Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi
Summary
En avanceret mikroskop, der tillader hurtig og høj opløsning vil imaging isolerede plasma membranen og de omkringliggende intracellulære volumen, blive præsenteret. Integration af spinning disk og total interne reflection Fluorescens mikroskopi i én installation tillader live imaging eksperimenter til høje anskaffelses priser op til 3,5 s pr billedstak.
Abstract
I levende celler indebærer processer såsom vedhæftning dannelse omfattende strukturelle ændringer i plasma membranen og kraterets celle. For at visualisere disse meget dynamiske begivenheder, to komplementære lysmikroskopi teknikker, der giver mulighed for hurtig billeddannelse af levende prøver blev kombineret: spinning disk mikroskopi (SD) for hurtig og høj opløsning volumen optagelse og total interne reflection Fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi for præcise lokalisering og visualisering af plasmamembran. En omfattende og komplet imaging protokol bliver vist for at lede gennem prøveforberedelse, mikroskop kalibrering, billede dannelse og erhvervelse, hvilket resulterer i flerfarvet SD-JOHANNAS live imaging serien med høj spatio-temporal opløsning. Alle nødvendige billedet efterbehandling skridt til at generere multi-dimensional live imaging datasæt, dvs registrering og kombinationen af de individuelle kanaler, leveres i en selvstændig skriftlig makro for open source-software ImageJ. Billeddannelse af fluorescerende proteiner under indledningen og modning af adhæsion komplekser, samt dannelsen af actin cytoskeletal netværket, blev brugt som et bevis på princippet for denne nye fremgangsmåde. Kombinationen af høj opløsning 3D mikroskopi og JOHANNAS forudsat en detaljeret beskrivelse af disse komplekse processer inden for cellulære miljø og samtidig præcise lokalisering af membran-associerede molekyler blev fundet med en høj signal til baggrund ratio.
Introduction
Vores dage, lysmikroskopi teknikker giver høj/super opløsning imaging i faste og levende model i rivende udvikling. Super-opløsning teknikker såsom stimuleret emission udtynding (STED), struktureret belysning mikroskopi (SIM) og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM), henholdsvis, er kommercielt tilgængelige og aktiverer billeddannelse af subcellulært strukturer viser detaljer næsten på det molekylære plan1,2,3,4,5,6. Men disse tilgange stadig har begrænset anvendelighed for live imaging eksperimenter, hvor store mængder skal visualiseres med flere billeder pr anden erhvervelse hastighed. Sorter af stærkt dynamiske processer reguleret via plasma membran, fx endo- / exocytose, vedhæftning, migration eller signalering, forekommer med høj hastighed inden for store cellulære mængder. For nylig, for at fylde dette hul, en integreret mikroskopi teknik var foreslåede kaldet spinning disk-JOHANNAS (SD-JOHANNAS)7. Detaljeret flyvetilladelser JOHANNAS mikroskopi specifikt isolere og lokalisere plasmamembran8,9, mens SD mikroskopi er en af de mest følsomme og hurtig live imaging teknikker til visualisering og sporing af subcellulært organeller i cytoplasma10,11. Kombinationen af begge Billeddannende teknikker i en enkelt installation er allerede blevet realiseret i den forløbne12,13, dog mikroskopet præsenteres her (figur 1) Endelig opfylder kriterierne for at udføre live imaging SD-JOHANNAS eksperimenter af de nævnte processer på 3 billeder pr anden hastighed. Da denne mikroskop er kommercielt tilgængelige, er målet med dette manuskript at beskrive i detaljer og give open source-værktøjer og protokoller for image erhvervelse, registrering og visualisering forbundet med SD-JOHANNAS mikroskopi.
Opsætningen er baseret på en inverteret mikroskop tilsluttet to scan enheder via uafhængige havne – den venstre port er knyttet til SD-enhed og tilbage porten til scannerenheden for JOHANNAS foto-aktivering /-og blegemidler og eksperimenter. Op til 6 lasere (405/445/488/515/561/640 nm) kan bruges til magnetisering. For excitation og afsløring af fluorescens signal, enten et 100 x / NA1.45 olie eller 60 x / NA1.49 olie JOHANNAS mål, henholdsvis, har været ansat. Det udsendte lys er delt af en dichroic spejl (561 nm long-pass eller 514 nm long-pass) og filtreret af forskellige sporgruppe-pass filtre (55 nm bred centreret på 525 nm, 54 nm bred centreret på 609 nm for grøn og rød fluorescens, henholdsvis) placeret foran de to EM-CCD cam epoker. Bemærk venligst at mere tekniske detaljer om opsætningen er opført i Zobiak et al. 7. i JOHANNAS konfiguration, SD-enhed er flyttet ud af den lette vej inden for circa 0,5 s så at de samme to kameraer kan bruges til påvisning, giver mulighed for hurtigere at skifte mellem de to billeddiagnostiske modaliteter sammenlignet med ca 1 s, der blev rapporteret i seneste13 . Denne funktion gør det muligt dual channel samtidige erhvervelse, således 4 kanaler SD-JOHANNAS imaging på tidligere uovertruffen hastighed og nøjagtighed kan udføres. Derudover er tilpasning mellem SD og JOHANNAS billeder unødvendig. Justering af billede mellem de to kameraer, har imidlertid skal kontrolleres før du starter eksperimentet og korrigeres om nødvendigt. I den følgende protokol, blev en registrering korrektion rutine gennemført i en selvstændig skriftlig ImageJ makro. Derudover var makroen primært designet til at tillade en samtidige visualisering af SD- og JOHANNAS datasæt trods deres forskellige dimensionalitet. Selve softwaren erhvervelse ikke give disse funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette papir blev præsenteret den første vellykkede gennemførelse af SD og JOHANNAS mikroskopi i en konfiguration, der er egnet til at udføre levende celle imaging eksperimenter, dvs høje anskaffelses priser såsom 2 SD-JOHANNAS billedstakke pr. minut på 3 forskellige Stadium positioner, svarende til i alt 168 frames (circa 3 billeder pr. sekund), blev anskaffet. Få SD-JOHANNAS mikroskoper, der blev beskrevet tidligere12,13, primært mangel på t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker meget det videnskabelige samfund af University Medical Center Hamburg-Eppendorf for at støtte os med prøver til evaluering. Nemlig, vi takker Sabine Windhorst for NIH3T3 celler, Andrea Mordhorst for YFP-Vinculin og Maren Rudolph for RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
