולת.
- בדוק את התא זרימה בועות אוויר.
- ודא גלאי ומסננים המתאימים לניסוי.
הערה: EGFP, לשימוש של לייזר כחול (488 ננומטר), 530/30 bandpass, בעוד DsRed אקספרס מזוהה בצורה אופטימלית באמצעות לייזר צהוב (561 ננומטר) ו bandpass 610/20. לייזר כחול (488 ננומטר) 610/20 bandpass יכול לשמש גם כדי לזהות ביטוי DsRed. - בדוק את הביצועים cytometer ואת רגישות על פני גלאי על-ידי הפעלת כיול חרוזים.
- התאם פארווערטס (FSC-A) ואת הצד המתחים פיזור (האס-A) עם מוכתם. דוגמה כך האוכלוסייה העיקרית היא על המסך, ניכרת בבירור.
הערה: FSC (אור מפוזר-קדימה) הוא מידה של אור עקיפה ב זווית שטוחה, אשר תלויה הנפח של התא (תא שטח או גודל), בעוד האס (צד-מפוזרים אור) היא מדידה של שבירת אור ב זווית ישרה, אשר הוא יחסי תא צפיפות והמורכבות פנימי. - לבצע פיצוי הידנית או האוטומטית באמצעות דגימות שהוכתמו יחיד הבטחת והתאמת מינימלי מאוכלוסיית EGFP + גלאי DsRed או להיפך.
התראה: למטרות פיצויים, להשתמש במדגם של תאים המבטאים כל אחד חלבון פלואורסצנטי צבע אחד, כמו גם תאים ביחידים מוכתם לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. אל תשתמש FITC ו- PE חרוזים פיצוי עבור EGFP ו- DsRed חלבונים פלורסנט פיצויים בשל מאפיינים ספקטרלי שונים. פקדים הפיצוי צריך להיות מספיק פיקח כדי לפתור האוכלוסייה חיוביים ושליליים. - יצירת מגרשים ולהגדיר את השערים בעזרת קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד פקדים (FMO).
- לרכוש ולהקליט למינימום של 10,000 אירועים תא קיימא עבור דגימה. דוגמאות לרוץ במהירות בינונית או נמוכה כדי להימנע doublets עובר דרך נקודת החיתוך בלייזר. השתמש הדופק הגיאומטריה gating כגון האס-A מול האס-H כדי לחסל את doublets. לבדוק את היציבות המרוץ ידי הזמן נגד האס-A כדי לראות כיצד גם זרימת היא במהלך הריצה.
- בסוף המרוץ, לנקות את פלואידיקה cytometry זרימה עם חומרי ניקוי מרוכז ואז מים במשך 5 דקות.
- לכבות את המערכת, להשליך את הפסולת ולמלא מחדש את מיכל הנרתיק לאחר הרכישה.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים cytometry זרימה. לא לכלול שאריות תאים, סבך (doublets) המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד, ואז לחסל את התאים המתים בעזרת כתם צבע הכדאיות (שלילית האוכלוסייה = תאים חיים). לזהות את התאים לבטא EGFP ו- DsRed (איור 4), כמו גם האחוזים של המוצר משולבים DsRed /(DsRed + EGFP) (איור 5).
- לקבוע את ההשפעה של אתה בטוח על HIV שעתוק ו שחבור על-ידי השוואת לא מטופל תאים והתאים נחשף הפרט או שילוב של LRAs (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נציג התוצאות מוצגות באיור 5 עבור הביטוי של HIV-1 unspliced (EGFP), משולבים המוצרים (DsRed) בעקבות טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1. הן JQ1(+) והן בלשכת המידע לתיירים הגדילה משמעותית את אחוז התאים לבטא EGFP (FC 2.18 ו 4.13 מעל דימתיל סולפוקסיד בהתאמה; n = 3) מעידה על תעתיקים unspliced. יתר על כן, JQ1(+) גדל באופן משמעותי את אחוז התאים לבטא DsRed (46.6 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) כמו גם היחס משולבים המוצר (7.37 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) לרמה דומה מידה (FC 59.6 ו 5.83 מעל דימתיל סולפוקסיד, בהתאמה) המאשרת את היכולת של JQ1(+) כדי להפעיל HIV שעתוק ו שחבור. מצד שני, טיפול באמצעות הפקד stereoisomer JQ1(-) מבטל JQ1(+) השפעה על HIV שעתוק ו שחבור המאשרת את ההצלחה של הפרוטוקול.
בפרסום האחרון, אנחנו הראו על ידי ניתוח RNA הצטברות של HIV משולבים תעתיקים בעקבות טיפול JQ1(+)21. למעשה, הנתונים שלנו גילה שינויים עקביים ברמות של העותק unspliced, משולבים היו מראות על-ידי הביטוי חלבון EGFP ו- DsRed במודל זה לאחר הטיפול עם JQ1(+). תוצאות אלו מצביעות על EGFP ו- DsRed לבטא תאים לשקף את היכולת של החומר המדכא bromodomain JQ1(+) לזירוז HIV שעתוק ו שחבור.
לסיכום, נוכל לאמת את השימוש pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed כתב מלכודת תפוקה גבוהה להערכת השפעת LRAs על HIV-1 שעתוק ו שחבור. כמות תת אופטימלית של איירה או רעילות מוגבר יכול להוביל לתוצאות סקאד. מיטוב את כמות התרופה תוך שמירה על יכולת הקיום התא יכול לשפר את הדיוק של התוצאות.
איור 1: סכימטי של המודל משמש כדי לקבוע את ההשפעות של השהיה היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR ו שחבור. מבטא לבנות LTR שחלבון מעטפת unspliced (מעטפה) או דבוקה משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) או משולבים Δ38rev חלבון עם DsRed. איור זה יש הודפס ח'ורי ואח21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בונה עיצוב. PLTR.gp140/EGFP (א). RevΔ38/DsRed כתב splicing מאפשר הביטוי של המעטפה דבוקה EGFP (gp140-EGFP) וחלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה DsRed חלבון פלואורסצנטי (RevΔ38-DsRed). PCMV-Rev (B)NL4.3 מאפשר הביטוי של חלבונים Rev. PCMV-Tat101 (ג)AD8-דגל מאפשר הביטוי של חלבונים Tat101(AD8) עם דגל-תג C-מסוף. פלסמידים הביטוי נבנות באמצעות PCR חופף ואת הגבלת תקציר. כל מפות וקטור נוצרו באמצעות תוכנת SnapGene , גירסה 4.1.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Assay עיצוב עבור הערכה מהירה של HIV השהיה היפוך סוכנים. השיטה הנוכחית להערכת השפעת LRAs על HIV-1 שעתוק ו שחבור כולל i) זריעה של תאים HEK293T יום אחד לפני השני) תרביות תאים עם ביטויים וקטורים ואחריו טיפול איירה iii). iv) תאים מנותחים על-ידי לזרום cytometry 48 שעות שלאחר הטיפול. באמצעות פרוטוקול זה, 32 (בטריפליכאט) לתנאים 96 נבדק לכל צלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: נציג דוגמה צלחת הקמה לחצנים הדרושים. עמודות 1 עד 3 שיתאימו שלילי (-) פקדים עם אין סמים, הממס היחידה (דימתיל סולפוקסיד 1:5000) כמו גם חיובית (+) פקדים כגון תאת (100 ng), ובחום/פא = phorbol פעילים אצטט/phytohaemagglutinin (10 ננומטר ובחום, 10 μg/mL פא), JQ1 (+ /-) (1 μM), וור = vorinostat ( 0.5 μM), במחבת = panobinostat (30 ננומטר). LRAs לא ידוע נבדקים שהפקידים מעל טווח ריכוז (15.625 כדי 1000 ננומטר). למטרות פיצויים, תאים המבטאים כל אחד החלבון הניאון צבע יחיד (EGFP + ו DsRed +-) כמו גם תאים מוכתם לצבוע הכדאיות ואת התאים מוכתם כלולים כל הפעלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור 4: Gating אסטרטגיה המשמש cytometry זרימה. בשלב הראשון של האסטרטגיה המגביל מבוססת על פיזור קדימה ואת הצד, אשר מאפשר את ההבחנה של התאים עניין בהתבסס על גודל ומאפייני צפיפות של תאים אלה. מומלץ כי זה gating להיות נדיבה ככל האפשר כדי לכלול את כל האירועים, בעת הסרת פסולת הסלולר ותאים מתים, אשר נמצאים בפינה השמאלית התחתונה של העלילה צפיפות. ואז להסיר doublets ערכת הנתונים באמצעות הגיאומטריה הדופק המגביל, האס-A מול האס-H ו לצמצם עוד יותר התאים הפועלים באמצעות לצבוע הכדאיות. לבסוף, ערוץ ה-dump (סגול), EGFP או DsRed משמשים להגדרת תאים עניין. השימוש של קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד פקדים (FMO) הם קריטיים הגדרת האוכלוסייה של הריבית, בנושא והתאמת מ fluorochrome עוד ערוץ של עניין. לאחר הרכישה, ניתוח נתונים באמצעות תוכנה ניתוח נתונים של cytometry זרימה. איור זה יש הודפס שוב בטופס מותאם ח'ורי ואח21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: התוצאות נציג של ההשפעה של מעכבי bromodomain על איידס שעתוק ו שחבור. (א) דוגמאות של שני-פרמטר כפול צבע זריחה EGFP לעומת DsRed צפיפות מתווה מתאי untransfected (-Tat), תאים transfected עם 100 ננוגרם של pCMV-Tat101AD8-דגל (+ Tat) ותאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד, JQ1 (+) או JQ1 (-). (B) הממוצע באחוזים (%) של תאים לבטא EGFP, DsRed או מוצר משולבים (DsRed / DsRed + EGFP) מ- 3 ניסויים עצמאית מוצג. השוואות של כל תנאי כדי דימתיל סולפוקסיד נעשו באמצעות מבחן 2-way ANOVA. רק מוצגות השוואות משמעותיים מבחינה סטטיסטית. p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001. הקווים השחורים מייצגים את mean±SEM. דימתיל סולפוקסיד (1:5000), JQ1 (+) ו- JQ1(-) (1 μM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O'Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכשר וירוסים22. המודל התנאים הפיזיולוגיים של HIV השהיה ב נח CD4 + T תאים, מערכות כתב פלורסנט כפול התפתח כמו הכתבת RGH (אדום-ירוק-HIV) שפותחה על ידי הקבוצה של איוון סדוסקי עם סמן מונחה-LTR איסור פרסום-eGFP, mCherry מונחה-CMV במקום של Nef23. דומה וירוס כתבת צבע כפול, דואו-Fluo, פותחה על ידי אי Verdin מעבדה עם ביטוי EGFP מונחה-LTR, סמן פלורסנט mCherry מונע על ידי יזם EF1α24. במערכת זו, EGFP הוכנס בקצה 3' של provirus במקום Nef. המחיקה במעטפה. שתי מערכות אלה מונעת מספר סיבובים של זיהומים. יתר על כן, השילוב של שני החלבונים פלורסנט מאפשר הזיהוי באופן פרודוקטיבי (eGFP + mCherry +) ולא לחשוף (eGFP - mCherry +) נגוע תאים. עם זאת, מספר חסרונות של וירוסים כתבת צבע כפול היו מורגש בתאי CD4 + T כפי הזיהום הישיר של תאים נגועים לחשוף תלויה ברובה המדינה ההפעלה הסלולרית של תאי-T23,24. למעשה, שיעור נמוך מאוד של זיהום נצפתה באמצעות וירוסים אלה כתב שני נח CD4 + T תאים: 0.1% עבור RGH23 ו- 0.2% עבור DuoFluo25. בנוסף, כמו נגד הציטומגלו-וירוס הוכח יזם לבוא לידי ביטוי ברמות נמוכות של תאים שלא הופעל26,27,28, CMV לא פעיל או יזם EF1α יוביל underestimation של הנגועים לחשוף אוכלוסיות.
אנחנו שנוצר, מאופיין וקטור כתב HIV חדשים ללמוד בהקמת השהיית הפעלה מחדש וירוס ב וזמינותו תפוקה גבוהה. מספר יתרונות לשיטה ההקרנה שלנו כוללים i) עלות תועלת עם היכולת להעריך שעתוק ו שחבור בו זמנית, ii) את היכולת לבדוק מספר רב של תרופות או שילובים בניסוי יחיד, הערכת iii) מהירה השפעת LRAs על ידי cytometry זרימה (30-45 דקות טיפוסי קריאה זמן לצלחת טוב 96 עצמאית של מספר פרמטרים פלורסנט), הרביעי) טווח דינמי גבוה, v) מתאים אוטומטיות תפוקה גבוהה תרביות תאים, cytometry זרימה באמצעות הרובוט נשק ו HTS פלטפורמה, ריפוי מהיר vi) של נתונים באמצעות תבנית סביבת cytometry זרימה, השביעי) אופטימלי עבור השעיה ו תאים חסיד, השמיני) הפשטות של המודל לבין הסתגלות הפריה חוץ גופית וצלחת מדידות הקורא (גחלילית לוציפראז כפול ו- Renilla), ix) מדרגיות (96 - ו -384-ובכן פייט תבניות).
הנטייה של חשבון גמלאות אישי או בשילוב של LRAs להפעלת שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור ובכך EGFP ו- DsRed ביטוי חלבונים פלורסנט יכולה להיבדק על ידי cytometry זרימה באמצעות הכתבת splicing HIV. עם זאת, לפני בדיקות הסינרגיה של הרומן LRAs, מומלץ לקבוע את התנאים הפיזיולוגיים של איירה כל על ידי מדידת הכדאיות של התאים לאחר חשיפה למגוון של ריכוזים של הסם יחיד. לכן, כולל סמן של תאים מתים וחיים הוא חיוני כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות וכדי להשיג תוצאות באיכות הגבוהה ביותר. היבט חשוב נוסף של ניתוח cytometry זרימה הוא פיצוי פקדים או FMO. מומלץ מאוד להשתמש דגימות ביחידים מוכתם הבטחת והתאמת מינימלי מאוכלוסיית EGFP + DsRed או להיפך. יתר על כן, זה חיוני לחשבון עבור autofluorescence של התאים על-ידי הכללת תאים וללא רבב. לבסוף, פקד רגיל של ביצועים cytometer, רגישות על פני גלאי היא קריטית בעיקר כאשר מדידת דוגמאות למחקר המתפרסות על-פני תקופה ארוכה של זמן.
אמנם לא נדון בסעיף הפרוטוקול, יש מספר מגבלות של מערכת הכתב splicing שלנו. לדיון מעמיק יותר, נא עיין שלנו הפרסום הקודם (ח'ורי ואח ', 2018). ייצוא של חלקית או גרסאות unspliced של ה HIV-mRNA בהנחייתם של חלבון נגיפי Rev ו את השיוך שלו עם Rev מגיב רכיב (הכנה) ב אלה mRNA מינים29,30,31,32. ביטוי של Rev במערכת שלנו מאפשרת לנו לעקוף את הרחוב העיקריים של גרעיני השמירה של המכפיל משולבים ו unspliced mRNAs שנצפתה נגוע לחשוף תאי T17 ונוחות על הבנת איך LRAs זירוז שעתוק ו שחבור לפיכך וירוס הפעלה מחדש. בנוסף, לאור העובדה המערכת שלנו דורש תרביות של תאים של פלסמידים 3, בחרנו HEK293T תאים כי יעילות גבוהה תרביות תאים תאים אלה. בשל הזמינות הטמפורלי, מרחביים שונים הגורמים הסלולר בתאי T לעומת קו תא סרטן, זה חשוב לאמת את התוצאות של הכתב splicing רכשה בתאים HEK293T T-cell שורות ותאים הראשי, אשר עשוי לספק נהדר האתגרים הטכניים עקב שלהם transfectability מוגבל. לכן, השימוש של ריאגנטים משלוח DNA חלופי עבור תרביות תאים כגון DMRIE-C, אשר הוכח כיעיל במיוחד עבור תרביות תאים של הבולם תאים (למשל, Jurkat), או שיטות nucleofection כמו Amaxa nucleofector או ניאון מערכת תקנים שהוכחו להקל על העברת יעיל ואמין של יחיד או של פלסמידים מרובים לתאים קשה-עד-transfect כולל ראשי CD4 + T תאים. לחלופין, יהיה מעניין לבחון את המערכת כתב בהקשר של וירוס באורך מלא במודל של התא העיקרי של השהיה באמצעות השיטות הנ ל תרביות תאים. למעשה, ההבדלים בזמינות של המארח שעתוק, התארכות, החדרת גורמי בתא T rCD4 + עשוי להשפיע על הקיבולת של חשבון גמלאות אישי כדי להפעיל מחדש את provirus סמויה. בסופו של דבר, המודל שלנו אינו עוסק אתה בטוח יכול להשפיע על שעתוק ו שחבור של תאים הצופה מהצד, והאם זה יכול לגרום וירוס המוסמכת שכפול. עם זאת, אנו חושדים כי על ידי מדידת עלייה הקשורים תא HIV בארה ב ו MS-RNA, זה יוביל לייצור של שכפול הוירוס המוסמכת ב תגובת שיקוע תרבות. זה יכול להיות מאושרות על ידי עורכים את תקן זהב וירוס כמותית תוצר assay (QVOA)33.
בשל האופי המורכב של חביון ולהבטיח הפעלה מחדש וירוס יעיל, אסטרטגיה רבת קומבינטורית עשוי להיות צורך34. טיפול פוטנציאלי צריך לעורר מספר מסלולים כולל תמלול, החדרת, אשר הוכח בעבר לשחק תפקידים חיוניים להקמת השהיה16,35,36, 37. כתב splicing מונחה-LTR שלנו תאפשר הקרנה תפוקה גבוהה של תרופות שיכולות היעד בצורה אופטימלית צעדים, תמלול והן שחבור, יגדיל את הסיכוי של מציאת מולקולות יכול מהצטלבות ביעילות, שתוביל נמוך יותר רמות מינון ובכך רעילות של כל תרופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג'ני ל' אנדרסון ולי י' מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
