Summary
Her, er bioassays designet til at overvåge udviklingen af en svampe patogen, Colletotrichum fioriniae, i overværelse af blåbær eller tranebær blomsterarter udskrifter på glas coverslips beskrevet. Vand-, chloroform, og feltet regnvand - baseret floral udvinding teknikker er detaljerede samt indsigt i hvordan oplysningerne kan anvendes.
Abstract
Nøjagtigt overvåge Fænologi udløb bloom og tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på svampe frugt rådner patogener, blev floral udvindingsmetoder og coverslip bioassays udviklet, udnytte Colletotrichum fioriniae. I blåbær og tranebær styres dette patogen optimalt ved at anvende fungicider periode flor på grund af blomster rollespil i de indledende stadier af infektion. Protokollen detaljeret her beskriver hvordan floral ekstrakter (FE) er fremstillet ved hjælp af vand-, chloroform- og felt regnvand-baserede metoder til senere brug i tilsvarende glas coverslip bioassays. Hver FE tjente til at angive forskellige sæt af oplysninger: svar af C. fioriniae mobiliserede floral kemiske stikord i vand (vandbaseret), patogen svar til blomst og frugt overflade voks (chloroform-baseret) og felt-baseret overvågning indsamlet floral regnvand, flytte in vitro- bemærkninger til en landbrugs indstilling. FE er generelt betegnes som enten vand - eller chloroform-baseret, med en passende bioassay beskrevet for at kompensere for de iboende forskelle mellem disse to materialer. Regnvand, der havde kørt off blomster blev indsamlet i unikke enheder for hver afgrøde, hentyder til den fleksibilitet og anvendelsen af denne tilgang til andre afgrøder systemer. Bioassays er hurtig, billig, enkel og giver mulighed for at generere spatiotemporelle og områdespecifikke oplysninger om tilstedeværelsen af stimulerende floral forbindelser fra forskellige kilder. Denne information vil i sidste ende bedre informere sygdom strategier, som FE falde af fristerne for infektion at forekomme, hvilket giver indblik i skiftende risici for patogen infektion over vækstsæsonen.
Introduction
Colletotrichum fioriniae forårsager en frugt rådner af både Highbush blåbær (Vaccinium corymbosum L.) og de store amerikanske tranebær (V. macrocarpon Aiton)1,2. Dette patogen blev for nylig afgrænset fra C. acutatum arter komplekse3,4,5,6 og er en kausal agent af blueberry anthracnose og medlem af tranebær frugt rot komplekse, ud over forårsager talrige andre plante sygdomme på verdensplan7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner opstår under flor og symptom udvikling ikke bliver synlige, indtil frugten er i sidste fase af modning9. I blåbær og tranebær kontrolleret frugt rådner kun tilstrækkeligt med fungicid ansøgninger periode flor. Patogenet Overvintrer i hvilende blueberry blomster bud skalaer10 og sporulates under flor. Konidierne flyttes hele baldakinen via regn-splash spredning11,12 og inokulum oprustning er blevet stærkt korreleret til flor periode13. Svar af Colletotrichum arter til vært blomster er ikke enestående for Vaccinium, som blomster er vigtige komponenter af citrus post bloom frugt drop (PFD)14 samt jordbær anthracnose15, i begge tilfælde forårsager patogenet til sporulate. Alle disse tilfælde understrege behovet for effektive metoder til at evaluere de tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på C. fioriniae og andre patogener, der inficerer under flor. Den indsigt, som de metoder, der beskrives her bliver stadig mere værdifuldt.
Denne protokol beskriver metoder til blomster ekstrakt (FE) indkøb og guider evaluering af C. fioriniae svar til FE via glas coverslip bioassays15,16. Floral udvinding teknikker er opdelt i to hovedtyper; vandbaseret ekstraktion (aktiv-FE, passiv (pass -FE) og feltet regnvand-baseret (rw-FE)), og chloroform-baseret (ch-FE)17 ekstraktioner. Vand-baserede ekstraktioner mulighed for inspektion af vand mobiliseret floral kemiske signaler. Disse mobiliserede stikord er sandsynligvis vigtige komponenter Domstolens infektion da FE øger hastigheden af infektion16, ud over at give fugt kræves for infektion at forekomme. Derudover udgør de en mere naturlig tilstand som floral stimulation kan blive vasket hele baldakinen under befugtning-begivenheder som tidligere observerede i blåbær og andre afgrøde systemerne14,16. Chloroform-baserede floral ekstraktioner (ch-FE) også give værdifuld information vedrørende patogen svar til værten overflade voks17,18, belyse de tidlige vækst stadier af konidier engang deponeret på modtagelige værten organer (dvs. blomster, æggestokkene og udvikle frugt). Patogenet svar til sæsonbestemte ændringer i vært overflade voks kan også overvåges ved hjælp af denne protokol. Derfor, bioassays er skræddersyet til at arbejde med enten vandbaseret FE eller chloroform-baserede FE at afbøde de iboende forskelle mellem disse to materialer.
De data, der genereres fra bioassays afslørede at vandbaseret ekstraktion stimulere højere niveauer af sekundære conidiation end chloroform-baserede ekstraktioner hvor der var en definitiv appressorial svar, derfor implicere flere forbindelser stede i FE. Interessant nok, blev begge disse vækst svar observeret når ved hjælp af regnvand, der var løbet ud af blåbær og tranebær blomster, der angiver flere stimulerende forbindelser kan vaskes fra overfladen af blomster. Således vil overvågning for blomstermotiver stimulation give indsigt i sandsynligheden for, at patogenet succes i et landbrugssystem.
Det ultimative mål for denne protokol er at give en metode til generere baseline biologiske oplysninger om svampe plante patogener som svar på floral kemiske signaler, som igangsættende metoder, der kan udnytte denne floral oplysninger til støtte i lokationsspecifikke sygdom forvaltnings- og beslutningsprocedurerne processer.
Protocol
1. svampe isolater og Spore suspensioner
- Isolere Colletotrichum fioriniae fra en naturligt inficerede vært19. Derefter opbevares i rene kulturer på majsmel agar (CMA) slants. Placer stik af kultur (fra CMA skrå) ind på en standard plastic celle kultur parabol (9 cm i diameter) indeholdende enten afklaret V8 juice agar (cV8A) (modificeret fra Miller 1955), eller ikke afklaret V8 juice agar (V8A)20. Når kolonier begynder at sporulate, streak konidier (orange conidial masserne) ind på en anden cV8A eller V8A der indeholder celle kultur parabol (med en standard sterile loop) til at producere en high-density sporulating kultur.
Bemærk: Enhver protokol trin med svampe bør udføres i en Laminar flow hætte til at mindske risikoen for kontaminering af svampe kulturer og/eller bioassays. - Efter 7 dage af vækst, ved hjælp af en standard sterile løkke samle en lille mængde af konidier fra high-density kulturen (ved let berøring loop til den conidial masse) og rør det i en 15 mL centrifugeglas indeholdende 10 mL sterilt deioniseret vand (SDW). Vortex denne prøve for 10 s, så ved hjælp af en standard pipetteres springet op og ned mange gange til yderligere mix prøven.
- Derefter placere en dråbe af vortexed prøven ind på hemocytometer og estimere spore koncentrationer. Count 5-10 felter på hemocytometer, få gennemsnitlige, og multiplicere gennemsnittet af den passende fortyndingsfaktor (dvs. 10.000), hvorved man får den conidial koncentration pr. mL SDW.
- Derefter bruge en volumen (V) / koncentration (C) ligning (V1● [C1] = V2● [C2]) justere (med SDW) til 1,0 X 105 konidier pr. mL af SDW med en 5 mL endelige rumfang. Dette omtales som sporesuspensionen og er kun gjort umiddelbart før anvendelsen i enten bioassay.
2. aktiv, vandbaseret Floral ekstrakter (aktiv -FE)15,16
Bemærk: Se supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3og supplerende Movie 1.
- Omhyggeligt hånd-indsamle blåbær (April-maj) og tranebær (juni-juli) blomster under deres respektive peak blomstrer i feltet (supplerende figur 1). Slid og ændre nitrilhandsker mellem prøveudtagning steder (kultivarer/sorter/fysiske lokationer) at hæmme menneskelige hud olie forurening samt krydskontaminering mellem blomster sorter. Sted enten blåbær eller tranebær blomster (fra en enkelt kilde) i plastikposer (fylde et 100 x 150 mm pose) og straks opbevares i køleskab ved 4 ° C når blomster er indsamlet.
Bemærk: Aktiv - udvinding er ændret fra Leandro mfl. (2003) 16. - Før udvinding, fjerne enhver forringet, beskadigede, syge blomster, så ved hjælp af sund blomster fjerner æggestokkene, bægerblade og stilke med buet pincet (45˚ pincet) og kassér. Brug kun de resterende organer (corolla, stigmatisering, stil og støvdrager) for aktive - ekstraktioner. Skære ostelærred (150 x 150 mm) og placere i en 7 x 7 mm tragt, placere i en ren 50 mL-centrifugerør og afsat.
- Kombiner 1 del forarbejdet blomster til 9 dele SDW (1 wt: 9 vol ratio) i en morter. Forsigtigt male med en pistil for 30 s (Vær forsigtig til at ikke helt pulverisere prøverne). Strain resulterende papirmasse gennem rede ostelærred/tragt og indsamle i centrifugeglasset (50 mL). Ren eller bruge nye mørtel/pistil mellem hver ekstraktion med 95% EtOH og rindende varmt vand.
- Forberede et vakuum filtrering apparat: indsamle Buchner tragt, vakuum filter erlenmeyerkolbe (op til 1.000 mL kapacitet), 55 mm cirkel filtrerpapir og vakuum slange/kilde. Tilføj filter papir til en passende størrelse Buchner tragt og sted på toppen af kolben, så tilslut apparatet til en vand / suge kilde via vakuum slange og der er afsat.
- Yderligere klarlægge blueberry floral ekstrakter ved centrifugering i 10 min på 8,055 x g. Hæld supernatanten rede vakuum filter-apparatet, slår vakuumkilde, filtrere supernatanten, så hæld kolbens indhold i en ny centrifugeglasset (50 mL). Ren alle apparater komponenter mellem hver filtrering med 95% EtOH og rindende varmt vand. Yderligere filtreres gennem en sprøjte tilpasset med en 0,22 µm porestørrelse, acetat sterilisering, filter i en nye centrifugerør (50 mL).
- De cranberry floral partiallicenser, eneste vakuum filtreres gennem filtrerpapir og hælde kolbens indhold i en nye centrifugerør (50 mL).
- Resulterende forberedelse omtales som aktiv- blomster ekstrakt (aktiv -FE). Gemme alle vand-baserede floral ekstrakter (aktiv- passiv-, regnvand samlinger) ved-20 ° C i 5-50 mL alikvoter indtil eksperimenterende brug. Gentag ekstraktioner med flere prøver (mindst 3 ekstraktioner pr. prøvetypen) for at give replikater.
3. passive , vandbaseret Floral ekstrakter ( pass -FE) 16
Bemærk: Se supplerende Movie 2.
- Hånd indsamle hele blåbær blomster (50 g) som ovenfor, og opbevares i køleskab efter indsamling. Før udvinding, fjerne enhver forringet, beskadigede, syge blomster og fjerne kun stilke fra intakt blomst. Køleskab rede prøver, indtil passiv - udsugning, beskrevet nedenfor, er på plads.
- Skyl alle komponenter før brug med 95% ethanol (EtOH) og rindende varmt vand til at forhindre forurening (plast mesh ark, to plast mesh kurve, glas brød gryde og pumpe tåge flaske). Også forberede en 4 lag ostelærred/tragt/50 mL-centrifugerør for hver udvinding som beskrevet ovenfor (i trin 2.2), og der er afsat.
- Forberede sigten: Placer en plastik mesh ark (aka klart bar bund) i en plast mesh kurv (114 x 102 mm). Placer en anden, identisk mesh kurv hovedet (spejlvendt) i et glas brød-pan (127 x 229 mm) (for at undgå blomster sidder i SDW) og sted trådnet ark indeholdende kurv på toppen. Tilsættes 50 g af rede blomster i sigten.
Bemærk: Alternativt, små reagensglas [rense] kurve kan bruges i stedet for de oprindeligt brugt plast mesh kurve (gamle, grønne, jordbær mesh pint kurve er ofte svære at kilde). - Jævnt tåge blomster med 250 mL ved hjælp af en pumpe tåge flaske og fange afstrømning i glas brød-gryde. Derefter stamme filtratet gennem den forberedte ostelærred/tragt i en ren centrifugerør. Resulterende forberedelse betegnes som passive- blomster ekstrakt (pass -FE); gemme som pr ovenfor (trin 2.6).
- Ren alle komponenter mellem hver ekstraktion med 95% EtOH og rindende varmt vand. Gentag ekstraktioner med flere prøver at give flergangsbestemmelser (mindst 3 pr. prøvetypen).
4. chloroform-baserede Floral ekstrakter (ch-FE) 17
- Samle blåbær og tranebær blomster som pr ovenfor (trin 2.1), og forberede udvinding (trin 2.2, uden ostelærred/tragt forberedelse) blomster. Holde rede blomster nedkølet indtil før brug.
- Enhver udført med chloroform arbejde skal udføres i et stinkskab af sikkerhedsmæssige årsager. Dette omfatter forberedelse af materialer / glasvarer, ekstraktion procedurer og bioassay ledningsevne (trin ved hjælp af ch-FE).
- Rengør alle komponenter med 95% EtOH to gange og derefter to gange med chloroform at forhindre kontaminering for hver udvinding: gevind kultur glasrør, 2 glas bægre, små rustfrit stål skærm og en [glas] graduate cylinder. Der er afsat til at tørre op og ned. Skyl polytetrafluorethylen (PTFE) foret caps to gange med 95% EtOH kun (chloroform vil skade de ydre materialer af fælles landbrugspolitik), og der er afsat til tørre.
- Kombiner 1 del forarbejdet blomster til 9 dele chloroform (1 wt: 9 vol ratio) i et bægerglas (blomster derefter chloroform), forsigtigt hvirvel for 30 s og stamme gennem en rustfrit stål skærm i den anden bægerglas. Hæld kultur glasrør (10-15 mL) ch-FE fra det andet bægerglas og anbringer PTFE cap. Wrap fælles landbrugspolitik med parafilm at forhindre fordampning.
- Dette præparat er det chloroform-baserede blomster ekstrakt (ch-FE). Opbevares prøven i mørket (hen til nedskære lys nedbrydning) ved 4 ° C indtil eksperimenterende brug. Gentag ekstraktioner med flere prøver at give flergangsbestemmelser (mindst 3 pr. prøvetypen).
5. indsamling af regnvand fra blåbær blomster (BB rw-FE)16
Bemærk: Blåbær floral regnvand samling enhed består af en luft sprøjtepistol engangs maling spray cup med netværksadapteren (cup: indvendigt gevind, adapter: mandlige til mandlige tråd), 50 mL centrifugeglas (polypropylen), parafilm og plast belagt ledninger ( standard telefon wire, individuelle intern wire strand indholdet).
- Vælg flere steder inden for en blåbær busk til fange regnvand løber ud af blomster før oprettelse af strømaftagere. Disse omfatter direkte under blomsterstande (blomst) til den meget base af bush (crown). Optag diameter af stilke (lige fra 1-5 cm) på udvalgte steder, da dette vil diktere størrelsen af huller anvendes til enhed vedhæftede, beskrevet nedenfor.
- Opret en samling enhed for hver valgte placering. Først bore et hul i bunden af en spray cup (hvor kop kurver over gevind åbningen) til de tilsvarende stilk diameter, med en trin-bit knyttet til en Boremaskinen. Derefter, skære en lige linje fra toppen af thehole til mundingen af spray cup. Bore 4 ækvidistante huller (store nok til at tråd plastik belagt ledning), ved mundingen af spray cup, og fastgør den ene ende af plast belagt ledningerne forlader ene ende gratis.
- Bor et hul stort nok til at tråd maling sprøjte cup adapter i en 50 mL centrifugeres cap låg. Forsegle adapter tråde med parafilm at undgå utæt. Tillægge dette både centrifuge cap og gevind del af sprøjten cup. Vedhæfte skytterne 50 mL-centrifugerør.
- Gentag trin 5.3 5.4 for at oprette flere enheder pr udvalgte steder, et minimum af 4 samling enheder per prøvetagning placering.
- Installere enheder på udvalgte steder ved nedbøjning sprøjten kopper til at passe på stilke. Orientere den klippe-side af spray koppen opad ved hjælp af plast-belagt ledningerne fastgjort til andre stammer (for at forsikre vand passerer over blomster er fanget). Anbringe parafilm nogen åbninger, der kunne sive regnvand. (Supplerende figur 3, supplerende figur 4, supplerende figur 5og supplerende figur 6).
- Label indsamling rør med installation dato / tid. Efter en regn-event, fjerne og udskifte bunden (tube) del af centrifugeglasset (label dato / tid af samling). Bringe afstrømning samlinger (benævnt blueberry regnvand blomster ekstrakt (BB rw-FE)) inde og vakuum filter (filtrering beskrevet i trin 2,4-2,5). Butik som ovenfor (trin 2.6), indtil anvendes en vand-baserede bioassay.
6. indsamling af regnvand fra tranebær blomster (CB rw-FE)
- Floral regnvand samling enhed i tranebær består af en 7 X 7 cm polypropylen tragt, 50 mL centrifugeglas (polypropylen), parafilm, og 4 standard, plast belagt twist ties (pr. enhed).
- Første heat punktere 8 ækvidistante huller (diameter af twist ties) omkring munden af tragten ved hjælp af en metal sonde. Indsæt twist slips i 4 huller. Fastgør anden ende til at huller modsatte placering, danner en pæn passage mønster. Wrap tragt ned-stamceller med parafilm og der er afsat.
- Bor et hul stort nok til at indsætte tragt ned-stamceller i en 50 mL centrifugeres cap med lidt trin. Indsæt rede tragt i centrifuge cap. Gentag trin 6.2-6.3 for at oprette flere enheder, et minimum af 4 samling enheder per prøvetagning placering.
- Implementer mærket (dato/klokkeslæt) enheder i valgte tranebær moser. Pænt tuck to blomst bærende blomsterstande (kendt som stolper) under krydset plast twist slips. Derefter lodret orientere enheden ved piercing centrifugeglasset i tranebær baldakinen (supplerende tal 7-8, supplerende Movie 3).
- Efter nedbør eller overhead kunstvanding fjerne og erstatte den nederste (tube) del af centrifugeglasset (label dato / tid af samling). Bringe afstrømning (benævnt tranebær regnvand blomster ekstrakt (CB rw-FE)) inde og vakuum filter (filtrering beskrevet i trin 2,4-2,5). Butik som ovenfor (trin 2.6), indtil anvendes en vand-baserede bioassay.
7. bioassay med vand baseret Floral ekstrakter15,16 (aktiv-FE, pass-FE, rw-FE)
Bemærk: Se figur 1.
- Dette bioassay er udarbejdet i en Laminar flow hætte. Forberede materialer: tredobbelt skylles glas coverslips med 95% EtOH og luft tørre, derefter lægge. Klip papir håndklæde diske til den indvendige diameter af en standard plastic celle kultur retter (9 cm). Placere 2 lag af papir diske i kultur retter og blød med 2 mL SDW.
- Forbered mindst 5 mL af en 1,0 X 105 konidier pr. mL SDW sporeopslæmning (C. fioriniae) som pr ovenfor (trin 1.2-1.4), der er afsat. Næste, blande lige store mængder af SDW og vand-baserede blomster ekstrakt i 2 mL microcentrifuge rør. Derefter tilføje et lige saa stort volumen af sporesuspensionen forberedt 2 mL microcentrifuge rør (SDW plus FE); den resulterende forberedelse omtales som en blanding, vandige behandling. For kontrolelementet, udelader FE del og erstatte med SDW, at holde conidial koncentrationer konsekvent.
Bemærk: portionsstørrelse er afhængig af antal flergangsbestemmelser og tid-point. Typisk, dele ikke overstiger 500 µL. Når konidier og FE kombineres er bioassay begyndt, 0 h efter podning. - Placer pre rengjorte glas coverslips oven på vædet køkkenrulle inden for celle kultur parabol. Placer en 40 µL dråbe af vandige behandling blanding på midten af en coverslip. Gentag for ønskede behandlinger, herunder kontrol, lukke celle kultur parabol. Gentag i separat celle kultur retter for replikationer (mindst 3) og tid point (hver skål er for 1 gang point). Når alle behandlinger og replikater har været udleveret, placere alle replikerede celle kultur retter i en forseglet plastikbeholder (30 x 13 x 7 mm) og inkuberes ved 25° C i mørke.
- Føj 10 µL af fiksativ ligesom lactophenol bomuld-blå (20,0 g phenol krystaller, 20,0 mL 2,5% mælkesyre, 40.0 mL glycerol, 0.05 g bomuld blå) til dråber, stoppe væksten på forud fastsatte tidspunkter, og semi-mount.
- Vente 2 timer at indsamle 0 h tidspunkt som dette giver mulighed for conidial adhæsion til glasoverflade men er ikke lang nok til conidial spiring. For alle andre tidspunkter, tilføje fixativ på tilsvarende tid.
- Når et fiksativ er blevet tilføjet, omhyggeligt inverter coverslips, placere dem dråbe side ned på et glas objektglas til lette mikroskopisk undersøgelse (1 coverslip pr. dias). Når alle coverslips er på objektglas glas, lad dem bosætte sig og delvis tørre i flow hætte til 20 min.
- Tælle alle konidier (samlede konidier) præsentere på coverslip (primære konidier, spirede konidier og nydannede sekundære konidier) samt appressoria på enten 400 X forstørrelse (optælling 16 felter) eller 200 X (tælle 4 felter), sammentælling et område af 3.808 mm 2. kopiere hele bioassay for statistisk analyse. For assays bruger vandbaseret FE, analysere data som beskrevet i Waller et al. 201716, typisk vise som betyder count/mm2 (samlede konidier eller appressoria).
8. bioassay ved hjælp af Chloroform-baserede Floral ekstrakter (ch-FE)17
Bemærk: Se figur 2.
- Forberede materialer og celle kultur retter som pr ovenstående (trin 7.1). Derudover skyl et tilsvarende antal Van Tieghem celler (VanT. celler) (8 mm OD, 6 mm ID) til coverslips, samt et glas pipette (1 mL med 1 µl intervaller) i et stinkskab, (to gange med 95% EtOH derefter to gange med chloroform), og der er afsat.
- I laminar flow hood, bruger en 2 mL microcentrifuge tube tilføje to lige rumfang (mindst 500 µl) af SDW og 1 rumfang af Sporeopslæmningen, så der er afsat. Dette er den vandige behandling blanding til ch-FE bioassays.
- I et stinkskab, placere en VanT. celle på et glas coverslip inden for rede plast celle kultur parabol. Dispensere (med glas pipette) 33 µL af ønskede ch-FE ind i midten af cellen Van T. (ikke røre væggene i VanT. Celle; kontrol behandling, tilføje jomfru chloroform), og Lad det tørre. Gentag i separat celle kultur retter for replikationer (mindst 3).
- Når ch-FE har tørret, dispensere 99 µL af tilberedt vandig behandling blandingen med en standard pipetteres i midten af VanT. celle, så Luk alle celle kultur retter. Når den vandige behandling blanding er kommet i kontakt med de tørrede ch-FE behandlinger, er bioassay begyndt, 0 h efter podning.
- Når alle behandlinger og replikater har været udleveret, placere alle (lukket) celle kultur retter i en forseglet plastikbeholder (30 x 13 x 7 mm) og inkuberes ved 25° C i mørke.
- Føj 15 µL af fiksativ (lactophenol bomuld-blå) til VanT på forud fastsatte tidspunkter. celle og lad sidde i mindst 5 min. til at sikre passende svampe farvning. Efter tid, forsigtigt fjerne VanT. celle og følg coverslip inversion og data erhvervelse trinene ovenfor (skridt 7,5-7.6). Dataanalyse, Følg i Gager 201517, typisk viser data som appressorium formation, som er forholdet mellem total konidier at appressoria tælles i området observeret (3.808 mm2) beskrevne metoder.
9. tranebær Fænologi-baserede ekstraktioner17
- Hånd indsamle tranebær blomster (i juni; 100 g), umodne frugt (to gange; Juli og August; 200 g), og modne tranebær frugt ved høst (oktober; 200 g), sted i passende størrelse plastikposer og opbevares i køleskab ved 4 ° C umiddelbart efter opsamlingen. Bruge forurening forholdsregler skitseret ovenfor (trin 2.1).
Bemærk: Der vil være ekstra plantemateriale indsamlet på hver gang men disse beløb vogte udvinding naturligvis svampe inficerede æggestokke og frugt (viser symptomer og tegn på sygdom). - Før udvinding, fjerne enhver forringet, beskadigede, syge blomster, så brug kun sunde blomster, fjerne bægerblade, stilke, corollas, støvfang, stilarter og støvdragere med buet pincet (45 ° pincet) og kassere alle men æggestokkene. Når æggestokkene er indsamlet, udføre udvinding chloroform-baseret på en 1 wt: 9 vol ratio (detaljeret i trin 4.2-4.4, ved hjælp af kun æggestokke). Opbevare prøver indtil alle andre ekstraktioner er komplet, dvs. indtil bioassay ledningsevne.
- Når frugten er indsamlet, udføre en chloroform-baseret udvinding (trin 4.2-4.4, ved hjælp af indsamlet frugt i stedet for blomster), men tilsættes 10 g frugt til 90 mL chloroform og engang udvundet, tillade løsning til at fordampe til 9 mL (hvilket resulterer i en 10 g: 9 mL wt : vol. løsning).
- Gøre frugt ekstraktioner umiddelbart efter indsamling i juli, August og oktober. Gemme som pr ovenfor (trin 4.4), indtil alle ekstraktioner er indsamlet. Efter den sidste chloroform-baserede frugt ekstraktion, underkaste alle pønologien-baserede chloroform ekstrakter indsamlet til dette assay til chloroform-baserede bioassay og analysere i overensstemmelse hermed (trin 8,1-8.6).
Representative Results
Resultaterne præsenteres her er et par eksempler på de mange assays, der kan udføres ved hjælp af denne metode. Figur 1 er en illustreret guide til vandbaserede FE bioassay og er suppleret med figur 2 som følger til chloroform-baserede FE bioassay. Figur 3 giver en visuel guide til hvad man kan forvente ved mikroskopisk evaluering af C. fioriniae på 24 timer, i både vand - og chloroform-baserede bioassays (sammenlignet SDW kontrolelementer). Figur 4 detaljer en 24 h tidsforløb undersøgelse med C. fioriniae i nærværelse af sorten tranebær 'Stevens' ch-FE, og giver visuel reference til en import resultatet af denne forskning: FE faldt tid til at danne strukturer, der infektion i forhold til SDW. Figur 5 viser et eksempel på data indsamlet fra en coverslip bioassay bruger tranebær floral regnvandsafstroemning (CB "Blomst" rw-FE). Figur 6 repræsenterer et andet vigtigt resultat: floral æggestokken ch-FE var langt mere stimulerende end frugt ch-FE, der angiver betydningen af bloom i livscyklus C. fioriniae. Supplerende billeder og film giver vigtige visuals af blomster anvendes i ekstraktioner og floral regnvand samling enheder/installation, ud over film, at Visualiser aktiv- og passiv - udvinding ( vand-baseret) processer.
Figur 1 : Generel oversigt over den vandbaserede blomster ekstrakt (FE) bioassay. Denne analyse blev udnyttet til vandbaseret floral ekstrakter med både blåbær og tranebær blomster: aktiv -floral ekstrakter (aktiv-FE), passiv -floral ekstrakter (pass-FE) og floral regnvandsafstroemning (rw-FE). -FE del typisk udgør den eksperimentelle/variabel faktor. Omvendt-FE del kan forblive konstant og tid point/timer efter podning kan evalueres. Præference er gjort 4 felt analyse på 200 X forstørrelse. Forkortelser: Sterile deioniseret vand, SDW; Areal pr. synsfelt, A. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Generel oversigt over chloroform-baserede blomster ekstrakt (ch-FE) bioassay. Denne analyse blev udnyttet til både blåbær og tranebær (blomster, æggestokkene og frugt). Kun én type af vandige behandling blanding blev brugt i denne analyse, 1 del sporeopslæmning til 2 dele SDW (til at holde conidial koncentration konsekvent skyldes ch-FE fordampning). Denne analyse kan bruges til at sammenligne flere ch-FE (voks fra forskellige plante overflader) eller flere gang point/timer efter podning ved hjælp af en enkelt ch-FE. Forkortelser: Sterile deioniseret vand, SDW; Van Tieghem [glas] celler, vante. celle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Visuel sammenligning af Colletotrichum fioriniae vandbaseret FE og ch-FE. I denne analyse blueberry 'Bluecrop' (aktiv-FE, vand-baseret) (svampe isolat: BB #10) og tranebær 'Stevens' chloroform-baseret (ch-FE) (svampe isolat: CB-PMAP182) blomster ekstrakter sammenlignet med SDW kontrol. En dramatisk stigning i sekundære conidiation (ringe) og appressorium dannelse (pilespidser) blev observeret ved sammenligning af konidier i overværelse af SDW (kontrol) (A) til active-FE (B) på 24 h efter podning. Sekundær conidiation var dog ikke så tydeligt når man sammenligner chloroform bioassay SDW kontrol (C) til ch-FE (D); snarere, C. fioriniae vækst skiftede retning appressorial dannelse. Vist er et fælles svar på hver type, udvinding, vandbaseret og chloroform-baseret, uanset vært/blomstermotiver arter beskrevet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Tidsforløb undersøgelse (24 h) med Colletotrichum fioriniae i nærværelse af ch-FE. I dette assay, blev en SDW kontrol (A-D) og tranebær 'Stevens' ch-FE (E-F) visuelt inspiceret på 0, 6, 12 og 24 timer efter podning (et eksempel på variabel tid point i stedet for at sammenligne flere FE). Appressorium dannelse (pilespidser) begyndte på 6 h i ch-FE og steget støt i hele efterfølgende tid point. Denne resultater unddrager sig til en vigtig faktor for patogenet biologi periode flor: blomster afkortning af fristerne til at danne infektion strukturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Grafisk visning af data indsamlet ved hjælp af rw-FE i et bioassay. Regnvand løber ud af tranebær blomster (CB "Blomst" rw-FE) og jomfru regnvand, der ikke havde rørt nogen tranebær plantevæv ("Ground" rw-FE) fra en enkelt befugtning-event plus en standard aktive, tranebær vandbaseret blomster ekstrakt (CB aktive -FE) (positiv kontrol) og SDW (negativ kontrol) blev udsat for en vandbaseret coverslip bioassay og evalueret for C. fioriniae vækst. CB "Blomst" rw-FE havde det samme niveau af sekundære conidiation og appressorium dannelse som den standard CB aktiv-FE på 24 h efter podning, der angiver, at strømaftagere var effektive i at indfange floral stimulanser frigivet under en befugtning-event. Samlede konidier består af primær (deponeret), konidier og nydannede sekundære konidier. Bogstaver angiver betydelige forskelle på p < 0,05 ifølge Fischers mindste signifikant forskel test (LSD); store bogstaver, samlede konidier; små bogstaver, appressoria. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Tranebær Fænologi baseret ch-FE bioassay, besigtigelse. Disease management for frugt rådner svampe ofte indebærer bloom tid fungicid applikationer. Tranebær chloroform-baserede ekstrakter (ch-FE) fra flere vækststadierne af tranebær ('Stevens') var her, visuelt vurderet effekten af overflade voks på C. fioriniae på 24 h efter podning. Æggestokkene indsamlet i juni (A), umodne frugt indsamles i juli og August (B, C), høstede frugten indsamlet i oktober (D), og en SDW kontrol (E) blev inspiceret for appressorial dannelse (pilespidser). Æggestokken ch-FE havde det største omfanget af appressorial dannelse, der angiver, at denne plante Fænologi (bloom) er kritisk vigtigt at livscyklus af C. fioriniae. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: blåbær blomsterstand. Blueberry blomster blev indsamlet for ekstraktioner i fuldt flor (April-maj i New Jersey, USA) (vist 'Bluecrop'). Bemærk overlapningen af corollas/æggestokke fra tilstødende blomster og den overordnede arkitektur i Blomsterstanden sammenlignet med supplerende figur 2 (cranberry oprejst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: tranebær opretstående. Tranebær blomster blev indsamlet for ekstraktioner i fuldt flor (juni-juli i New Jersey, USA) (vist 'Stevens'). Bemærk varieret blomst stadier på en enkelt tranebær blomsterstand (oprejst), og de krogede vanddråbe bevarer formen af Blomsterkronen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: blåbær regnvand installation (blomst). Afsluttet blueberry floral regnvand samling enhed, placeret direkte under en klynge af blomsterstande. Bemærk den plastik-belagt ledning anvendes til lodret orientere enheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 4: blåbær regnvand installation (stem). Udfyldte blueberry floral regnvand samling enhed, placeret halvvejs nede på stænglen mellem en blomsterstand og kronen af bush. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 5: blåbær regnvand installation (crown). Afsluttet blueberry floral regnvand samling enhed, placeret i bunden af bush (crown). Bemærk plast belagt ledninger kan fjernes, hvis det er ikke nødvendigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 6: blåbær regnvand installation (jorden). Afsluttet jomfru regnvand samling enhed, placeret ved siden af blueberry buske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 7: tranebær regnvand installation (close-up). Afsluttet tranebær floral regnvand samling enhed, med to stolper gemt under pænt krydsede wire slips. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 8: tranebær regnvand deployment. Flere afsluttet tranebær floral regnvand enheder installeres i en mose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: aktiv, vandbaseret floral ekstrakter (aktiv -FE). Supplerende video støtte følgende trin 2.3-2.5.1. Blueberry 'Bluecrop' blomster blev brugt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Movie 2: passiv, vandbaseret floral ekstrakter (pass-FE). Supplerende video støtte følgende trin 3.3-3.4. Blueberry 'Bluecrop' blomster blev brugt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Movie 3: implementering af tranebær floral regnvand strømaftagere. Supplerende video støtte følgende trin 6.4. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Discussion
Bioassays påvisning af C. fioriniae svar på floral ekstrakter (FEs) blev udviklet til blåbær og tranebær frugt rot pathosystems, men let kan tilpasses andre gartneriafgrøder. Protokollen beskrevet ovenfor har været værdifulde i at erhverve mange vigtige datasæt, herunder, men ikke begrænset til: FE effekter på flere isolater af mange patogener, tidsforløb oplysninger vedrørende svampevækst stadier i overværelse af forskellige FEs, sammenligning af udvinding teknikker, inspektion af individuelle kemikalier på C. fioriniae vækst og differentiering, evaluering af individuelle blomst orgel ekstrakter, effekter af temperatur på C. fioriniae mens i FE, effekter af Fænologi afhængige voks ekstraktioner og floral regnvand effekter. Ved hjælp af disse teknikker har data genereret også givet en meget klarere forståelse C. fioriniae livets stadier og delvist belyser hvorfor perioden bloom er så kritisk, at kontrol med mange frugt rådner patogener.
I første omgang alle blomster blev behandlet identisk til aktivt-FE, men udpakningen er flyttet mod at bruge hele blomster. Floral dissektion var tidskrævende og havde meget lille effekt på bioactivity af den resulterende FEs. Dog enkelte blomstermotiver organer kan og har været evalueret ved hjælp af denne protokol, men stor omhu skal tages til ikke helt udblødte floral væv (supplerende film 1, med forholdsregler detaljerede taktfast 2.3), da dette kan resultere i frigivet svampe-toxic/statisk forbindelser ind i en FE, der kunne fordreje de mikroskopiske evalueringer. Mindre invasive ekstraktioner som pass -er FE (supplerende film 2) og rw-FE nu mere gunstig på grund af deres lethed af erhvervelse. Derudover kræver disse udvinding teknikker kun vakuum filtrering til at erhverve biologisk aktive floral kemiske signaler.
Blomsterne anvendes i alle ekstraktioner blev typisk afkølet til 0-3 dage før ekstrakt forberedelse. En udfordring i denne protokol er tidsstyring af FE omsætning (feltsamlingen gennem opbevaring af uddrag). Dette var forstærket af talrige prøver fra flere kilder og datoer. Frosne blomster er ikke blevet evalueret virkelige omfang, som optøede blomster vises forringet og misfarvet. Når den vandbaserede FEs er blevet forberedt, gentagen nedfrysning og optøning har vist nogen effekt på genindfrosset bioactivity af FE, så så længe som FE dog hurtigt efter bioassay forberedelse (levedygtige 3 år gammel FE).
Chloroform-baseret udvinding giver mulighed for undersøgelse af patogenet svar til tre-dimensionelle blomster/frugt overflade voks i et todimensionalt fly via ch-FE fordampning på glas coverslips. Men det er usandsynligt, at de faktiske krystallinske strukturer af voks deponeret fra ch-FE er identisk med den overflade, hvorfra de blev indsamlet. Betydning, supplerende teknikker skal gennemføres, hvis svampe svar på specifikke voks strukturer i vivo er det vigtigste fokus i undersøgelsen. Chloroform-baserede ekstrakter har brug for mere lagerplads vedligeholdelse end de vandbaseret ekstraktion. Ud over at holde ch-FE ekstrakter i mørke, PTFE foret cellekultur tube caps og parafilm forsegling wrap skal jævnligt kontrolleres for fordampning lækager og udskiftes efter behov.
Begrebet overvågning floral regnvandsafstroemning er forankret i tanken om at fremme lokationsspecifikke sygdom overvågningsværktøjer. Regnvand samling enheder kan tilpasses til mange andre plante arkitekturer, så længe enheden indsamling indfanger regnvand, der har kørt ud af blomster. Denne fremgangsmåde indeholder oplysninger om hvorvidt floral stimulation er til stede i feltet på ethvert givet tidspunkt og kan overvåges hele sæsonen. Alternativt, strømaftagere kan implementeres på flere baldakin steder til at bestemme hvor langt floral stikord er blevet vasket i nogen givet befugtning-event. I fremtidige eksperimenter, rw-FE vil diktere Hvornår fungicid programmer skal begynde og hvornår de kan sikkert ende. Derudover ved at overvåge Fænologi afhængige voks ekstraktioner (protokollen afsnit 9), er betydningen af perioden bloom patogen biologi blevet endnu tydeligere. Dette afsnit blev også medtaget for at udvise fleksibilitet for disse bioassays, giver metoder, der giver mulighed for side-by-side sammenligning af vært overflade voks, der er timeligt adskilt. De data, der genereres ved hjælp af blomsterarter udvinding teknikker og bioassays repræsenterer konkrete indikatorer for patogenet stimulation, specifikke kemiske klasser vigtige patogen biologi og mål for fremtidige kontrolstrategier.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke William S. Haines, Sr. begavet Cranberry Research Fund og New Jersey blåbær og tranebær forskning Rådet, Inc. for støtte. Vi takker også Jennifer Vaiciunas (vejledning og floral præparater), Christine Constantelos (svampe kultur og floral præparater), David Jones (floral præparater og udtræk), Langley Oudemans (floral præparater, filme/fotografering), Jesse Lynch (floral præparater), Roxanne Tumnalis (generel support), og mange studerende/sommer praktikanter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
