यहां हम दो प्रोटोकॉल, विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए एक और कोशिका के लिए अंय रोटावायरस की बाध्यकारी क्षमता पट्टिका परख और RT-qPCR का उपयोग कर प्रस्तुत करते हैं । इन प्रोटोकॉल रोटावायरस उपभेदों के बीच phenotypes में अंतर की पुष्टि के लिए उपलब्ध हैं ।
रोटावायरस शिशु दस्त के लिए मुख्य etiological कारक है । यह एक डबल-कतरा (डी एस) आरएनए वायरस और एक आनुवंशिक रूप से विविध जनसंख्या रूपों, quasispecies के रूप में जाना जाता है, उनके उच्च उत्परिवर्तन दर के कारण । यहां, हम वर्णन कैसे विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए और सेल-रोटावायरस के अपने phenotypes के रूप में बाध्यकारी क्षमता । रोटावायरस trypsin के साथ इलाज के लिए सेल रिसेप्टर पहचान और फिर MA104 सेल संस्कृति में inoculated है । supernatant, जिसमें वायरल जिन्न शामिल हैं, में रहकर एकत्र होता है । पट्टिका परख के लिए वायरस titer (पट्टिका बनाने इकाई: pfu) प्रत्येक एकत्र supernatant की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विशिष्ट विकास दर संशोधित Gompertz मॉडल के लिए pfu/एमएल के समय-पाठ्यक्रम डेटा फिटिंग द्वारा अनुमानित है । सेल की परख में बाध्यकारी, एक 24-अच्छी तरह से थाली में MA104 कोशिकाओं रोटावायरस से संक्रमित है और रोटावायरस सोखना के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए सेल रिसेप्टर्स के लिए मशीन । एक कम तापमान मेजबान सेल पर हमला करने से रोटावायरस नियंत्रित । virions को दूर करने के लिए धोने के बाद, आरएनए सीडीएनए संश्लेषण और रिवर्स-प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) के बाद सेल रिसेप्टर्स से जुड़ी virions से निकाला जाता है. इन प्रोटोकॉल वायरल उपभेदों के बीच phenotypic मतभेदों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।
आरएनए वायरस एक आनुवंशिक रूप से विविध जनसंख्या, quasispecies1के रूप में जाना जाता है, क्योंकि उनके उत्परिवर्तन दर,2 जो डीएनए की तुलना में अधिक है आधारित जीवों के रूप में । quasispecies में जनसंख्या संरचना उत्परिवर्तन, चयन दबाव, और आनुवंशिक बहाव सहित जनसंख्या आनुवंशिक कारकों से प्रभावित है । एक आनुवंशिक वंश के भीतर उपभेदों आनुवंशिक विविधता की वजह से अलग phenotypes दिखा सकते हैं । उदाहरण के लिए, Rachmadi एट अल. दिखाया गया है कि मुक्त क्लोरीन संवेदनशीलता murine नोरोवायरस उपभेदों है कि एक पट्टिका-शुद्ध तनाव S7-PP33से उत्पंन के बीच अलग था ।
Rotaviruses (जीनस रोटावायरस reoviridae परिवार में) गैर quasispecies2के गठन डी एस आरएनए वायरस हैं । जनसंख्या आनुवंशिक कारकों के अलावा ऊपर वर्णित है, जीनोम reassortment रोटावायरस की आनुवंशिक विविधता को प्रभावित करता है क्योंकि इस वायरस के 11 खंडों जीनोम4है । Rotaviruses कारण दस्त मुख्य रूप से शिशुओं के बीच, और २०१३ में शिशु की मृत्यु के बारे में अनुमानित थे २५०,०००5. दो टीके कई देशों में उपयोग में हैं और रोटावायरस संक्रमण के बोझ को कम करने में कारगर रहे हैं, लेकिन कुछ शोधकर्ताओं ने अब वैक्सीन की मौजूदगी की चर्चा-एस्केप म्यूटेंट6,7,8, 9. इन म्यूटेंट के लक्षण वर्णन के लिए टीका-भागने तंत्र को समझना जरूरी है.
यहां, हम दो परख के लिए विशिष्ट विकास दर और सेल रोटावायरस के बंधन की क्षमता के मूल्यांकन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए उपभेदों के बीच phenotypic मतभेदों को समझने के लिए/म्यूटेंट । rotaviruses की वृद्धि वक्र पिछले रिपोर्ट10में प्रस्तुत किया गया है, लेकिन इस तरह के विशिष्ट वृद्धि दर के रूप में वृद्धि मापदंडों आमतौर पर मापा नहीं कर रहे हैं । एक सेल बाध्यकारी परख पहले आयोजित immunofluorescent धुंधला तकनीक11शामिल है । हम यहां पट्टिका परख और आर टी-qPCR, जो हमें मात्रात्मक वायरल phenotypes में अंतर पर चर्चा करने की अनुमति का उपयोग कर के आसान तरीके दिखाओ । इन तरीकों रोटावायरस phenotypes के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है और अंततः नए टीके के निर्माण के लिए कई पादी के लिए प्रभावी योगदान कर सकते हैं ।
विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए हमारे प्रोटोकॉल पिछले वाले से आसान है और अंय वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जब तक उनके सेल संस्कृति प्रणाली अभी तक स्थापित नहीं किया गया है । इस अध्ययन में, हम RRV (G3P [3]) का इस्तेमाल किया क्योंकि इस तनाव सजीले टुकड़े मानव rotaviruses से आसानी से फार्म कर सकते हैं जब MA104 सेल लाइनों का उपयोग कर. कुछ मानव रोटावायरस उपभेदों इस सेल लाइन में पट्टिका फार्म नहीं कर सकते । इसलिए, बजाय पट्टिका परख, यूनिट (FFU) परख15 या माध्य ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50) परख के गठन के कई रोटावायरस उपभेदों16के लिए लागू किया जा सकता है । विशिष्ट वृद्धि दर निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य वायरस प्रकारों के लिए किया जा सकता है लेकिन वायरस के लिए उपयुक्त नहीं है जिसके लिए कोई स्थापित सेल कल्चर सिस्टम स्थापित नहीं है. विशिष्ट विकास दर के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले, यह पहले से पता करने के लिए बेहतर है जब वायरस संक्रामक titer को बढ़ाने के लिए शुरू होता है और एक प्रारंभिक परीक्षण में स्थिर चरण में पहुंचता है । यदि बहुत अधिक पट्टिकाएं मौजूद हों, तो वायरस के नमूनों की कमजोर दर को बदलने के बाद पट्टिका परख फिर से आयोजित की जानी चाहिए । घंटे के बाद संक्रमण (hpi) के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए भी महत्वपूर्ण है क्योंकि घातीय वृद्धि चरण की ढलान को कम करके आंका जा सकता है अगर उचित समय बिंदु को स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए याद किया जाता है । संशोधित Gompertz मॉडल द्वारा सन्निकटन में, दृढ़ संकल्प के एक गुणांक हमेशा की गणना की जानी चाहिए और जाँच की. यदि संशोधित Gompertz मॉडल के लिए फिटनेस कम है, ऐसे संशोधित रसद मॉडल12 के रूप में अंय विकास मॉडल बेहतर हो सकता है ।
हैंडलिंग कोशिकाओं में, जब मध्यम या वायरस इनोक्युलम, धोने या पट्टिका परख के लिए agarose जेल के लिए पंजाबियों तुरंत एक सेल संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए सूखापन से कोशिकाओं को रोकने के लिए । एक ही समय में, आप धीरे से पंजाबियों या agarose कोशिकाओं को कुओं से अलग नहीं डालना चाहिए । यह कदम दोनों परख (चरण ३.९ और ३.११) में सबसे महत्वपूर्ण है । यदि पट्टिका परख भी कई नमूने है, हम agarose जेल (१०० एमएल प्रत्येक अधिकतम सिफारिश की है) कई मध्यम बोतलों में विभाजित करने की सिफारिश और बोतल गर्म रखने के बाद से ही प्रयोग से पहले agarose जेल के बारे में 10 मिनट के भीतर जम जाता है तापमान. चूंकि trypsin उच्च तापमान17की चपेट में है, एक trypsin समाधान पर्याप्त रूप से ठंडा करने के बाद पट्टिका परख के लिए एक मध्यम और agarose को जोड़ा जाना चाहिए ।
सेल में बाध्यकारी परख, कोशिकाओं को बाध्यकारी वायरस के लिए गर्मी 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए कोशिकाओं के आक्रमण को रोकने के लिए । है गिल विधि13के अनुसार, कोशिकाओं को कम तापमान पर सुखाने के लिए प्रवण हैं, तो मिलाते हुए कोमल हर 15 मिनट में आवश्यक है मशीन के दौरान । आरएनए निष्कर्षण यहां का उपयोग किट अंय किट के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । RT-qPCR में मानक वक्र की ढलान लगभग ३.३ होना चाहिए, और दृढ़ संकल्प के गुणांक से अधिक ०.९८ होना चाहिए । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तुलना में कोशिकाओं में वायरस के स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए, परख और अधिक तेजी से और आसान उपयोग करने के लिए है क्योंकि वायरस के लिए फ्लोरोसेंट पदार्थों के बंधन आवश्यक नहीं है ।
हाल ही में, मानव आंत्र enteroid (हिे), एक समान सेलुलर संरचना और मानव जठरांत्र उपकला के रूप में समारोह का प्रदर्शन, रोटावायरस प्रचार के लिए उपलब्ध हो गया है18. हिे का उपयोग हमें विशिष्ट वृद्धि दर और रोटावायरस के गैर culturable उपभेदों के सेल-बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम हो सकता है । इसके अलावा, दोनों प्रयोगों यहां वर्णित दोनों phenotypes19पर दवा प्रभाव के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इसे मात्रात्मक विभिंन स्थितियों के तहत रोटावायरस उपभेदों के phenotype पैरामीटर मूल्यों में परिवर्तन पर चर्चा करने के लिए संभव बनाते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम “स्वच्छता मूल्य श्रृंखला: पारिस्थितिकी के रूप में स्वच्छता प्रणालियों डिजाइनिंग सामुदायिक मूल्य प्रणाली” परियोजना, मानवता और प्रकृति के लिए ResearchInstitute (RIHN, परियोजना No. 14200107) का समर्थन किया गया था ।
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |