Summary

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Published: November 11, 2018
doi:

Summary

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Abstract

Les cellules souches neurales (CNS) sont multipotentes et peut donner lieu à trois types cellulaires majeurs du système nerveux central (CNS). La culture in vitro et l’expansion des CNS fournissent une source appropriée de cellules pour les chercheurs en neurosciences étudier la fonction des neurones et des cellules gliales ainsi que leurs interactions. Il existe plusieurs techniques signalés pour isoler des cellules souches neurales du cerveau mammifère adulte ou embryonnaire. Pendant l’opération microchirurgie pour isoler des CNS de différentes régions du SNC embryonnaire, il est très important réduire les dommages au cerveau des cellules pour obtenir le taux élevé de cellules souches vivantes et extensibles. Une technique possible pour la réduction du stress au cours de l’isolement de ces cellules du cerveau d’embryon de souris est la réduction du temps chirurgical. Ici, nous démontrons une technique mise au point pour l’isolement rapide de ces cellules de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire. Procédures chirurgicales incluent récolte d’embryons de souris13 E de l’utérus, coupant la fontanelle frontale de l’embryon avec une pointe d’aiguille tordue, extraire le cerveau du crâne, microdissection du cerveau isolé de récolter l’éminence ganglionnaire, dissociation du tissu récolté dans le milieu du NSC pour obtenir une suspension de cellules du même et enfin électrodéposition de cellules en suspension pour générer des neurospheres.

Introduction

Des cellules souches neurales (CNS) résident dans différentes régions du cerveau adulte et de l’embryon, et ils ont tendance à générer différents types de neurones et cellules gliales1. Les zones sous-ventriculaire dans le cerveau des mammifères adultes2 et éminence ganglionnaire dans le cerveau de l’embryon sont NSC riches régions3. Dans le développement du cerveau, l’éminence ganglionnaire fournit la plupart des interneurones corticaux et particulièrement GABAergique interneurones3. Il y a aussi des méthodes moins invasives pour la production de cellules souches neurales de cellules souches embryonnaires (CSE) ou utiliser des cellules souches pluripotentes induites (CISP) qui réduisent la demande de l’animal. Malgré le fait que générer des CNS d’ESCs ou CISP est possible4,5, il a ses avantages et inconvénients par rapport à l’isolement des cellules souches neurales de l’adulte ou l’embryon cerveau6,7, 8. Les protocoles pour induire la différenciation des ces et CISP vers phénotypes neurones sont toujours temps et coût de consommation et le taux de succès (70-80 % Nestin cellules positives)5 est plus faible comparativement à isolement direct des CNS le cerveau animal ( plus de 99 % Nestin cellules positives)9. En outre, les cellules souches perdent leur tendance de stabilité et de la différenciation génétique après plusieurs passages10,11. Même s’il existe d’autres nouveaux rapports sur la conversion directe de cellules somatiques en CNS, ces cellules sont génétiquement modifiées et ne sont pas facilement accessibles dans chaque laboratoire12. Par conséquent, il y a toujours une grande demande pour isoler des cellules souches neurales dans le cerveau de l’animal ; Il est possible de réduire la quantité d’utilisation de l’animale en améliorant les techniques chirurgicales. En réduisant le temps chirurgical et en améliorant les techniques, il est possible de garder les cellules des dommages et d’obtenir le taux le plus élevé des CNS de chaque animal.

Ici, nous présentons une technique simplifiée et reproductible pour l’isolement de cellules souches neuronales du cerveau de souris E13 embryons.

Protocol

Toutes les chirurgies et les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de l’éthique animale de l’Institut de Royan, Téhéran, Iran. 1. préparation des Instruments chirurgicaux, lavage tampon (HEPES-MEM), milieux de Culture cellulaire et plaques de Culture cellulaire Stériliser les instruments chirurgicaux (ciseaux, poignée de lame de bistouri Swann-Morton et forceps) par autoclavage en fonction sur les lignes directrices de stérilisation systématique…

Representative Results

Micro-Dissection, l’isolement de cellules et Culture Neurosphère. Ici, nous avons présenté une méthode rapide et efficace pour la souris E13 cerveau microchirurgie et isolement des cellules souches neurales. Cet article montre qu’il est possible d’enlever tout le cerveau d’un crâne d’embryon de souris E13 à travers une rupture fine à fontanelle frontale. Avec cette méthode, le cerveau subit moins de dégâts et il est possible d’i…

Discussion

À l’aide d’une source de cellules souches neuronales est très important pour les chercheurs en neurosciences. Des cellules souches neurales pourraient être récoltés de différentes zones du cerveau de l’embryon et qu’ils peuvent générer des types spécifiques de neurones et les cellules gliales. Il existe plusieurs méthodes pour l’induction de la différenciation des cellules souches neurales de les amener à générer des neurones matures et les cellules gliales. Il y a de nombreux rapports indiquant q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Institut de Royan.

Materials

15 mL tubes Falcon 352097
50 mL tubes Falcon 352235
Adson Forceps, 12 cm, Straight WPI 14226
B27 Gibco 17504-44
bFGF Sigma F0291
bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
dish 10cm  Falcon 353003
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight WPI 15908
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight WPI 500342
EGF Sigma E9644
Ethanol Merck 100983 
Glutamate Sigma  G3291
Glutamax Gibco 35050061
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody Sigma AP307F
goat serum Sigma G9023
Heparin   Sigma h3149
HEPES Sigma 83264
HEPES Sigma 90909C
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle  SUPA medical A1SNL127
laminin sigma    L2020
MEM Sigma M2279
N2 supplement Gibco 17502048
NB medium Gibco 21103-31
Non-essential amino acid (NEAA) Gibco 11140050
PBS without Ca and Mg Gibco 20012050
Penicilin/ Streptomycin Gibco 5140122
Poly-L-ornithine Sigma  P4957
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody Sigma T2200
rabbit anti mouse GFAP antibody Sigma G4546
rabbit anti mouse Nestin antibody Sigma N5413
Scalpel Handle #3 WPI 500236
Scissors curve WPI 14396
Scissors sharp straight WPI 14192
Soybean trypsin inhibitor Roche 10109886001 
Tissue culture flasks, T25 BD 353014
Tissue culture flasks, T75 BD 353024
Tween 20 Sigma P1379
Vannas Scissors,  8 cm, Straight  WPI 14003
β-mercaptoethanol Sigma M6250

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Cite This Article
Homayouni Moghadam, F., Sadeghi-Zadeh, M., Alizadeh-Shoorjestan, B., Dehghani-Varnamkhasti, R., Narimani, S., Darabi, L., Kiani Esfahani, A., Nasr Esfahani, M. H. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58874, doi:10.3791/58874 (2018).

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