Her presenterer vi to protokoller, en for å måle den spesifikk vekstraten og den andre cellen-bindende mulighet for rotavirus plakk analysen og RT-qPCR. Disse protokollene er tilgjengelig for å bekrefte forskjellene i fenotyper mellom rotavirus stammer.
Rotavirus er paranoid Hovedfaktoren for infantile diaré. Det er en dobbel-strandet (ds) RNA-virus og danner en genetisk ulike befolkning, kalles quasispecies, på grunn av deres høye Mutasjonshastigheten. Her beskriver vi hvordan måle den spesifikk vekstraten og celle-bindende evne til rotavirus som sin fenotyper. Rotavirus er behandlet med trypsin å gjenkjenne celle reseptor og deretter inokulert i MA104 cellekultur. Nedbryting, inkludert viral progenies, samles midlertidig. Plakk analysen brukes til å bekrefte virus titer (plakk-forming enhet: pfu) av hver samlet nedbryting. Spesifikk vekstrate anslås ved passende tid-retters data pfu/mL endret Gompertz modellen. I analysen av celle-binding, er MA104 celler i en 24-vel plate infisert med rotavirus og ruges i 90 min ved 4 ° C i rotavirus adsorpsjon til celle reseptorer. En lav temperatur begrenser rotavirus fra invadere vert cellen. Etter vask for å fjerne ubundet virions, er RNA Hentet fra virions knyttet til celle reseptorene etterfulgt av cDNA syntese og omvendt-transkripsjon kvantitative PCR (RT-qPCR). Disse protokollene kan brukes for å undersøke de fenotypiske forskjellene viral stammer.
RNA-virus danner en genetisk ulike befolkning, kjent som quasispecies1, deres Mutasjonshastigheten,2 som er høyere enn DNA-baserte organismer. Befolkningen strukturen i quasispecies påvirkes av befolkningen genetiske faktorer, inkludert mutasjon, utvalg press og genetisk drift. Belastninger innenfor en enkelt genetisk avstamning kan vise Norge på grunn av genetisk mangfold. For eksempel viste Rachmadi et al. at gratis klor følsomhet var forskjellig blant murine norovirus stammer som stammer fra en plakett-renset belastning S7-PP33.
Rotaviruses (slekt rotavirus i reoviridae familien) er ikke innhyllet ds RNA virus danner quasispecies2. I tillegg til befolkningen genetiske faktorer beskrevet ovenfor, påvirker genomet reassortment genetisk mangfold av rotavirus fordi dette viruset har 11 segmentert genomer4. Rotaviruses forårsake diaré hovedsakelig blant barn og spedbarn dødsfall i 2013 var anslått om 250.0005. To vaksiner er i bruk i flere land og er effektive i å redusere byrden av rotavirus infeksjon, men noen forskere nå diskuterer tilstedeværelsen av vaksine-flukt mutanter6,7,8, 9. karakterisering av disse mutanter er viktig å forstå mekanismene som vaksine-escape.
Her presenterer vi protokoller for to analyser for å vurdere spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til rotavirus for å forstå fenotypiske forskjellene mellom stammer/mutanter. Vekstkurve av rotaviruses har blitt presentert i tidligere rapporter10, men vekst parametre som spesifikk vekstrate er ikke vanligvis målt. En celle-bindende analysen utført tidligere omfatter immunofluorescent flekker teknikk11. Her viser vi enklere metoder av benytter plakk analysen og RT-qPCR, som tillater oss å diskutere kvantitativt forskjellen i viral fenotyper. Disse metodene er passende for karakterisering av rotavirus fenotyper og endelig bidra til bygging av nye vaksiner effektivt for flere genotyper.
Våre protokollen for å måle den spesifikk vekstraten er lettere enn de foregående og kan tilpasses for andre virus hvis deres celle kultur-systemet ikke er ennå fastslått. I denne studien vi brukte RRV (G3P[3]) fordi denne belastningen kan danne plaketter enklere enn menneskelige rotaviruses ved MA104 linjer. Noen menneskelige rotavirus stammer form ikke plakk i denne cellen linje. Derfor, i stedet for plakk analysen, fokus danner enhet (FFU) analysen15 eller median vev kultur smittsomme dose (TCID50) analysen kan brukes for mange rotavirus stammer16. Presentert protokollen for å bestemme spesifikke veksten kan brukes for andre virus, men er ikke egnet for virus som ingen etablert celle kultur-systemet er etablert. Før du starter eksperimentet for bestemte veksten, det er bedre å vite på forhånd når virus smittsomme titer begynner å øke og når den stasjonære fasen i en foreløpig test. Hvis det finnes for mange plaketter, bør plakk analysen utføres igjen etter endre fortynning hastigheten av virus eksemplar. Timer etter infeksjon (hpi) for oppsamling er også viktig fordi skråningen av eksponensiell vekstfase kan undervurderes hvis det riktig tidspunktet å nå den stasjonære fasen er savnet. I tilnærmingen til endrede Gompertz forretningsmodell, bør en determinantens koeffisient alltid beregnes og sjekket. Hvis fitness endret Gompertz modellen er lav, målbudsjett andre vekst modeller som endret logistikk model12 .
I håndtering celler, når du fjerner middels eller virus inoculum, PBS for vask eller agarose gel for plakk analysen raskt legges til hver brønn av en celle kultur plate å hindre cellene fra tørrhet. Samtidig, må du forsiktig helle PBS eller agarose celler ikke å koble fra brønner. Dette trinnet er det viktigste i begge analyser (trinn 3.9 og 3.11). Hvis plakk analysen har for mange eksempler, anbefaler vi subdividing agarose gel (100 mL hver maksimalt anbefales) i flere medium flasker og holde flasker varme før like før bruk siden agarose gel er styrket innen ca 10 min på rommet temperatur. Siden trypsin er utsatt for høy temperatur17, bør en trypsin løsning legges til et medium og agarose for plakk analysen etter tilstrekkelig nedkjøling.
I celle-bindende analysen, må inkubasjonstiden for virus binding til cellene gjøres i 4 ° C å hindre invasjon av cellene. Ifølge Gillings metode13er celler utsatt for tørke ved lave temperaturer, så forsiktig risting er nødvendig hvert 15 min under inkubasjon. RNA utvinning kit benyttes her kan erstatte andre kits. Skråningen av standardkurve i RT-qPCR bør være ca 3,3 determinantens koeffisient bør være mer enn 0,98. Forhold til fluorescens mikroskopet visualisere lokalisering av virus i celler, er analysen raskere og enklere å bruke fordi binding av fluorescerende stoffer virus ikke er nødvendig.
Nylig menneskelige intestinal enteroid (HIE), viser en lignende mobil komposisjon og funksjon som menneskelige mage epitel, har blitt tilgjengelig for rotavirus forplantning18. Bruk av HIE kan aktivere oss å evaluere spesifikk vekstrate og celle-bindende evne til ikke-culturable stammer av rotavirus. Også, begge eksperimenter beskrevet her kan brukes til evalueringen av narkotika effekter på både fenotyper19. Protokollene presenteres her gjør det mulig å diskutere kvantitativt endringene i fenotypen parameterverdier av rotavirus stammer under ulike forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av “The sanitær verdien kjede: utforme sanitær systemer som øko-Community verdisystem” prosjektet, ResearchInstitute for menneskeheten og natur (RIHN, prosjektet No.14200107).
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |