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Immunology and Infection

इन विट्रो में उच्च प्रवाह एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर विलंबता reversing एजेंटों के मूल्यांकन

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58753
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

Summary

एचआईवी कुशल पुनर्सक्रियन और अव्यक्त वायरस की निकासी के कार्यात्मक आकलन के लिए एक उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल वर्णित है और एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर हस्तक्षेप के प्रभाव का परीक्षण करके लागू किया जाता है । बाएं से दाएं पर विलंबता एजेंट के प्रभाव के प्रतिनिधि परिणाम-संचालित प्रतिलेखन और ब्याह प्रदान की जाती हैं ।

Abstract

एचआईवी कोशिकाओं है कि वायरस, जो प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए अदृश्य रहता है और वर्तमान एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) द्वारा लक्षित नहीं है की स्थिर और अव्यक्त रूप बंदरगाह के एक जलाशय के अस्तित्व के कारण लाइलाज बनी हुई है । प्रतिलेखन और ब्याह CD4 + टी कोशिकाओं आराम में एचआईवी-1 विलंबता को सुदृढ़ करने के लिए दिखाया गया है । विलंबता उलटा एजेंटों (LRAs) "सदमे में और मार" दृष्टिकोण के उपयोग से विलंबता का उलटा इस जलाशय को शुद्ध करने की कोशिश में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, लेकिन इस प्रकार अब तक नैदानिक परीक्षणों में कोई सफलता पर्याप्त छोटे के विकास की कमी के कारण नहीं दिखाया गया है अणु है कि कुशलता से इस जलाशय perturb कर सकते हैं । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत की मज़बूती से और कुशलता से एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर विलंबता उलटा एजेंटों (LRAs) का आकलन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । यह दृष्टिकोण एक लीटर के उपयोग पर आधारित है दोहरी रंग रिपोर्टर है कि एक साथ प्रतिलेखन पर एक LRA के प्रभाव को मापने के लिए और प्रवाह cytometry से ब्याह कर सकते है संचालित है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल अनुयाई कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है और साथ ही निलंबन में कोशिकाओं । यह एक उच्च प्रवाह प्रणाली में दवाओं की एक बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए उपयोगी है । विधि को लागू करने और लागत प्रभावी तकनीकी रूप से सरल है । इसके अलावा, प्रवाह cytometry का उपयोग सेल व्यवहार्यता के आकलन और इस प्रकार एक ही समय में दवा विषाक्तता की अनुमति देता है ।

Introduction

प्रभावी दीर्घकालिक एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा के बावजूद, एचआईवी स्मृति CD4 + टी कोशिकाओं1में एक एकीकृत वायरस के रूप में एक अव्यक्त राज्य में बनी हुई है । एचआईवी के क्रोमेटिन संरचना-१ ५ ' लांग टर्मिनल दोहराने (बाएं) प्रमोटर और epigenetic संशोधन जैसे हिस्टोन मिथाइल और deacetylation द्वारा डीएनए methyltransferases (DNMT) और हिस्टोन deacetylases (HDAC) महत्वपूर्ण तंत्र के लिए अग्रणी है transcriptional दमन और इस प्रकार के बाद एकीकरण विलंबता2,3। विलंबता reversing एजेंटों (LRAs) की एक बड़ी विविधता के लिए अपने प्रभावकारिता के लिए जांच की गई है इन विट्रो में वायरस उत्पादन प्रेरित और अव्यक्त रूप से संक्रमित आराम CD4 + टी कोशिकाओं4,5,6,7 से vivo में ,8. LRAs परीक्षण के अलावा, HDACi (HDAC अवरोधकों) और बेट bromodomain अवरोधकों (बेटिओं) क्रोमेटिन और सकारात्मक प्रतिलेखन बढ़ाव फैक्टर बी (पी-TEFb) क्रमशः के रिलीज के लिए प्रेरित transcriptional के बाद राहत देने के लिए अग्रणी 5 ' लीटर और एचआईवी अभिव्यक्ति9,10,11,12,13के सक्रियकरण पर दमन । हालांकि, इन LRAs द्वारा प्राप्त पुनर्क्रियाशीलता की भयावहता केवल सेल में एक मामूली वृद्धि से जुड़े ब्याह एचआईवी mRNA (अमेरिकी आरएनए), वायरल प्रतिलेखन का संकेत के रूप में सीमित था, पूर्व vivo14,15मनाया गया था । महत्वपूर्ण रूप से, इन LRAs भी अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं की आवृत्ति में कमी पैदा करने में विफल रहा है ।

एचआईवी अभिव्यक्ति आगे अकुशल ब्याह16 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुणा के परमाणु निर्यात में दोष से प्रतिबंधित किया जा सकता है ब्याह एचआईवी आरएनए (सुश्री आरएनए)17। इस प्रकार, LRAs की नई कक्षाओं की पहचान है कि अधिक शक्तिशाली है और वायरस के उत्पादन के बाद के विभिंन पहलुओं को प्रभावित कर सकते है एकीकरण की जरूरत है । इसके अलावा, उपंयास परख का विकास है कि इष्टतम यौगिकों कुशलतापूर्वक रिवर्स विलंबता को परिभाषित करने में मदद की आवश्यकता है ।

यहां, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जो एचआईवी से अधिक पर हस्तक्षेप के प्रभाव के कार्यात्मक आकलन के लिए एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण का उपयोग करता है, प्रतिलेखन और ब्याह चालित । संक्षेप में, एक नया बाएं से दाएं चालित दोहरी रंग रिपोर्टर प्रणाली pLTR. gp140/EGFP । RevΔ38/DsRed (चित्रा 1) प्रवाह cytometry द्वारा एचआईवी पुनर्क्रियाशीलता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में, ब्याह एचआईवी mRNA की अभिव्यक्ति (4 केबी) बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) अभिव्यक्ति की ओर जाता है, जबकि ब्याह mRNA की अभिव्यक्ति (2 केबी) Discosoma सपा का नेतृत्व करेंगे । लाल (DsRed) फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति । संक्षेप में, हम एक फ्लोरोसेंट Env-EGFP फ्यूजन प्रोटीन, gp140unc का इस्तेमाल किया । EGFP, जहां EGFP के कोडन अनुक्रम फ्रेम में एक संयुक्त राष्ट्र के साथ रखा गया था और लिफाफा के छोटे फार्म का (Env) । परिवर्तन gp120 और gp41-EGFP में Env के पृथक्करण को रोकने के लिए दरार साइट ablate पेश किया गया, और gp160 प्रोटीन से पहले transmembrane एक घुलनशील Env अनुरूप है, जो सही तह की सुविधा बनाने डोमेन से कटने और EGFP की अभिव्यक्ति. एक सेल के भीतर अभिव्यक्ति पर, rev नाभिक को स्थानीयकरण जहां यह cytoplasmic Rev उत्तरदायी तत्व (RRE) के साथ बातचीत के माध्यम से 4 केबी env mRNA के परमाणु-निर्यात मध्यस्थता । Env के जनचेतना RRE, जो gp120 और gp41, और A7 3 ' ब्याह साइट के बीच निहित है समझौता नहीं करता है । इस प्रणाली में, एचआईवी पर ब्याह-1 ब्याह दाता 4 (SD4) और ब्याह स्वीकार 7 (SA7) के उत्पादन में एक 2 केबी mRNA एक गैर कार्यात्मक Rev प्रोटीन एमिनो एसिड ३८ में काट दिया एंकोडिंग DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े, revδ ३८-DsRed । संक्षेप में, DsRed अमीनो एसिड ३८ में Rev के 2एन डी एक्सॉन में डाला गया था ओवरलैप एक्सटेंशन18। को ब्याह mRNA के परमाणु निर्यात की सुविधा, एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर एंकोडिंग rev (pCMV-revnl 4.3) फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का निर्माण (चित्रा 2) के साथ सह transfected था । इस अनूठी रिपोर्टर का निर्माण यहां एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह के उच्च प्रवाह मूल्यांकन में उपयोगी है, वायरल वैक्टर उपयोग की आवश्यकता के बिना ।

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Protocol

नोट: क्लोनिंग, परिवर्तन और अनुक्रमण के लिए प्रक्रियाओं कहीं18,19पर चर्चा कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर (चित्रा 3) के अभिकर्मक से शुरू करते हैं ।

1. दोहरी रंग रिपोर्टर के साथ HEK293T कोशिकाओं के अभिकर्मक का निर्माण

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में HEK293T कोशिकाओं की खेती (DMEM) 10% के साथ पूरक (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन (१०० U/एमएल) और streptomycin (१०० μg/एमएल) में एक 5% सह2 मशीन में ३७ ° c. गल के बाद, अभिकर्मक प्रयोगों में उन्हें उपयोग करने से पहले HEK293T कोशिकाओं 2-3 बार गद्यांश. यह कोशिकाओं को गल प्रक्रिया से उबरने के लिए समय देना होगा ।
    सावधानी: कोशिका संस्कृतियों का माइकोप्लाज्मा प्रदूषित होना एक गंभीर समस्या बनी हुई है. अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास और कोशिका संस्कृतियों के नियमित परीक्षण माइकोप्लाज्मा संदूषण के जोखिम को कम करने और20प्रसार से बचने के लिए आवश्यक हैं ।
  2. बीज बोने से पहले एक दिन 1:2 कोशिकाओं को विभाजित करें और उन्हें ताजा DMEM माध्यम में स्थानांतरित कर दें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% CO2 मशीन में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की खेती ।
  3. अभिकर्मक के पहले दिन, आकांक्षा द्वारा कुप्पी से मध्यम निकालें और सीरम के निशान को दूर करने के लिए Dulbecco के फास्फेट बफर खारा (DPBS) कैल्शियम से मुक्त समाधान (सीए2 +) और मैग्नीशियम (मिलीग्राम2 +) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  4. trypsin के 5 मिलीलीटर वितरण-EDTA समाधान (०.०५%-पंजाब में 10 मिमी) संस्कृति पोत में और यह ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में 2 से 5 मिनट के लिए जगह है ।
  5. जब कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, 10% के साथ पूरक DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़ें (वी/वी) FBS आगे कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है जो trypsin गतिविधि को बाधित करने के लिए ।
  6. ऊपर और नीचे के झुरमुट को तोड़ने के लिए सेल निलंबन pipetting द्वारा धीरे से स्थगित ।
  7. पतला trypan नीले दाग में 1:10 कोशिकाओं (०.४%) ।
  8. जीवित कोशिकाओं है कि ऊपर trypan नीले एक खुर्दबीन (10x उद्देश्य) और एक haemocytometer का उपयोग नहीं ले गिनती ।
  9. सेल गिनती के औसत लेने के द्वारा और १०,००० द्वारा और कमजोर पड़ने फैक्टर (1:10) से trypan नीले दाग से गुणा करके milliliter प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
  10. प्लेट 2 एक्स DMEM मध्यम के १०० μL में 104 कोशिकाओं एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% FBS के साथ पूरक 24 एच के लिए ।
  11. एक अच्छी तरह के लिए, पतला ४०० pLTR. gp140/EGFP के एनजी । RevD38/DsRed, 20 pCMV के एनजी-Revnl 4.3 और १०० एनजी के pCMV-Tat101AD8-फ्लैग डीएनए में सीरम मुक्त माध्यम के ५० μL । मिश्रण धीरे । जैसे प्रयोगों के लिए, एक मिलान खाली जैसे वेक्टर pcdna 3.1 (-) का उपयोग करें ।
    नोट: endotoxin-मुक्त डीएनए का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है । उसके लिए, एक midi या maxiprep न्यूक्लिक एसिड शोधन किट का उपयोग कर endotoxin मुक्त डीएनए तैयार करते हैं । 260/280 आयुध डिपो अनुपात को मापने के द्वारा डीएनए शुद्धता का निर्धारण, जो १.७ और १.९ के बीच होना चाहिए ।
  12. प्रयोग से पहले लिपिड रिएजेंट को धीरे से मिलाएं, फिर सीरम मुक्त माध्यम के ५० μL में ०.६५ μL को पतला करें । धीरे से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  13. पतला लिपिड एजेंट के साथ पतला डीएनए का मिश्रण ।
  14. धीरे से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन । समाधान बादल दिख सकता है ।
    नोट: १.१५ चरण के लिए आगे बढ़ें । 30 मिनट के भीतर ।
  15. कोशिकाओं के शीर्ष पर लिपिड एजेंट डीएनए परिसरों ड्रॉप वार के प्रति अच्छी तरह से १०० μL वितरण ।
  16. आगे और पीछे थाली रॉक द्वारा धीरे से मिक्स ।
  17. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% कं2 humidified मशीन में 5 घंटे के लिए थाली मशीन ।
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण एक अच्छी तरह से (९६-well) अभिकर्मक के लिए पर्याप्त है । मात्रा और दवा और संयोजन है कि परीक्षण किया जाएगा की संख्या के अनुसार घटकों की मात्रा को समायोजित करें, और pipetting रूपों के लिए खातों । सभी शर्तों आमतौर पर triplicates में परीक्षण किया जाता है ।
    2. क्षतिपूर्ति प्रयोजनों के लिए सीएमवी चालित EGFP और DsRed-एक्सप्रेस डीएनए प्लाज्मिड के १०० एनजी के साथ अतिरिक्त कुओं Transfect ।

2. विलंबता reversing एजेंटों के साथ Transfected HEK293T कोशिकाओं का उपचार

नोट: प्रत्येक परख करने से पहले, सेल प्रसार परख के साथ दवा की उच्च और कम खुराक के लिए जोखिम के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता को मापने के द्वारा प्रत्येक LRA की शारीरिक स्थिति का निर्धारण ।

  1. प्रत्येक LRA को विकास माध्यम (उदा., 1 माइक्रोन फॉर JQ1 (+)) के साथ उपयुक्त कार्यशील एकाग्रता में पतला करें ।
    सावधानी: 10 मिमी की एकाग्रता के लिए उपयुक्त विलायक के साथ lyophilized दवाओं का पुनर्गठन । सभी स्टॉक LRAs पर-८० ° c एक एकल उपयोग aliquot (5 μL प्रत्येक) में आदेश दोहराया ठंड-गल चक्र से बचने के लिए ।
  2. सावधानीपूर्वक एक मल्टीचैनल के साथ अभिकर्मक माध्यम महाप्राण और १०० μL मध्यम युक्त उपयुक्त LRA (तालिका 1) के साथ प्रतिस्थापित करें. अच्छी तरह से transfected HEK293T कोशिकाओं है, जो आसानी से संस्कृति थाली सतह से अलग करने के लिए जाना जाता है अलग से बचने के लिए की दीवार के साथ बहुत धीरे माध्यम जोड़ें ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 humidified मशीन में ४८ ज के लिए थाली मशीन ।

3. प्रवाह Cytometry विश्लेषण के लिए Fixable व्यवहार्यता डाई के साथ Transfected कोशिकाओं का धुंधला

सावधानी: मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए झूठी सकारात्मक को खत्म करने और उच्चतम गुणवत्ता के परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

  1. मीडिया में कोशिकाओं को अलग फॉस्फेट के १०० μL का उपयोग-बफर खारा (पंजाब) प्रति अच्छी तरह से और धीरे से ऊपर pipetting और नीचे (~ 5 बार) एक मल्टीचैनल के साथ, जबकि मीडिया के फेन से परहेज । यदि आवश्यक हो, trypsin-EDTA समाधान (०.०५%-पंजाब में 10 मिमी) के प्रति अच्छी तरह से ३५ µ एल का उपयोग कर प्लेट से अलग कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट की मशीनिंग, सीरम युक्त माध्यम के साथ बेअसर से पहले.
  2. ९६-well V-निचली थाली के लिए कक्षों को स्थानांतरित करें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन, तो ध्यान से मध्यम/महाप्राण कोशिकाओं को छूने के बिना ।
  4. प्रोटीन/सीरम मुक्त पंजाबियों के २०० μL के साथ कोशिकाओं को कम-से-1 समय धोएं ।
  5. 4 ° c में 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक, तो थाली झुका और कोशिकाओं को छूने के बिना धोने बफर हटाने के द्वारा supernatant त्यागें ।
  6. कमजोर में व्यवहार्यता डाई 1:1000 द्वारा fixable व्यवहार्यता डाई का एक काम समाधान तैयार प्रोटीन/सीरम मुक्त पंजाबियों । प्रति अच्छी तरह से पतला दाग के ५० µ एल तैयार करें ।
    नोट: व्यवहार्यता रंजक नीले, लाल और बैंगनी पराबैंगनीकिरण के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त रंग की एक श्रेणी में उपलब्ध हैं । ५० μL निर्जल DMSO (घटक बी) के साथ lyophilized डाई (घटक a) की एक शीशी resuspend द्वारा fixable व्यवहार्यता डाई का एक शेयर समाधान तैयार करें । एक एकल उपयोग aliquot में-20 ° c स्टोर (1 μL प्रत्येक), प्रकाश से सुरक्षित ।
  7. पतला व्यवहार्यता डाई के ५० μL प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें और एक मल्टीचैनल के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए दाग, प्रकाश से रक्षा की ।
  9. वॉश बफर के १५० μL के साथ 1-2 बार धो (1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और 2 मिमी EDTA के साथ पंजाब) ।
  10. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  11. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए धो बफर में नए सिरे से तैयार 1% formaldehyde के १०० μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
    सावधानी: Formaldehyde बहुत विषाक्त है । एक धुएं डाकू में 1% formaldehyde समाधान तैयार साँस लेना से बचने के लिए जबकि दस्ताने और संरक्षण के लिए सुरक्षा चश्मा पहने हुए ।
  12. धोने के बफर के १०० μL के साथ 1-2 बार कोशिकाओं को धो लें ।
  13. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  14. ७० धोने बफर के μL में सेल गोली resuspend ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । फिक्स्ड कोशिकाओं को प्रवाह cytometer पर अगले दिन विश्लेषण के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

4. फ्लो Cytometry और डाटा एनालिसिस द्वारा EGFP और DsRed माप

नोट: एक प्रवाह cytometer पर एचआईवी प्रतिलेखन (% EGFP) और ब्याह (% DsRed) का विश्लेषण । एक ७० माइक्रोन सेल के साथ चलाने से पहले नमूना फ़िल्टर-छलनी या १०० माइक्रोन नायलॉन जाल नोजल ऊपर कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए ।

  1. cytometer और कंप्यूटर को शुरू करने के लिए लेजर गर्म सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले ंयूनतम 10 मिनट ।
  2. नमूनों को चलाने और शुरू करने से पहले, ०.९% खारा समाधान के साथ म्यान टैंक भरें और यह सुनिश्चित करें कि एक सोडियम हाइपोक्लोराइट टैबलेट को अपशिष्ट टैंक में जोड़ा गया है ।
  3. हवा के बुलबुले के लिए प्रवाह सेल की जांच करें ।
  4. पुष्टि करें कि डिटेक्टरों और फिल्टर प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं ।
    नोट: EGFP के लिए, नीले लेजर का उपयोग करें (४८८ एनएम) और 530/30 bandpass, जबकि DsRed एक्सप्रेस बेहतर पीला लेजर (५६१ एनएम) और 610/20 bandpass का उपयोग कर पता चला है । एक नीली लेजर (४८८ एनएम) और 610/20 bandpass भी DsRed अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. cytometer प्रदर्शन और डिटेक्टरों भर में संवेदनशीलता अंशांकन मोती चलाकर जांच करें ।
  6. आगे (FSC-a) और साइड (SSC-a) स्कैटर वोल्टेज के साथ धुंधला नमूना समायोजित करें ताकि मुख्य जनसंख्या परदे पर और स्पष्ट रूप से समझदार है ।
    नोट: FSC (आगे-बिखरा हुआ प्रकाश) एक समतल कोण में प्रकाश विवर्तन का माप है, जो कोशिका (कोशिका की सतह के क्षेत्र या आकार) की मात्रा पर निर्भर करता है, जबकि एसएससी (साइड-बिखरी लाइट) एक समकोण में प्रकाश विवर्तन का माप है, जो आनुपातिक है कोशिका दानेदार और आंतरिक जटिलता ।
  7. DsRed डिटेक्टर और उपाध्यक्ष प्रतिकूल में EGFP + जनसंख्या की न्यूनतम spillover सुनिश्चित करने के एकल दाग नमूने का उपयोग करके मैनुअल या स्वचालित मुआवजा प्रदर्शन.
    सावधानी: मुआवजा प्रयोजनों के लिए, एक रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं को अकेले fixable व्यवहार्यता डाई के साथ दाग के प्रत्येक व्यक्त कोशिकाओं का एक नमूना का उपयोग करें । EGFP और DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए FITC और पीई क्षतिपूर्ति मोतियों का उपयोग न करें अलग वर्णक्रमीय विशेषताओं के कारण मलता है । मुआवजा नियंत्रण पर्याप्त उज्ज्वल सकारात्मक और नकारात्मक जनसंख्या को हल किया जाना चाहिए ।
  8. भूखंडों बनाने और प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण का उपयोग कर फाटकों सेट ।
  9. अधिग्रहण और नमूना प्रति १०,००० व्यवहार्य सेल घटनाओं की एक ंयूनतम रिकॉर्ड । लेजर अवरोधन के माध्यम से गुजर दोहरी से बचने के लिए मध्यम या कम गति पर नमूने भागो । दोहरी को समाप्त करने के लिए ssc-A बनाम ssc-H जैसे पल्स ज्यामितिक गेटिंग का प्रयोग करें । एसएससी बनाम समय की साजिश रचने के द्वारा चलाने की स्थिरता की जांच करें देखने के लिए कैसे भी प्रवाह चलाने के दौरान है ।
  10. चलाने के अंत में, स्वच्छ प्रवाह cytometry fluidics सफाई एजेंटों के साथ तो पानी के लिए 5 मिनट प्रत्येक ।
  11. सिस्टम शट डाउन करें, कचरे को त्यागें और अधिग्रहण के बाद फिर से म्यान टैंक को भरें ।
  12. एक प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण । बाहर सेल मलबे और झुरमुट (दोहरी) आगे और साइड स्कैटर के आधार पर बाहर, तो मृत व्यवहार्यता डाई दाग का उपयोग कर कोशिकाओं को खत्म (नकारात्मक जनसंख्या = जीवित कोशिकाओं) । EGFP और DsRed (चित्रा 4) व्यक्त कोशिकाओं की पहचान, साथ ही ब्याह उत्पाद का प्रतिशत DsRed/(DsRed + EGFP) (चित्रा 5) ।
  13. एचआईवी प्रतिलेखन पर LRA के प्रभाव का निर्धारण और अनुपचारित कोशिकाओं और व्यक्तिगत या LRAs का एक संयोजन करने के लिए उजागर कोशिकाओं की तुलना करके ब्याह (चित्रा 5).

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम एचआईवी की अभिव्यक्ति के लिए चित्रा 5 में दिखाया गया है-1 ब्याह (EGFP) और ब्याह (DsRed) bromodomain अवरोधक JQ1 के साथ उपचार के बाद उत्पादों । दोनों JQ1 (+) और जैसे काफी EGFP व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि (२.१८ और ४.१३ DMSO पर एफसी क्रमशः; n = 3) ब्याह टेप का संकेत । इसके अलावा, JQ1 (+) काफी DMSO पर DsRed (४६.६ एफसी एक्सप्रेस) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्याह उत्पाद (७.३७ DMSO से अधिक) के अनुपात के रूप में एक समान स्तर पर (५९.६ और ५.८३ एफसी DMSO ओवर) व्यक्त की कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि, क्रमशः) JQ1 की क्षमता की पुष्टि (+) एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर बारी है । दूसरी ओर, stereoisomer नियंत्रण JQ1 के साथ उपचार (-) समाप्त JQ1 (+) एचआईवी प्रतिलेखन पर प्रभाव और प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि ब्याह ।

हाल ही में एक प्रकाशन में, हम आरएनए विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है एचआईवी ब्याह टेप के एक संचय JQ1 (+) उपचार के बाद21। वास्तव में, हमारे डेटा JQ1 (+) के साथ उपचार के बाद इस मॉडल में EGFP और DsRed प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिबिंबित किया गया है कि ब्याह और ब्याह टेप के स्तर में लगातार परिवर्तन का पता चला । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि EGFP और DsRed व्यक्त कोशिकाओं bromodomain अवरोध करनेवाला JQ1 (+) की क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह प्रेरित ।

संक्षेप में, हम pLTR. gp140/EGFP के उपयोग की पुष्टि की । RevΔ38/DsRed रिपोर्टर एक उच्च प्रवाह में एचआईवी-1 प्रतिलेखन और ब्याह पर LRAs के प्रभाव के आकलन के लिए सेट अप । LRA या बढ़ी हुई विषाक्तता के उप इष्टतम राशि scud परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सेल व्यवहार्यता के संरक्षण जबकि उपयोग दवा की राशि के अनुकूलन परिणामों की सटीकता में सुधार कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: के लिए इस्तेमाल किया मॉडल की योजनाबद्ध विलंबता पर पुनः प्रयोग एजेंटों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोग-चालित प्रतिलेखन और ब्याह । बाएं से दाएं का निर्माण या तो ब्याह लिफाफा (Env) प्रोटीन बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) या DsRed के साथ ब्याह Δ38rev प्रोटीन से जुड़े व्यक्त करता है । इस आंकड़े को Khoury एट अल.21से रिप्रिंट किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: डिजाइन का निर्माण करती है । (A) pLTR. gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed ब्याह संवाददाता EGFP से जुड़े लिफाफे की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है (gp140-EGFP) और गैर कार्यात्मक Rev प्रोटीन एमिनो एसिड ३८ में काट दिया DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन (revδ ३८-DsRed) से जुड़े । (ख) pCMV-revnl 4.3 rev प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है । (ग) pCMV-Tat101AD8-ध्वज सी-टर्मिनल ध्वज-टैग के साथ Tat101 (AD8) प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है । plasmids अभिव्यक्ति का निर्माण पीसीआर ओवरलैप और प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग कर रहे हैं । सभी वेक्टर मैप्स SnapGene सॉफ्टवेयर, संस्करण 4.1.9 का उपयोग कर बनाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एचआईवी विलंबता के तेजी से मूल्यांकन के लिए परख डिजाइन एजेंटों reversing । एचआईवी पर LRAs के प्रभाव के आकलन के लिए वर्तमान विधि-1 प्रतिलेखन और ब्याह भी शामिल है i) HEK293T कोशिकाओं के बोने से एक दिन पहले द्वितीय) अभिकर्मक के बाद अभिव्यक्ति वैक्टर iii द्वारा पीछा) LRA उपचार । iv) कोशिकाओं प्रवाह cytometry ४८ एच के बाद उपचार द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, ३२ (तपसिल में) के लिए ९६ शर्तों प्लेट प्रति परीक्षण किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: प्लेट सेट अप और नियंत्रण की जरूरत के प्रतिनिधि उदाहरण । कॉलम 1 से 3 के लिए नकारात्मक (-) कोई दवा और विलायक के साथ ही नियंत्रण (DMSO 1:5000) के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकारात्मक (+) नियंत्रण जैसे जैसे जैसे (१०० एनजी), पमा/्ह् = phorbol myristate एसीटेट/phytohaemagglutinin (10 nM पमा, 10 μg/एमएल ्ह्), JQ1 (+/-) (1 माइक्रोन), वोर = vorinostat ( ०.५ माइक्रोन), और पान = panobinostat (30 एनएम) । अज्ञात LRAs तपसिल में सांद्रता (१५.६२५ से १००० एनएम) की एक सीमा से अधिक का परीक्षण कर रहे हैं । मुआवजा प्रयोजनों के लिए, एकल रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रत्येक व्यक्त कोशिकाओं (EGFP + और DsRed +) के रूप में अच्छी तरह से व्यवहार्यता डाई और दाग कोशिकाओं के साथ दाग कोशिकाओं को प्रत्येक भाग में शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: गेटिंग रणनीति प्रवाह cytometry विश्लेषण में इस्तेमाल किया । गेटिंग कार्यनीति में पहला कदम आगे और साइड स्कैटर पर आधारित है, जो इन कोशिकाओं के आकार और दानेदार गुणों के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं के भेद को अनुमति देता है. यह सिफारिश की है कि इस गेटिंग के रूप में संभव के रूप में उदार हो सभी घटनाओं में शामिल है, जबकि सेलुलर मलबे और मृत कोशिकाओं को हटाने, जो नीचे घनत्व भूखंड के बाएं कोने में पाए जाते हैं । फिर पल्स ज्यामिति गेटिंग, एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच, और आगे व्यवहार्यता डाई का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं पर संकीर्ण का उपयोग कर डेटासेट से दोहरी निकालें । अंत में, एक डंप चैनल (वायलेट) और EGFP या DsRed ब्याज की कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण का उपयोग ब्याज की जनसंख्या को परिभाषित करने और हित के चैनल में एक और fluorochrome से spillover के मुद्दों को संबोधित करने में महत्वपूर्ण हैं । अधिग्रहण के बाद, डेटा प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इस आंकड़े को अनुकूलित फार्म Khoury एट अल.21में पुनर्मुद्रित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर bromodomain अवरोधकों के प्रभाव के प्रतिनिधि परिणाम । (क) दो के उदाहरण-पैरामीटर दोहरी रंग प्रतिदीप्ति EGFP बनाम DsRed घनत्व भूखंडों से untransfected कोशिकाओं (जैसे), कोशिकाओं transfected के १०० एनजी के साथ प्रpCMV-Tat101AD8-झंडा (+ जैसे) और कोशिकाओं के साथ इलाज DMSO, JQ1 (+) या JQ1 (-) । (B) 3 स्वतंत्र प्रयोगों से EGFP, DsRed या ब्याह उत्पाद (DsRed/DsRed + EGFP) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का अर्थ प्रतिशत (%) DMSO करने के लिए प्रत्येक शर्त की तुलना 2 तरह ANOVA परीक्षण का उपयोग किया गया । केवल सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण तुलनाएं दिखाई जाती हैं । *p < ०.०५; * *p < ०.०१; पी < ०.००१. काले लाइनों मतलब ± SEM. DMSO (1:5000), JQ1 (+) और JQ1 (-) (1 माइक्रोन) प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वायरस के सक्रियकरण को मापने में कठिनाई को देखते हुए पूर्व vivo, में इन विट्रो मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला समय पर विकसित किया गया था क्रम में अव्यक्त रूप से संक्रमित टी कोशिका लाइनों (जंमू-लाटों, ACH2, U1) सहित एचआईवी विलंबता का अध्ययन करने के लिए, आराम के अव्यक्त संक्रमण के प्राथमिक मॉडल ( O'Doherty, Lewin, ग्रीन और Spina मॉडल) या पूर्व-सक्रिय CD4 + टी कोशिकाओं (साहु, Marini, Planelles, Siliciano, Karn मॉडल) एकल दौर या प्रतिकृति सक्षम रिपोर्टर वायरस के साथ22. को आराम CD4 में एचआईवी विलंबता की शारीरिक स्थितियों मॉडल + टी कोशिकाओं, दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ऐसे RGH के रूप में परिचालित प्रणाली (लाल-ग्रीन एचआईवी) रिपोर्टर एक लीटर के साथ इवान Sadowski समूह द्वारा विकसित-झूठ-eGFP मार्कर और एक सीएमवी जगह में संचालित mCherry के Nef23. एक समान दोहरी रंग रिपोर्टर वायरस, डुओ-Fluo, ई. Verdin प्रयोगशाला द्वारा एक बाएं से संचालित EGFP अभिव्यक्ति और एक mCherry फ्लोरोसेंट एक EF1α प्रमोटर24द्वारा संचालित मार्कर के साथ विकसित किया गया था । इस प्रणाली में, EGFP Nef के स्थान पर वायरस के 3 ' अंत में डाला गया था । इन दोनों प्रणालियों में लिफाफे में विलोपन संक्रमण के कई दौर को रोकता है । इसके अलावा, दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संयोजन उत्पादक का पता लगाने की अनुमति देता है (eGFP + mCherry +) और अव्यक्त (eGFP-mCherry +) संक्रमित कोशिकाओं । हालांकि, दोहरी रंग रिपोर्टर वायरस की कई कमियों CD4 + टी कोशिकाओं में ध्यान देने योग्य थे अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं के प्रत्यक्ष संक्रमण के रूप में काफी हद तक टी कोशिकाओं23,24के सेलुलर सक्रियण स्थिति पर निर्भर है । वास्तव में, संक्रमण के बहुत कम दर CD4 आराम में इन दो रिपोर्टर वायरस का उपयोग कर मनाया गया था + टी कोशिकाओं:23 RGH के लिए ०.१% और DuoFluo25के लिए ०.२%. इसके अलावा, के रूप में सीएमवी प्रमोटर गैर सक्रिय कोशिकाओं में निचले स्तर पर व्यक्त किया जा दिखाया गया है26,27,28, एक निष्क्रिय सीएमवी या EF1α प्रमोटर अव्यक्त संक्रमित के आकलन के लिए नेतृत्व करेंगे आबादी.

हम उत्पंन किया है और एक नए एचआईवी संवाददाता वेक्टर विशेषता एक उच्च प्रवाह परख में विलंबता और वायरस reactivation की स्थापना का अध्ययन । हमारे स्क्रीनिंग विधि के लिए कई फायदे में शामिल है मैं) प्रतिलिपि का आकलन करने और एक साथ ब्याह करने की क्षमता के साथ लागत प्रभावशीलता, ii) एक एकल प्रयोग में दवाओं या संयोजन की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने की क्षमता, iii) त्वरित मूल्यांकन प्रवाह cytometry द्वारा LRAs का प्रभाव (30-45 मिनट के लिए ठेठ पढ़ने के समय ९६ अच्छी तरह से प्लेट फ्लोरोसेंट मापदंडों की संख्या से स्वतंत्र), iv) उच्च गतिशील रेंज, v) स्वचालित उच्च प्रवाह अभिकर्मक और प्रवाह cytometry रोबोट हथियारों और HTS मंच का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है, vi) एक प्रवाह cytometry कार्यक्षेत्र टेम्पलेट का उपयोग कर डेटा का तेजी से इलाज, सातवीं) निलंबन और अनुयाई कोशिकाओं के लिए इष्टतम, viii) मॉडल और luminescence और प्लेट रीडर माप (दोहरी luciferase जुगनू और Renilla), और ग्यारहवीं के लिए अनुकूलन क्षमता की सादगी) दरिद्र (९६-और ३८४-अच्छी तरह से खोपड़ी स्वरूपों) ।

एक LRA की प्रवृत्ति या LRAs का एक संयोजन को सक्रिय एचआईवी के लिए एक प्रकार का लीटर, प्रतिलेखन और ब्याह इस तरह EGFP और DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति संचालित हमारे एचआईवी ब्याह संवाददाता का उपयोग cytometry प्रवाह द्वारा जांच की जा सकती है । हालांकि, उपंयास LRAs के तालमेल परीक्षण से पहले, यह अत्यधिक एक दवा की सांद्रता की एक सीमा के लिए जोखिम के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता को मापने के द्वारा प्रत्येक LRA की शारीरिक स्थितियों का निर्धारण करने के लिए सिफारिश की है । इसलिए, जीना और मृत कोशिकाओं के मार्कर सहित झूठी सकारात्मक को खत्म करने और उच्चतम गुणवत्ता के परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । प्रवाह cytometry विश्लेषण का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू मुआवजा नियंत्रण या FMO है । यह अत्यधिक DsRed और उपाध्यक्ष विपरीत में EGFP + जनसंख्या की ंयूनतम spillover सुनिश्चित करने के लिए अकेले दाग नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, यह unstain कोशिकाओं को शामिल करके कोशिकाओं के लिए खाते के लिए आवश्यक है । अंत में, cytometer प्रदर्शन और डिटेक्टरों भर संवेदनशीलता का नियमित नियंत्रण ज्यादातर जब एक अध्ययन के लिए नमूनों को मापने समय की एक लंबी अवधि में फैले महत्वपूर्ण है ।

हालांकि प्रोटोकॉल अनुभाग में चर्चा नहीं की, वहां हमारे ब्याह रिपोर्टर प्रणाली की कई सीमाएं हैं । एक अधिक गहन चर्चा के लिए, कृपया हमारे पिछले प्रकाशन (Khoury एट अल., २०१८) देखें । एचआईवी mRNA के आंशिक रूप से या ब्याह वेरिएंट का निर्यात वायरल प्रोटीन rev और इन mRNA प्रजातियों में rev उत्तरदायी तत्व (RRE) के साथ अपने सहयोग से मदद की है29,30,31,३२। हमारी प्रणाली में Rev के एक्सप्रेस हमें की परमाणु प्रतिधारण के प्रमुख ब्लॉक दरकिनार करने की अनुमति दी गुणा ब्याह और ब्याह mRNAs अव्यक्त रूप से संक्रमित टी17 कोशिकाओं में मनाया और समझ कैसे LRAs प्रेरित प्रतिलेखन और ब्याह पर ध्यान केंद्रित इस प्रकार वायरस पुनः सक्रियण । इसके अलावा, यह देखते हुए कि हमारी प्रणाली 3 plasmids के अभिकर्मक की आवश्यकता है, हम HEK293T कोशिकाओं को चुना है क्योंकि इन कोशिकाओं की उच्च अभिकर्मक दक्षता । एक कैंसर सेल लाइन की तुलना में टी कोशिकाओं में सेलुलर कारकों के विभिंन लौकिक और स्थानिक उपलब्धता के कारण, यह टी सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं, जो महान प्रदान हो सकता है में HEK293T कोशिकाओं में हासिल ब्याह रिपोर्टर के परिणामों को मांय करने के लिए महत्वपूर्ण है उनके सीमित transfectability के कारण तकनीकी चुनौतियाँ. इसलिए DMRIE-सी जैसे अभिकर्मक के लिए वैकल्पिक डीएनए डिलिवरी रिएजेंट का उपयोग किया गया है, जो कि निलंबन कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए विशेष रूप से प्रभावी होना दिखाया गया है (उदा., Jurkat), या nucleofection Amaxa या नियॉन जैसे nucleofector तरीके अभिकर्मक प्रणाली है कि प्राथमिक CD4 + टी कोशिकाओं सहित मुश्किल से transfect कोशिकाओं के लिए एकल या एकाधिक plasmids के कुशल और विश्वसनीय वितरण की सुविधा के लिए सिद्ध किया गया है । वैकल्पिक रूप से, यह विलंबता के एक प्राथमिक सेल मॉडल में पूर्ण लंबाई वायरस के संदर्भ में इस रिपोर्टर प्रणाली परीक्षण के लिए दिलचस्प होगा aforementioned अभिकर्मक तरीकों का उपयोग कर । वास्तव में, एक rCD4 + टी सेल में मेजबान प्रतिलेखन, बढ़ाव और ब्याह कारकों की उपलब्धता में मतभेद एक LRA की क्षमता को सक्रिय करने के लिए अव्यक्त वायरस को प्रभावित कर सकते हैं । अंत में, हमारे मॉडल पता नहीं है कि LRA प्रतिलेखन को प्रभावित कर सकते हैं और गैरा कोशिकाओं का ब्याह, और क्या यह प्रतिकृति सक्षम वायरस पैदा कर सकते हैं. हालांकि, हमें संदेह है कि सेल में वृद्धि को मापने के द्वारा एचआईवी अमेरिका और सुश्री आरएनए जुड़े, यह संस्कृति supernatant में प्रतिकृति सक्षम वायरस के उत्पादन के लिए नेतृत्व करेंगे । इस सोने के मानक मात्रात्मक वायरस वृद्धि परख (QVOA)३३आयोजित करने से पुष्टि की जा सकती है ।

विलंबता की जटिल प्रकृति के कारण और कुशल वायरस पुनः सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए, एक बहुमुखी मिश्रित रणनीति३४की आवश्यकता हो सकती है । संभावित उपचार के लिए प्रतिलेखन और ब्याह, जो पहले विलंबता16,३५,३६ की स्थापना में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है सहित कई रास्ते को उत्तेजित करने की जरूरत है, ३७. हमारे लीटर से संचालित ब्याह रिपोर्टर दवाओं के एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग कि इष्टतम रूप से दोनों कदम, प्रतिलेखन और ब्याह लक्ष्य कर सकते हैं, अणुओं है कि कुशलता से synergize कर सकते है खोजने का मौका बढ़ाने की अनुमति होगी, जो एक कम करने के लिए नेतृत्व करेंगे खुराक स्तर और प्रत्येक दवा के इस प्रकार विषाक्तता.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलिया के NHMRC से प्रोजेक्ट ग्रांट APP1129320 और प्रोग्राम ग्रांट APP1052979 ने सपोर्ट किया था । हम आवश्यक निर्माण और इस काम के सफल समापन के लिए सलाह प्रदान करने के लिए डॉ एडम Wheatley, डॉ मरीना अलेक्जेंडर, डॉ जेनी एल एंडरसन और मिशेल Y. Lee धंयवाद । हम भी उनकी सलाह और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रवाह cytometer बनाए रखने में उदार सहायता के लिए DMI प्रवाह सुविधा कर्मचारियों का शुक्र है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 - 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ एचआईवी उच्च प्रवाह फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रतिलेखन ब्याह EGFP-DsRed
इन विट्रो में उच्च प्रवाह एचआईवी प्रतिलेखन और ब्याह पर विलंबता reversing एजेंटों के मूल्यांकन
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Khoury, G., Purcell, D. F. J. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

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