Summary
Высокая пропускная способность протокол для функциональной оценки ВИЧ эффективного возобновления и распродажа скрытой proviruses описано и применяется тестирование воздействия мероприятий по ВИЧ транскрипции и сплайсинга. Представитель результаты эффекта задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга предоставляются.
Abstract
ВИЧ остается неизлечимой вследствие существования водохранилища клетки, который затаивает стабильной и скрытая форма вируса, который остается невидимым для иммунной системы и не является объектом текущего антиретровирусной терапии (корзину). Было показано, что транскрипция и сплайсинга укрепить задержки ВИЧ-1 в отдыха CD4 + Т-клеток. Реверсирование задержки с помощью задержки разворота агентов (МРВ) в «шока и убить» подход подробно изучена в попытке очистить этот водоем, но показал таким образом далеко не любой успех в клинических испытаниях из-за отсутствия развития адекватного малых молекул, которые могут эффективно возмущают это водохранилище. Представленные здесь протокол предоставляет метод для надежно и эффективно оценки задержка разворота агентов (МРВ) на транскрипцию ВИЧ и сплайсинга. Этот подход основан на использовании LTR-driven двойной цвет репортер, который может одновременно измерить эффект ЛРА на транскрипции и сплайсинга проточной цитометрии. Протокол, описанные здесь является адекватным для адэрентных клеток, а также клеток в суспензии. Это полезно для тестирования большое количество наркотиков в высокой пропускной способности системы. Метод является технически простой для выполнения и экономически эффективным. Кроме того использование проточной цитометрии позволяет оценить жизнеспособность клеток и таким образом наркотиков токсичности в то же время.
Introduction
Несмотря на эффективную долгосрочную антиретровирусной терапии ВИЧ сохраняется в состоянии скрытой как комплексной Провирус в памяти клеток CD4 + T1. Структура хроматина ВИЧ-1 5' долго терминала повторить (LTR) промоутер и Эпигенетические модификации, такие как метилирование гистонов и диацетилморфина ДНК methyltransferases (DNMT) и гистонов комплексы (HDAC) являются важными механизмами, ведущих к транскрипционный анализ репрессий и, таким образом, задержка после интеграции2,3. Большое разнообразие задержка обратного агентов (МРВ) исследована для их эффективности побудить вирус производства в пробирке и в естественных условиях от латентно инфицированных отдыха CD4 + T клетки4,5,6,7 ,8. Среди МРВ испытания, HDACi (ингибиторы ГДАЦ) и ставка bromodomain ингибиторы (Бетис) вызвать decondensation хроматина и выпуска позитивные транскрипции удлинение фактор b (P-TEFb) соответственно, ведет к последующей освобождает от транскрипционный анализ репрессии на 5' LTR и активации ВИЧ выражение9,10,11,12,13. Однако масштабы оживления, достигнутый этими МРВ был ограничен, как было отмечено лишь незначительное увеличение связанные ячейки unspliced ВИЧ мРНК (нас РНК), свидетельствует о вирусных транскрипции, ex vivo14,15. Важно отметить, что эти МРВ также удалось вызвать снижение частоты латентно инфицированных клеток.
ВИЧ выражение может быть ограничено неэффективных сплайсинга16 , а также дефекты в ядерного экспорта умножить сращивания РНК ВИЧ (РНК MS)17. Таким образом необходимы выявления новых классов МРВ, которые являются более мощными и могут влиять на различные аспекты вируса производства после интеграции. Кроме того развитие новых анализов, которые помогают определение оптимального соединения эффективно обратить задержка не требуется.
Здесь представлен протокол, который использует подход высокой пропускной способностью для функциональной оценки воздействия мероприятий по ВИЧ LTR-driven транскрипции и сплайсинга. Короче говоря новой инициативе LTR двойной цвет репортер системы pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (рис. 1) используется для оценки ВИЧ реактивации проточной цитометрии. В этом флуоресцентные репортер выражение unspliced ВИЧ мРНК (4 КБ) приводит к расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) выражение, в то время как выражение mRNA сращивания (2 kb) приведет к выражению флуоресцентный белок Discosoma sp. красный (DsRed). Вкратце мы использовали флуоресцентный протеин сплавливания Env-EGFP, gp140unc. EGFP, где кодирующая последовательность EGFP был помещен в рамку с ООН рассеченного и усеченной форме конверта (Env). Изменения были введены к удалять сайт расщепления, предотвращая диссоциации Env в gp120 и gp41-EGFP и усечение гп160 белка до трансмембранного домена, создание растворимых Env аналог, который облегчает правильно складывать и выражение EGFP. Выражение в ячейке, Rev локализуется в ядро, где она является посредником при ядерной цитоплазматического экспорта 4 КБ env мРНК через взаимодействие с элементом гибкой rev (RRE). Усечение Env не компромисс RRE, который лежит между gp120 и gp41 и A7 3' сращивания сайта. В этой системе, сплайсинга ВИЧ-1 сращивания доноров 4 (SD4) и сращивания акцептора 7 (SA7) результатов в производстве 2 КБ мРНК кодирования нефункциональные Rev белка, усечены в аминокислоту 38 сливается с DsRed флуоресцентный белок, RevΔ38-DsRed. Вкратце DsRed был вставлен в 2-го экзона Rev на аминокислоты 38 путем перекрытия расширение18. Чтобы облегчить ядерного экспорта unspliced мРНК, млекопитающих выражение вектор кодирования Rev (NL4.3pCMV-Rev) была совместно transfected с помощью флуоресцентных репортер конструкции (рис. 2). Этот уникальный репортер конструкции, описанный здесь полезен в высок объём оценки ВИЧ транскрипции и сращивания, без необходимости использования вирусных векторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Процедуры для клонирования, трансформации и последовательности, рассматриваются в других18,19. Протоколы здесь начинаются от трансфекции млекопитающих выражение векторов (рис. 3).
1. transfection клеток HEK293T с двойной цвет репортер построить
- Культивировать клетки HEK293T в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) в 5% CO2 инкубатора 37 ° c. После оттаивания, клетки HEK293T проход 2 - 3 раза перед их использованием в трансфекции экспериментов. Это даст время клетки, чтобы оправиться от размораживания процедуры.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Серьезной проблемой остается загрязнение микоплазмы клеточных культур. Существенно важное значение для снижения риска загрязнения микоплазмы и избежать распространения20надлежащей лабораторной практики и регулярное тестирование клеточных культур. - Разделение клетки один день 1:2 до посева и перенести их в свежие DMEM среднего. Культивировать клетки для 24 h в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- За день до трансфекции, удалить носитель из колбы стремлением и мыть клетки с Дульбекко фосфат буфер солевой раствор (DPBS) свободного кальция (Ca2 +) и магния (Mg2 +), чтобы удалить следы сыворотки.
- Обойтись 5 мл раствора (0,05% - 10 мм в PBS) трипсина ЭДТА в сосуд культуры и поместите его при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 2-5 мин.
- Когда клетки отсоединены, добавьте 5 мл DMEM дополнена 10% (v/v) FBS далее подавляют активность трипсина, которые могут повредить клетки.
- Нежно ресуспензируйте, закупорить суспензию клеток вверх и вниз, чтобы порвать пряди.
- Развести 1:10 клеток в Трипановый синий краситель (0,4%).
- Количество живых клеток, которые не занимают Трипановый синий с помощью микроскопа (10 x цель) и haemocytometer.
- Рассчитать количество жизнеспособных клеток на миллилитр, принимая среднее число ячеек и умножив его на 10000 и коэффициент разрежения (1:10) от Трипановый синий краситель.
- Пластина 2 х 104 клетки в 100 мкл DMEM среды с 10% FBS без антибиотиков в 96-луночных плоскодонные пластина для 24 h.
- Для каждой скважины, разбавить 400 нг pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 нг pCMV-RevNL4.3 и 100 нг pCMV-Tat101AD8-флаг ДНК в 50 мкл сыворотка бесплатно среды. Осторожно перемешать. Для экспериментов без ТАТ используйте соответствующий пустой pcDNA3.1 вектор ТАТ (-).
Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать эндотоксинов свободной ДНК. Для этого подготовьте с помощью midi или maxiprep комплект для очистки нуклеиновых кислот ДНК, эндотоксинов бесплатно. Определите чистоту ДНК путем измерения коэффициента ОД 260/280, который должен быть между 1.7 и 1.9. - Перемешать Реагент липидов нежно перед использованием, а затем разбавляют 0,65 мкл в 50 мкл сыворотка бесплатно среды. Осторожно перемешать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Объединить разреженных ДНК с реактивом разреженных липидов.
- Осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Решение может появиться Облачно.
Примечание: Перейдите к пункт 1.15. в течение 30 мин. - Отказаться от 100 мкл на хорошо реагент ДНК комплексы липидов каплям на верхней части клетки.
- Смешайте нежно покачиваясь пластину и обратно.
-
Инкубировать пластину для 5 h в 5% CO2 увлажненные инкубатора 37 ° c.
- Каждый микс реакции достаточно для transfection одной скважины (96-луночных). Настройте объем и количество компонентов в зависимости от количества наркотиков и комбинацию, которая будет испытываться и счета для дозирования вариации. Все условия обычно проверяются в triplicates.
- Transfect дополнительные скважины с 100 нг ЦМВ driven EGFP и DsRed-Экспресс ДНК плазмиды для целей компенсации.
2. Лечение Transfected HEK293T клеток с задержкой вспять агентов
Примечание: До калибровочных определите физиологического состояния каждого ЛРА путем измерения жизнеспособности клеток после воздействия высоких и низких доз препарата с распространением assay клетки.
- Разбавить каждый ЛРА на соответствующие рабочие концентрации с среднего роста (например, 1 мкм для JQ1(+)).
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Воссоздать Лиофилизированные препараты с соответствующим растворителем до концентрации 10 мм. Хранить запас МРВ все на-80 ° C в одноразовых Алиготе (по 5 мкл) для того, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания. - Тщательно аспирационная трансфекции средний с многоканальным и заменить 100 мкл носитель, содержащий соответствующие ЛРА (таблица 1). Добавьте средне очень аккуратно вдоль стены колодца во избежание отсоединения transfected клеток HEK293T, которые известны легко отсоединить от поверхности плиты культуры.
- Инкубировать пластину для 48 ч в 5% CO2 увлажненные инкубатора 37 ° c.
3. Окрашивание Transfected клеток с поправимо жизнеспособности краситель для потока Cytometry анализ
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Удаление омертвевших клеток и космического мусора имеет важное значение для ликвидации ложных срабатываний и получения результатов самого высокого качества.
- Отсоедините клетки в средствах массовой информации, с использованием 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS) за хорошо и аккуратно закупорить вверх-вниз (~ 5 раз) с многоканальный, избегая вспенивания средств массовой информации. При необходимости отсоедините клетки от пластины с использованием 35 мкл на хорошо раствор трипсина ЭДТА (0,05% - 10 мм в PBS) и инкубации 5 минут при 37 ° C, прежде чем нейтрализации со средой, содержащей сыворотку.
- Передать 96-луночных V-днище клетки.
- Спиновые клетки для 5 мин на 500 x g при 4 ° C, а затем тщательно аспирационная средне/PBS без касатьться клетки.
- Вымойте клетки по крайней мере 1 раз с 200 мкл белка/сыворотка бесплатно PBS.
- Центрифуга на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант, наклоняя тарелку и удаление буфера мыть без касатьться клетки.
- Приготовьте рабочий раствор красителя поправимо жизнеспособности путем разбавления 1: 1000 краситель жизнеспособность в белок/сыворотка бесплатно PBS. Подготовка 50 мкл разбавленного пятно на хорошо.
Примечание: Жизнеспособность красителей доступны в диапазоне цветов, подходит для использования с голубой, красный и фиолетовый лазеров. Подготовьте раствор красителя поправимо жизнеспособность resuspending один флакон лиофилизированных краситель (компонент A) с 50 мкл безводный ДМСО (компонент Б). Хранить при-20 ° C в однократного использования аликвота (1 мкл каждого), защищенный от света. - Добавьте 50 мкл разбавленного жизнеспособности красителя для каждой скважины и смешивать клетки, закупорить вверх и вниз с многоканальным.
- Пятно на 10-15 мин при температуре 4 ° C, защищенный от света.
- 1 - 2 раза промойте 150 мкл буфера мытья (PBS с 1% ЭДТА бычьего сывороточного альбумина и 2 мм).
- Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Исправьте клетки с 100 мкл свежеприготовленные 1% формальдегида в буфере мыть за 10-15 мин при температуре 4 ° C в темноте.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Формальдегид является весьма токсичным. Готовят раствор 1% формальдегида в Зонта избегать вдыхания при ношении перчатки и защитные очки для защиты. - Вымойте клетки 1 - 2 раза с 100 мкл буфера мытья.
- Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 70 мкл буфера мытья.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Фиксированные клетки могут храниться при температуре 4 ° C в темноте для анализа на следующий день на проточный цитометр.
4. EGFP и измерения DsRed проточной цитометрии и анализа данных
Примечание: Анализ на проточный цитометр ВИЧ транскрипции (% EGFP) и сплайсинга (% DsRed). Отбор образца до запуска с 70 мкм клеток сито или 100 мкм нейлоновая сетка, чтобы избежать засорения сопла.
- Вскакивать цитометр и компьютер по крайней мере 10 минут до использования для обеспечения лазеры согреться.
- Перед выполнением примеров и начала сбора данных, заполните бак платье с 0,9% физиологического раствора и убедитесь, что гипохлорит натрия таблетки добавляется в емкость для отходов.
- Проверка потока ячейки для воздушных пузырьков.
- Убедитесь, что детекторы и фильтры подходят для эксперимента.
Примечание: Для EGFP, использование синего лазера (488 нм) и полосовой 530/30, в то время как DsRed Express оптимально обнаруживается с помощью желтый лазер (561 Нм) и полосовой 610/20. Синий лазер (488 нм) и полосовой 610/20 также может использоваться для обнаружения DsRed выражение. - Проверьте производительность цитометр и чувствительности через детекторы, запустив калибровки бусины.
- Отрегулируйте вперед (FSC-A) и боковой (SSC-A) разброс напряжения с незапятнанное образец так, что основное население на экране и четко заметной.
Примечание: FSC (рассеянном свете) является измерение света дифракции в плоский угол, который зависит от объема клетки (клеток поверхности или размер), а ККК (сторона рассеянный свет) является измерение света дифракции в прямым углом, который пропорциональн к Гранулярность клеток и внутренней сложности. - Выполните ручной или автоматической компенсации с помощью сингл окрашенных образцов, обеспечении минимальных побочных EGFP + населения в DsRed детектор и наоборот.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Для целей компенсации Используйте образец клеток, выражая каждый из одного цвета флуоресцентных белков, а также поодиночке окрашенных краской поправимо жизнеспособность клеток. Не используйте FITC и PE компенсации бусы для компенсации флуоресцентные белки EGFP и DsRed из-за различных спектральных характеристик. Контроль компенсации должно быть достаточно ярким, чтобы разрешить положительных и отрицательных населения. - Создание участков и установить ворота, используя флуоресценции минус один (FMO) элементов управления.
- Получить и записать как минимум 10 000 событий жизнеспособных клеток в образце. Запуск образцов на средней или низкой скорости, чтобы избежать Дуплеты, проходя через лазерный перехвата. Используйте импульсный геометрии стробирования такие как SSC-A по сравнению SSC-H для ликвидации Дуплеты. Проверьте стабильность выполнения путем построения время по сравнению SSC-A чтобы увидеть как даже поток это во время выполнения.
- В конце выполнения очистить fluidics цитометрия потоков с концентрированные чистящие средства, а затем воду на 5 мин.
- Выключение системы, сбросить отходы и заново заполнить бак платье после приобретения.
- Анализировать данные с помощью программного обеспечения анализа потока данных цитометрии. Исключить ячейки мусор и комок (Дуплеты), основанный на передней и боковых разброс, а затем устранить мертвые клетки, используя жизнеспособность краска пятно (отрицательные населения = живой клетки). Определить ячейки, выражая EGFP и DsRed (рис. 4), а также доля сращивания продукта DsRed /(DsRed + EGFP) (рис. 5).
- Определите влияние ЛРА на ВИЧ транскрипции и сращивания, сравнивая необработанных клетки и клетки подвергаются лица или сочетание МРВ (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты показаны на рисунке 5 выражение ВИЧ-1 unspliced (EGFP) и сращивания продуктов (DsRed) после лечения с bromodomain ингибитор СВ1. JQ1(+) и ТАТ значительно увеличилась доля клеток, выражая EGFP (2.18 и 4.13 ФК над ДМСО соответственно; n = 3) свидетельствует о unspliced стенограмм. Кроме того, JQ1(+) значительно увеличился процент клеток, выражая DsRed (46,6 ФК над ДМСО) а также доля сращивания продукта (7.37 ФК над ДМСО) для аналогичного уровня как ТАТ (59,6 и 5,83 ФК над ДМСО, соответственно) подтверждающий способность JQ1(+) чтобы включить ВИЧ транскрипции и сплайсинга. С другой стороны лечение с элементом для стереоизомер JQ1(-) отменяет эффект JQ1(+) на ВИЧ транскрипции и сращивания, подтверждает успех Протокола.
В недавней публикации мы показали, анализ РНК, что накопление ВИЧ сращивания стенограммы, после JQ1(+) лечения21. В самом деле наши данные показали последовательного изменения уровня unspliced и сращивания стенограмм, которые были зеркально EGFP и DsRed белков в этой модели, после лечения с JQ1(+). Эти результаты показывают, что EGFP и DsRed, выражая клетки отражают bromodomain ингибитор JQ1(+) возможность побудить ВИЧ транскрипции и сплайсинга.
В целом мы проверить использование pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed репортер в настройке высокой пропускной способностью для оценки влияния МРВ на ВИЧ-1 транскрипции и сплайсинга. Югу оптимальное количество ЛРА или увеличение токсичности может привести к результатам Скад. Оптимизировать количество наркотиков, используемых при сохранении жизнеспособности клеток может повысить точность результатов.
Рисунок 1: Схема модели, используемой для определения последствий задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга. LTR конструкции выражает либо белка unspliced конверт (Env) сливается с усиленной Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) или сращивания Δ38rev белка с DsRed. Эта цифра была перепечатана из Хури et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: создает дизайн. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed сращивания репортер позволяет выражение конверт, сливается с EGFP (gp140-EGFP) и нефункциональных белковых Rev усечено до аминокислоты 38 сливается с DsRed флуоресцентный белок (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 позволяет выражения протеина Rev. (C) pCMV-Tat101AD8-флаг позволяет выражения протеина Tat101(AD8) с флагом тегом C-терминала. Плазмиды выражения строятся с использованием ПЦР дублирования и ограничение дайджест. Все векторные карты были созданы с использованием SnapGene программное обеспечение, версия 4.1.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Assay дизайн для быстрой оценки ВИЧ задержки вспять агенты. Текущий метод для оценки влияния МРВ на ВИЧ-1 транскрипции и сплайсинга включает в себя i) посев HEK293T клеток за один день до ii) трансфекции с векторы выражения, следуют iii) ЛРА лечения. IV) клетки анализируются потока цитометрии 48 ч после лечения. Используя этот протокол, 32 (в трех экземплярах) 96 условий могут быть опробованы на пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: пример плита настройки и контроля необходимы. Колонки 1-3 соответствуют отрицательной (-) элементов управления без наркотиков и растворителя только (ДМСО 1: 5000) а также положительному (+) элементы управления, например ТАТ (100 нг), PMA/PHA = phorbol миристат ацетат/phytohaemagglutinin (10 Нм PMA, 10 мкг/мл PHA), СВ1 (+/-) (1 мкм), VOR = vorinostat ( 0.5 мкм) и Пан = panobinostat (30 Нм). Неизвестные МРВ тестируются в трех экземплярах в диапазоне концентраций (15.625 до 1000 Нм). Для целей компенсации клетки, выражая каждый из одноцветном флуоресцентного белка (EGFP + и DsRed +) а также клеток окрашенных краской жизнеспособность и безупречная клетки включаются при каждом запуске. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок 4: стробирования стратегии, используемые в анализе цитометрия потоков. Первым шагом в шлюзовой стратегия основана на передней и боковых разброс, который позволяет различия клетки интерес, на основе размера и детализации свойств этих клеток. Рекомендуется, что этот строб быть как щедрый, как можно включить все события, устранив сотовой мусора и мертвые клетки, которые находятся в нижнем левом углу участка плотности. Затем удалите Дуплеты из dataset с помощью импульса геометрии стробирования, SSC-A по сравнению SSC-H и далее узкой на живые клетки, с помощью окрашивания жизнеспособности. Наконец дамп канала (фиолетовый) и EGFP или DsRed используются для определения к клеткам интереса. Использование флюоресценции минус один (FMO) элементы управления имеют решающее значение в определении населения интерес и решении проблем распространения из другого флюрохром в интересующем канале. После приобретения данные анализируются с помощью программного обеспечения для анализа данных потока цитометрии. Эта цифра была перепечатана в адаптированные формы Хури et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель результаты эффект ингибиторов bromodomain на ВИЧ транскрипции и сплайсинга. (A) примеры двух параметр двойной цвет флуоресценции EGFP против DsRed, плотности участков из untransfected клеток (-ТАТ), transfected клеток с 100 нг pCMV-Tat101AD8-флаг (+ Tat) и клетки лечат с ДМСО, СВ1 (+) или СВ1 (-). (B) средний процент (%) клеток, выражая EGFP, DsRed или сращивания продукта (DsRed / DsRed + EGFP) от 3 независимых экспериментов показано. Сравнение каждого состояния в ДМСО были сделаны с помощью теста ANOVA 2-way. Показаны только статистически значимые сравнения. p < 0,05; p < 0.01; p < 0,001. Черные линии представляют mean±SEM. ДМСО (1: 5000), СВ1 (+) и JQ1(-) (1 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Учитывая трудности в области измерения реактивации вируса ex vivo, широкий спектр в пробирке, которые со временем были разработаны модели для изучения задержка ВИЧ, включая латентно инфицированных клеток T линии (J-латов, АЧ2, U1), основной модели латентной инфекции отдыха) O'Doherty, Левин, Грин и Spina модели) или предварительно активированных клеток CD4 + T (Sahu, Марини, Planelles, Siliciano, Карн модели) с одной круглой или репликации компетентным репортер вирусов22. Для моделирования физиологических условиях ВИЧ задержку в отдыха CD4 + Т-клеток, систем двойной флуоресцентные репортер последовало как репортер RGH (красный-зеленый-ВИЧ), разработанная группой Иван Садовский с LTR-driven кляп eGFP маркер и ЦМВ управляемый mCherry на месте Nef23. Аналогичной двойной цвет репортер вирус, дуэт-флуоресценции, была разработана лабораторией E. Verdin с выражением LTR-driven EGFP и флуоресцентные маркер mCherry, движимый промоутер EF1α24. В этой системе EGFP был вставлен в конце 3' Провирус вместо Nef. Удаление в конверт в обе эти системы предотвращает несколько раундов инфекций. Кроме того, сочетание двух флуоресцентных белков позволяет обнаружение продуктивно (eGFP + mCherry +) и латентно (eGFP - mCherry +) инфицированных клеток. Однако ряд недостатков двойной цвет репортер вирусов были заметны в CD4 + Т-клеток как прямой инфекции латентно зараженных клеток в значительной степени зависит от состояния клеточных активации Т-клетки23,24. В самом деле, очень низкий уровень инфицирования было отмечено, используя эти два репортера вирусов в отдыха CD4 + Т-клеток: 0,1% для RGH23 и 0,2% для DuoFluo25. Кроме того как ЦМВ промоутер было показано, быть выражена на более низких уровнях неактивированные клетки26,27,28, неактивные ЦМВ или EF1α промоутер приведет к недооценке латентно зараженных населения.
У нас созданы и охарактеризовал новый вектор репортер ВИЧ для изучения создания задержки и реактивации вируса в assay высокой пропускной способности. Несколько преимуществ для нашего метода скрининга включают i) экономической эффективности с возможностью оценить транскрипции и одновременно, сплайсинга ii) возможность проверить большое количество наркотиков или сочетания в одном эксперименте, iii) быстрой оценки эффект МРВ подачей cytometry (30-45 мин типичные время чтения для 96 хорошо пластины, независимо от числа люминесцентных параметров), iv) высокий динамический диапазон, v) подходит для автоматизированного трансфекции высокую пропускную способность и проточной цитометрии с помощью робота оружия и HTS платформы, VI) быстросохнущая данных с помощью шаблона рабочей области цитометрии потока, vii) оптимально для подвески и адэрентных клеток, viii) простота модели и адаптируемость к измерения люминесценции и пластины читателя (двойной Люцифераза Firefly и Renilla) и ix) масштабируемость (96 - и 384-ну паштет форматов).
Склонность ЛРА или сочетание МРВ активации ВИЧ LTR-driven транскрипции и таким образом сплайсинга EGFP и DsRed выражение флуоресцентных белков может быть рассмотрен проточной цитометрии, используя наш корреспондент сплайсинга ВИЧ. Однако перед началом тестирования синергии Роман МРВ, настоятельно рекомендуется определить физиологические условия каждого ЛРА путем измерения жизнеспособности клеток после воздействия ряда концентрации одного препарата. Таким образом включая маркер живых и мертвых клеток имеет важное значение для ликвидации ложных срабатываний и получения результатов самого высокого качества. Еще одним важным аспектом анализа цитометрия потоков является контроль компенсации или FMO. Настоятельно рекомендуется использовать индивидуально окрашенных образцов, обеспечивая минимальные побочные EGFP + населения в DsRed и наоборот. Кроме того важно для счета для аутофлюоресценция клеток, включая неокрашенных клетки. Наконец регулярный контроль цитометр производительности и чувствительности через детекторы критическим главным образом при измерении образцы для исследования, охватывающих длительный период времени.
Хотя не обсуждаются в разделе протокол, существует несколько ограничений нашей сплайсинга репортер системы. Для более тщательного обсуждения пожалуйста, смотрите наши предыдущие публикации (Хури et al., 2018). Экспорт из частично или unspliced вариантов ВИЧ мРНК облегчается вирусного белка Rev и его связь с отзывчивым элемент Rev (RRE) в эти мРНК видов29,30,,3132. Гиперэкспрессия Rev в нашей системе, позволило нам обойти основных блока ядерной удержания умножить сращивания и unspliced мРНК в латентно зараженных клеток T17 и сосредоточиться на понимание, как МРВ побудить транскрипции и сращивания Таким образом реактивации вируса. Кроме того, учитывая, что наша система требует трансфекции 3 плазмид, мы выбрали HEK293T клетки, потому что высокая трансфекции эффективность этих клеток. Вследствие различных временных и пространственных наличие клеточных факторов в Т-клеток, по сравнению с линией клеток рака, важно проверить результаты сплайсинга репортер, приобретенных в HEK293T клетках в Т-клеточных линий и главные ячейки, которые могут обеспечить большое технические проблемы из-за их ограниченного transfectability. Таким образом использование альтернативных ДНК доставки реагентов для transfection например ДМРИЭ-C, которое было показано, чтобы быть особенно эффективным для transfection клетки подвеска (например, Jurkat), или nucleofection методов, таких как Amaxa nucleofector или Неон Трансфекция системы, было доказано для облегчения эффективной и надежной доставки одного или несколько плазмидов трудно transfect клеток, включая первичный CD4 + Т-клеток. Кроме того было бы интересно проверить этот репортер системы в контексте полнометражного вируса в главной ячейки модели с использованием методов трансфекции вышеупомянутые задержки. В самом деле различия в доступности узла транскрипции, удлинение и сплайсинга факторов в rCD4 + Т-клеток могут повлиять на способность ЛРА активизировать скрытые Провирус. Наконец наша модель не рассматривается ли зто может повлиять на транскрипции и сплайсинга прохожий клеток, и является ли он может вызвать репликации вируса и компетентным. Однако мы бы подозревать, что путем измерения увеличение клеток, связанных ВИЧ США и MS РНК, это приведет к производству компетентным репликации вируса в надосадке культуры. Это может быть подтверждено проведения золотой стандарт количественных вирус нарост пробирного (QVOA)33.
Из-за сложного характера задержки и обеспечить возобновление эффективного вируса многогранной комбинаторной стратегия может быть требуется34. Потенциальных лечения необходимо стимулировать несколько путей, включая транскрипции и сращивания, который ранее было показано играть существенную роль в создании задержка16,,3536, 37. наш LTR-driven сплайсинга репортер позволит высокую пропускную способность скрининга наркотиков, которые можно оптимально ориентировать шаги, транскрипция и сращивания, увеличивая вероятность нахождения молекул, которые могут эффективно, объединения которых приведет к более низким доза уровнях и, таким образом, токсичности каждого препарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана проект Грант APP1129320 и Грант APP1052979 программы от NHMRC Австралии. Мы благодарим д-р Адам Wheatley, д-р Марина Александр, д-р Дженни л Андерсон и Мишель ю. ли за предоставление основных конструкций и советы для успешного завершения этой работы. Мы также благодарим сотрудников DMI потока объекта за их советы и щедрой помощи в поддержании проточный цитометр, используемые в данном исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 - 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12x75 mm style |
| Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega - Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
