drosophila melanogaster में वायरल संक्रमण और मेजबान वायरस बातचीत के विश्लेषण की स्थापना
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे वायरस-मेजबान बातचीत का विश्लेषण करने के लिए नैनो-इंजेक्शन विधि और बुनियादी तकनीकों का उपयोग drosophila melanogaster में वीवो में वायरल संक्रमण स्थापित करने के लिए ।
Abstract
वायरस फैलने महामारी रोगों का एक प्रमुख कारण है । इस प्रकार, वायरस और मेजबान के बीच बातचीत को समझने की रोकथाम और वायरल संक्रमण के उपचार के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । फल मक्खी drosophila melanogaster एंटीवायरल कारकों के लिए स्क्रीन करने के लिए सबसे कुशल और उत्पादक मॉडल जीवों में से एक साबित हो गया है और वायरस की जांच-मेजबान बातचीत, शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण के कारण और अत्यधिक संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मार्ग । यहां वर्णित प्रक्रिया वायरल संक्रमण स्थापित करने और वयस्क मक्खियों में प्रणालीगत एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए एक नैनो-इंजेक्शन विधि को दर्शाता है । इस विधि में वायरल इंजेक्शन खुराक का सटीक नियंत्रण उच्च प्रयोगात्मक पुनरुद्दयता सक्षम बनाता है । इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल मक्खियों और वायरस, इंजेक्शन विधि, जीवित रहने की दर विश्लेषण, वायरस लोड माप, और एक एंटीवायरल मार्ग मूल्यांकन की तैयारी में शामिल हैं । मक्खियों की पृष्ठभूमि द्वारा वायरल संक्रमण के प्रभाव प्रभाव यहां उल्लेख किया गया था । इस संक्रमण विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और मात्रात्मक repeatable; यह वायरस-होस्ट बातचीत में शामिल मेजबान/वायरल कारकों के लिए स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है और वायरल संक्रमण के जवाब में जन्मजात प्रतिरक्षा संकेतन और अन्य जैविक रास्ते के बीच crosstalk को काटना ।
Introduction
उभरते वायरल संक्रमण, विशेष रूप से आर्बोवायरस द्वारा, जैसे चिकुनगुनिया वायरस1, डेंगू वायरस, पीला बुखार वायरस2 और ज़िकावायरस3, महामारियां पैदा करके सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा रहा है 4. इस प्रकार, वायरस की एक बेहतर समझ-मेजबान बातचीत महामारी नियंत्रण और मनुष्यों में वायरल रोगों के उपचार के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है । इस लक्ष्य के लिए, और अधिक उपयुक्त और कुशल मॉडल वायरस संक्रमण अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए ।
फल मक्खी, drosophilamelanogaster (डी. melanogaster), वायरस की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है-मेजबान बातचीत5,6 और मानव वायरल रोगों का अध्ययन करने के लिए सबसे कुशल मॉडलों में से एक साबित हो गया है7 , 8 , 9. अत्यधिक संरक्षित एंटीवायरल संकेतन रास्ते और अतुलनीय आनुवंशिक उपकरण मानव एंटीवायरल अध्ययन के लिए वास्तविक प्रभाव के साथ महत्वपूर्ण परिणाम का उत्पादन करने के लिए एक महान मॉडल मक्खियों बनाते हैं । इसके अलावा, मक्खियों को प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए आसान और सस्ता कर रहे हैं और उपन्यास विनियामक कारकों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए सुविधाजनक हैं6,10 वायरस और मेजबान में संक्रमण के दौरान.
चार प्रमुख अत्यधिक संरक्षित एंटीवायरल रास्ते (उदाहरणके लिए, आरएनए हस्तक्षेप (rna) मार्ग11, जंमू कश्मीर-स्टेट मार्ग12, NF-κb मार्ग, और autophagy मार्ग13) अच्छी तरह से drosophila में अध्ययन कर रहे है हाल ही में साल6. rnai मार्ग एक व्यापक एंटीवायरल तंत्र है जो वायरस संक्रमण के सबसे प्रकार को दबा सकता है6,14. डिकर-2 (dcr-2) या अरगोनौटे 2 (AGO2) जैसे जीन में उत्परिवर्तन द्वारा इस मार्ग के विघटन से बढ़ी हुई वायरस टिटर और मेजबान मृत्यु दर15,16,17हो सकती है । जीजैक-स्टेट मार्ग को डिसस्टोविरिडी परिवार और कीटों में फ्लैव्रिडी परिवार से वायरस द्वारा संक्रमण के नियंत्रण में फंसाया गया है, उदाहरणके लिए, मक्खियों में ड्रोसोफिला सी वायरस (डीसीवी)16 और पश्चिम नील नदी वायरस (wnv) और डेंगू वायरस में मच्छर18,19. drosophila टोल (मानव nf-κb मार्ग के लिए homologous) और प्रतिरक्षा की कमी (imd) रास्ते (मानव nf-κb और tnf मार्ग के समान) दोनों वायरस के आक्रमण से बचाव में शामिल हैं20,21, 22. autophagy वायरल संक्रमण है, जो अच्छी तरह से drosophila23,24में विशेषता है के विनियमन में शामिल एक और संरक्षित तंत्र है । इस प्रकार, इन मार्गों के उपन्यास नियामक कारकों की पहचान और इन एंटीवायरल सिग्नलिंग और अन्य जैविक रास्ते, जैसे चयापचय, उम्र बढ़ने, तंत्रिका प्रतिक्रिया और इतने पर के बीच विदारक crosstalk, आसानी से drosophila में स्थापित किया जा सकता है प्रणाली.
हालांकि drosophila में सबसे अच्छी तरह से स्थापित वायरल संक्रामक मॉडल आरएनए वायरस द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, अकशेरुका इंद्रधनुषी वायरस 6i (IV-6) द्वारा संक्रमण और कल्लिथिआ वायरस25मक्खियों में डीएनए वायरस के अध्ययन के लिए संभावित दिखाया है, 26. इसके अलावा, वायरस को ड्रॉसोफिलाके संक्रमण की अनुमति देने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जैसे इन्फ्लूएंजा वायरस9। इसने ड्रॉसोफिला स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के आवेदन को काफी विस्तार दिया है । इस प्रक्रिया में, हम एक उदाहरण के रूप में dcv का उपयोग करने का वर्णन कैसे drosophilaमें एक वायरल संक्रामक प्रणाली विकसित करने के लिए । dcv लगभग ९३०० न्यूक्लियोटाइड के एक सकारात्मक भावना एकल असहाय आरएनए वायरस है, 9 प्रोटीन27एन्कोडिंग. D. melanogasterके एक प्राकृतिक रोगज़नक़ के रूप में, dcv मेजबान के दौरान शारीरिक, व्यवहार और बेसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त वायरस के रूप में माना जाता है-वायरस बातचीत और सह-विकास28. इसके अतिरिक्त, अपनी तेजी से मृत्यु दर जंगली प्रकार मक्खियों में संक्रमण के बाद29मेजबान में प्रतिरोधी या अतिसंवेदनशील जीन के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोगी dcv बनाता है ।
हालांकि, drosophilaमें वायरल संक्रमण का अध्ययन करते समय चिंता के कई पहलू हैं । उदाहरण के लिए, सहजीवी जीवाणु wolbachia के लिए drosophila और मच्छर30,31,३२में आरएनए वायरस के प्रसार के एक व्यापक स्पेक्ट्रा को बाधित करने की क्षमता है । हाल के साक्ष्य एक संभव व्यवस्था है जिसमें wolbachia ब्लॉक sindbis वायरस (sinv) methyltransferase Mt2 अभिव्यक्ति की मेजबानी में३३के माध्यम से संक्रमण से पता चलता है । इसके अतिरिक्त, कीड़ों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि भी वायरल संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, जीन में प्राकृतिक बहुरूपता, pastrel (पीएसटी), drosophilaमें dcv संक्रमण के लिए संवेदनशीलता निर्धारित करता है३४,३५, whilst के loci ubc-E2H और CG8492 क्रिकेट पक्षाघात वायरस (crpv) और झुंड हाउस वायरस (fhv) संक्रमण, क्रमशः३६में शामिल हैं ।
विशेष तरीके से वायरस-मक्खियों में मेजबान बातचीत स्थापित करने के लिए, इस तरह के drosophila सेल लाइनों में मेजबान सेलुलर घटकों के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन के रूप में अनुसंधान प्रयोजनों के अनुसार चुना जाना चाहिए३७,३८, मौखिक संक्रमण आंत-विशिष्ट एंटीवायरल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए22,३९,४०, सुई चुभन४१,४२ या नैनो इंजेक्शन प्रणालीगत प्रतिरक्षा को उत्तेजित करने के लिए उपकला बाधाओं गुजर द्वारा जवाब. नैनो इंजेक्शन एक नियंत्रित एंटीवायरल प्रतिक्रिया और एक शारीरिक घाव४३के लिए प्रेरित करने के लिए वायरल खुराक को ठीक से नियंत्रित कर सकता है, इस प्रकार उच्च प्रयोगात्मक पुनरुत्पादन की गारंटी४४। इस अध्ययन में, हम drosophilaमें वायरस-मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक नैनो इंजेक्शन विधि का वर्णन, मक्खियों के महत्व पर प्रकाश डाला ‘ पृष्ठभूमि प्रभाव.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, हम कैसे नैनो इंजेक्शन का उपयोग कर वयस्क drosophila melanogaster में एक वायरल संक्रामक प्रणाली स्थापित करने के लिए पर एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल उपयुक्त फ्लाई लाइनों और वायरस स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आईपीएस में पूरी पैन लैब का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । Cas. हम प्रयोगात्मक सहायता के लिए डॉ lanfeng वांग (आईपीएस, कैस) और डॉ गोनालो कॉर्डोवा steger (springer प्रकृति), dr. जेसिका वर्गास (आईपीएस, पेरिस) और dr. Seng झू (आईपीएस, पेरिस) टिप्पणियों के लिए धन्यवाद । एल. पी. (XDA13010500) और एच टी (XDB29030300), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन को एल पी (३१८७०८८७ और ३१५७०८९७) और जे वाई (३१६७०९०९) के लिए चीनी अकादमी ऑफ साइंसेज के सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा इस काम का समर्थन किया गया था । एल. पी कैस यूथ इनोवेशन प्रमोशन एसोसिएशन (२०१२०८३) के फेलो हैं ।
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
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