在这里, 我们提出了两个方案, 一个用于测量特定的生长速率, 另一个是利用斑块分析和 rt-qpcr 来测量轮状病毒的细胞结合能力。这些协议可用于确认轮状病毒株之间表型的差异。
轮状病毒是婴儿腹泻的主要病因。它是一种双链 rna 病毒, 由于其变异率很高, 形成了基因多样化的种群, 被称为准物种。在这里, 我们描述如何测量轮状病毒作为其表型的特定生长速度和细胞结合能力。轮状病毒用胰蛋白酶治疗, 以识别细胞受体, 然后接种到 m104 细胞培养中。上清液, 包括病毒后代, 是间歇性收集的。斑块检测用于确认每个采集的上清液的病毒滴度 (斑块形成单位: pfu)。通过将 pfu ml 的时程数据拟合改进后的贡珀兹模型, 估计了具体的增长率。在细胞结合检测中, 24 孔板中的 m104 细胞感染轮状病毒, 在4°c 下孵育 90分钟, 以便轮状病毒吸附到细胞受体中。低温抑制轮状病毒侵入宿主细胞。在洗涤以去除未结合的病毒后, rna 从附着在细胞受体上的病毒中提取, 然后进行 cdna 合成和逆转录酶定量 pcr (rt-qpcr)。这些方案可用于研究病毒株之间的表型差异。
rna 病毒形成了一个基因多样化的群体, 被称为准物种1, 因为它们的突变率,2高于 dna 基生物。准物种的种群结构受种群遗传因素的影响, 包括突变、选择压力和遗传漂移。由于遗传多样性的原因, 单一遗传谱系内的菌株可能表现出不同的表型。例如, rachmadi 等人表明, 源于斑光纯化株 s7-pp3 的小鼠诺如病毒株对游离氯的敏感性是不同的.
轮状病毒 (龙生科轮状病毒属) 是非包有的 rna 病毒, 形成准物种2。除了上述群体遗传因素外, 基因组重组还影响轮状病毒的遗传多样性, 因为该病毒有11个分段基因组 4.轮状病毒主要在婴儿中引起腹泻, 2013年婴儿死亡人数估计约为 250000 人5 人。有两种疫苗在几个国家使用, 并有效地减轻了轮状病毒感染的负担, 但一些研究人员现在正在讨论疫苗逃逸突变体6,7, 8 的存在,9. 这些突变体的特性对于了解疫苗逃逸机制很重要。
在这里, 我们提出了两个检测的协议, 以评估轮状病毒的具体生长速度和细胞结合能力, 以了解字符串/突变体之间的表型差异。轮状病毒的生长曲线已在以前的 10份报告中提出, 但通常不测量特定增长率等生长参数。以前进行的细胞结合检测涉及免疫荧光染色技术11。我们在这里展示了更简单的方法, 使用斑块检测和 rt-qpcr, 使我们能够定量地讨论病毒表型的差异。这些方法适合轮状病毒表型的鉴定, 最终可能有助于构建对多种基因型有效的新疫苗。
我们测量特定生长速度的协议比以前的协议更容易, 可以适应其他病毒, 除非它们的细胞培养系统尚未建立。在这项研究中, 我们使用 rrv (G3P[3)), 因为这种菌株可以形成斑块比人类轮状病毒时使用 m104 细胞系。一些人轮状病毒株不能在这个细胞系中形成斑块。因此, 焦点形成单元 (ffu) 检测15或组织培养感染剂量 (tcid50) 中位数法 (tcid50) 可用于许多轮状病毒株16, 而不是斑块分析。所提出的确定特定生长率的协议可用于其他病毒类型, 但不适用于尚未建立细胞培养系统的病毒。在开始特定生长速度的实验之前, 最好在初步测试中提前了解病毒感染滴定仪何时开始增加并达到固定阶段。如果有太多斑块存在, 应在改变病毒样本的稀释率后再次进行斑块检测。感染后收集样本的时间也很重要, 因为如果错过了到达固定阶段的适当时间点, 指数增长阶段的坡度可能会被低估。在改进的贡珀兹模型的近似中, 应始终计算和检验确定系数。如果对修改后的贡珀茨模型的适用性较低, 则其他生长模型, 如修改后的逻辑模型12可能更可取。
在处理细胞时, 当去除培养基或病毒接种时, 用于清洗或琼脂糖凝胶进行斑块检测的 pbs 必须及时添加到细胞培养板的每口井中, 以防止细胞干燥。同时, 你必须轻轻地将 pbs 或琼脂糖倒进细胞, 不要脱离水井。这一步是这两种检测中最重要的一步 (第3.9 步和3.11 步)。如果斑块检测有太多的样本, 我们建议将琼脂糖凝胶 (建议每个最大100毫升) 细分为几个中等的瓶子, 并保持瓶子温暖, 直到使用前, 因为琼脂糖凝胶在大约10分钟内凝固在房间温度。由于胰蛋白酶容易受到17高温的影响, 因此应在充分冷却后, 在培养基和琼脂糖中添加胰蛋白酶溶液, 用于斑块检测。
在细胞结合试验中, 病毒与细胞结合的孵育必须在4°c 下进行, 以防止细胞的侵袭。根据 gilling 的方法13, 细胞在低温下容易干燥, 因此在孵育过程中每15分钟需要轻微晃动一次。这里使用的 rna 提取试剂盒可以替代其他试剂盒。rt-qpcr 标准曲线的斜率应在3.3 左右, 测定系数应大于0.98。与荧光显微镜相比, 该方法能直观地显示病毒在细胞中的定位, 因为荧光物质与病毒的结合是不必要的, 因此使用起来更快、更容易。
最近, 人类肠道肠素 (hie) 表现出与人胃肠道上皮相似的细胞组成和功能, 已可用于轮状病毒的传播18。hie 的使用可以使我们评估轮状病毒非可培养菌株的特定生长速度和细胞结合能力。此外, 这里描述的两个实验都可用于评估药物对两种表型的影响 19。本文提出的协议可以定量地讨论轮状病毒株在不同条件下表型参数值的变化。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 “卫生价值链: 将卫生系统设计为生态社区价值系统” 项目的支持, 人类与自然研究所 (rihn, No.14200107 项目)。
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |