Summary
Her beskrives bioassay utviklet for å overvåke utviklingen av en fungal patogen, Colletotrichum fioriniae, i nærvær av blåbær eller tranebær floral ekstrakter på glass coverslips. Vann, kloroform og feltet regnvann - basert floral utvinning teknikker er detaljert og innsikt i hvordan denne informasjonen kan bli brukt.
Abstract
For å nøyaktig skjermen phenology blomst perioden og tidsmessige dynamikken i floral kjemiske signaler på sopp frukt råtnende patogener, ble floral utvinning metoder og dekkglassvæske bioassay utviklet utnytte Colletotrichum fioriniae. I blåbær og tranebær kontrolleres optimalt denne patogen ved å bruke soppmidler i bloom perioden på grunn av blomster rollespill i den innledende stadiet av infeksjon. Protokollen detaljert her beskriver hvordan floral ekstrakter (FE) ble hentet ved hjelp av vann-, kloroform og feltet regnvann-baserte metoder for senere bruk i tilsvarende glass dekkglassvæske bioassay. Hver FE var å gi et annet sett med informasjon: svar av C. fioriniae mobilisert floral kjemiske pekepinner i vann (vannbasert), patogen svar blomst og frukt overflaten voks (kloroform-basert) og feltet-basert overvåking av samlet floral regnvann, flytte i vitro observasjoner til landbruket setting. FE er generelt beskrevet som enten eller kloroform-vannbasert, med en passende bioassay beskrevet for å kompensere for den iboende forskjellen mellom disse to materialene. Regnvann som hadde kjørt av blomster var samlet i unike enheter for hver avling, samband med fleksibiliteten og anvendelsen av denne tilnærmingen for andre beskjære systemer. Bioassay er rask, enkel og billig, og gir muligheten til å generere spatiotemporal og områdespesifikke informasjon om tilstedeværelse av stimulerende floral forbindelser fra ulike kilder. Denne informasjonen vil til slutt bedre informere sykdom ledelse strategier, som FE redusere tiden det tar for infeksjon oppstår, gir innsikt i skiftende risiko for patogen smitte over vekstsesongen.
Introduction
Colletotrichum fioriniae forårsaker en frukt råte både Highbush blåbær (Vaccinium corymbosum L.) og den store amerikanske tranebær (V. macrocarpon Aiton)1,2. Denne patogen var nylig avgrenset fra C. acutatum arter kompleks3,4,5,6 og er en årsakssammenheng agent for blueberry anthracnose og medlem av tranebær frukt rot kompleks, i tillegg til forårsaker mange andre plante sykdommer verdensomspennende7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infeksjoner forekommer under bloom og symptom utvikling ikke bli tydelig til frukt er i sluttfasen av modning9. I blåbær og tranebær, er frukt råte tilstrekkelig kontrollert med soppdreper programmer i bloom perioden. Patogen overvintrer i sovende blåbær floral bud skalaer10 og sporulates under blomst. Conidia flyttes hele kalesjen via regn-splash spredning11,12 og inoculum buildup har vært sterkt korrelert til blomst perioden13. Response av Colletotrichum til verten blomster er ikke unikt for Vaccinium, som blomster er viktige komponenter av sitrus innlegget blomst frukt miste (PFD)14 samt jordbær anthracnose15, i begge tilfeller forårsaker den patogen sporulate. Alle disse tilfellene fremheve behovet for effektive metoder for å evaluere timelige dynamikken i floral kjemiske signaler på C. fioriniae og andre patogener som infisere under blomst. Innsikt levert av metodene som er beskrevet her blir stadig mer verdifull.
Denne protokollen detaljer metoder av planteekstrakter (FE) anskaffelser og guider evalueringen av C. fioriniae svar til FE via glass dekkglassvæske bioassay15,16. Floral utvinning teknikker er delt i to hovedtyper; vannbasert utdrag (aktiv-FE, passiv (pass -FE) og feltet regnvann-basert (rw-FE)), og kloroform-basert (lm-FE)17 utdrag. Vannbasert utdrag tillate inspeksjon av vann mobilisert floral kjemiske signaler. Disse mobilisert signaler er sannsynligvis viktige komponenter av infeksjon court, siden FE sterkt øker hastigheten på infeksjon16, i tillegg til å gi fuktighet kreves for infeksjon oppstår. I tillegg representerer en mer naturlig tilstand som floral stimulering kan vaskes gjennom kalesjen under wetting-hendelser som tidligere observert i blåbær og andre beskjære systemer14,16. Kloroform-baserte floral utdrag (lm-FE) også gi verdifull informasjon om patogen svar til verten overflaten voks17,18, Klargjørende tidlige vekst stadier av conidia en gang satt på utsatt vert organer (i.e. blomster, eggstokkene og utvikle frukt). Patogen response til sesongmessige endringer i vert overflaten voks kan også monitoreres bruker denne protokollen. Følgelig, bioassay er tilpasset arbeider med vannbasert FE eller kloroform-baserte FE å redusere den iboende forskjellen mellom disse to materialene.
Dataene fra bioassay avslørt at vannbasert utdrag stimulere høyere nivåer av sekundære conidiation enn kloroform-baserte utdrag hvor det var en definitiv appressorial respons, derfor implicating flere forbindelser i FE. Interessant, var begge disse vekst svar observert når bruke regnvann som hadde kjørt ut av blåbær og tranebær blomster, som angir flere stimulerende stoffer kan vaskes fra overflaten av blomster. Dermed vil overvåking for floral stimulering gi innsikt i sannsynligheten for patogen suksess i en landbruket systemet.
Det endelige målet med denne protokollen er å gi en metodikk for genererer planlagte biologiske informasjon om sopp plante-patogener svar på floral kjemiske signaler, samt initiering metoder som kan utnytte denne blomster informasjon til hjelp i områdespesifikke sykdom ledelse og beslutningsprosesser prosesser.
Protocol
1. fungal isolerer og Spore suspensjon
- Isolere Colletotrichum fioriniae en naturlig infiserte vert19. Deretter lagre ren kulturer på korn måltid agar (CMA) slants. Sett pluggen på kultur (fra CMA skråstilt) til en standard plast celle kultur parabol (9 cm diameter) som inneholder enten avklart V8 juice agar (cV8A) (endret fra Miller 1955), eller ikke-avklart V8 juice agar (V8A)20. Når kolonier begynner å sporulate, strek conidia (oransje conidial massene) på en annen cV8A eller V8A som inneholder celle kultur parabol (med en standard steril loop) for å produsere en høy tetthet sporulating kultur.
Merk: Protokollen trinn med sopp skal utføres i laminær strømning hette å redusere muligheten for forurensende sopp kulturer og/eller bioassay. - Etter 7 dager av vekst, med en standard steril loop samle en liten mengde conidia fra høy tetthet kultur (ved å trykke lett loopen conidial massen) og rør dette i en 15 mL sentrifuge rør som inneholder 10 mL steril deionisert vann (SDW). Vortex eksempelfilen for 10 s, deretter bruke en standard pipette kaste opp og ned flere ganger til ytterligere blanding prøven.
- Deretter Plasser en dråpe vortexed prøven på hemocytometer og beregne spore konsentrasjoner. Antall 5-10 feltene hemocytometer, få gjennomsnittet, og multiplisere gjennomsnitt med den aktuelle fortynningsfaktoren (dvs 10.000) få conidial konsentrasjon per mL SDW.
- Deretter med et volum (V) / konsentrasjon (C) formel (V1● [C1] = V2● [C2]) justere (med SDW) 1.0 X 105 conidia per mL SDW med 5 mL siste volum. Dette omtales som spore suspensjon og gjøres bare umiddelbart før å bruke i enten bioassay.
2. aktiv, vannbasert Floral utskrifter (aktiv -FE)15,16
Merk: Se supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3og supplerende film 1.
- Forsiktig hånd-samle blåbær (April-mai) og tranebær (juni-juli) blomster under deres respektive topp blomstrer i feltet (supplerende figur 1). Slitasje og endre nitrilhansker mellom prøvetaking steder (kultivarer/varianter/fysiske steder) å hemme huden olje kontaminering samt cross forurensning mellom floral varianter. Plassere blåbær eller tranebær blomster (fra én kilde) i plastposer (Fyll en 100 x 150 mm bag) og kjøle umiddelbart på 4 ° C når blomster er samlet.
Merk: Aktiv - utvinning er endret fra Leandro et al. (2003) 16. - Før ekstraksjon, Fjern eventuelle forverret, skadet, syk blomster og bruke friske blomster fjerne eggstokkene, kronblader og peduncles med buet tang (45˚ pinsett) og kast. Bruk bare de resterende organene (corolla, stigma, stil og stamen) for aktiv - utdrag. Kutte cheesecloth (150 x 150 mm) og plassere i en 7 x 7 mm trakt, plassere i en ren 50 mL sentrifuge rør og avsatt.
- Kombiner 1 del behandlet blomster til 9 deler SDW (1 wt: 9 vol ratio) i en morter. Forsiktig male med en støter for 30 s (ta vare å ikke helt pulverisere prøvene). Sil resulterende masse gjennom forberedt cheesecloth/trakt og samle i sentrifuge tube (50 mL). Rengjør eller bruke nye mørtel/pistil mellom hver ekstraksjon med 95% EtOH og varmt vann.
- Forberede en vakuum filtrering apparater: samle Buchner trakt, vakuum filteret Erlenmeyer kolbe (opptil 1000 mL kapasitet), 55 mm sirkel filterpapir og vakuum slange/kilde. Legge til filter papir til en passende størrelse Buchner trakt og plasser oppå kolbe, så kobler apparatet til vann / enkel sugeevnen kilde via sugeslange og sett til side.
- Videre avklare blåbær floral ekstrakter av sentrifugering i 10 min 8,055 x g. Hell av nedbryting i forberedt vakuum filter apparater, slå på vakuum kilde, filtrere nedbryting og hell kolbe innholdet i en ny sentrifuge tube (50 mL). Rengjør alle apparater komponenter mellom hver filtrering med 95% EtOH og varmt vann. Videre filtrere gjennom en sprøyte tilpasset en 0.22 µm porestørrelse, acetat sterilisering, filter til en ny sentrifuge tube (50 mL).
- Tranebær floral ekstrakter, bare vakuum filtrere gjennom filter papir og hell kolbe innholdet i en ny sentrifuge tube (50 mL).
- Resulterende forberedelse omtales som aktive- planteekstrakter (aktiv -FE). Lagre alle vannbasert floral ekstrakter (aktiv- passiv-, regnvann samlinger) på 20 ° C i 5-50 mL dele til rekreasjonsbruk. Gjenta utdrag med flere eksempler (minst 3 utdrag per eksempel type) for å gi gjentak.
3. passive , vannbasert Floral ekstrakter ( pass -FE) 16
Merk: Se ekstra filmen 2.
- Hånd samle hele blåbær blomster (50 g) som ovenfor, og kjøle etter innsamling. Før ekstraksjon, Fjern eventuelle forverret, skadet, syk blomster og fjerne bare peduncles fra intakt blomst. Kjøle forberedt prøver til passiv - utvinning systemet, beskrevet nedenfor, er på plass.
- Skyll alle komponenter før bruk med 95% etanol (EtOH) og varmt vann for å unngå forurens (plast mesh ark, to plast mesh kurver, glass brød pan og pumpe tåke flaske). Også forberede en 4 lag cheesecloth/trakt/50 mL sentrifuge rør for hver utvinning som beskrevet ovenfor (i trinn 2.2), og sett til side.
- Forberede silen: Plasser en plast mesh ark (aka klar bar matter) i en plast mesh kurven (114 x 102 mm). Plassere en andre, identiske, mesh kurv opp ned (invertert) i en glass brød-pan (127 x 229 mm) (for å unngå blomster sitter i SDW) og sted mesh ark som inneholder kurv på toppen. Legge til 50 g av forberedt blomster i silen.
Merk: Alternativt liten reagensglasset [rensing] kurver kan brukes i stedet for opprinnelig brukt plast mesh kurver (gammel, grønn, jordbær mesh pint kurver er ofte vanskelig å kilde). - Jevnt tåke blomster med 250 mL ved hjelp av en pumpe tåke flaske og ta avrenning i glass brød-pannen. Så belastning filtratet gjennom forberedt cheesecloth/trakten i et rent sentrifuge rør. Resulterende forberedelse omtales som passiv- planteekstrakter (pass -FE); Lagre som per ovenfor (trinn 2.6).
- Rengjør alle komponenter mellom hver ekstraksjon med 95% EtOH og varmt vann. Gjenta utdrag med flere prøver å gi replikerer (minst 3 per eksempel type).
4. kloroform-baserte Floral ekstrakter (lm-FE) 17
- Samle blåbær og tranebær blomster som per ovenfor (trinn 2.1), og forberede blomster utvinning (trinn 2.2, uten cheesecloth/trakt forberedelse). Hold forberedt blomster nedkjølt før før bruk.
- Arbeid med kloroform må utføres i avtrekksvifte av sikkerhetsgrunner. Dette inkluderer utarbeidelse av materialer / glass, utvinning prosedyrer og bioassay konduktans (trinn bruker lm-FE).
- Rengjør alle komponenter med 95% EtOH to ganger, deretter to ganger med kloroform å hindre forurensning for hver utvinning: gjengede BILLEDRØR kultur, 2 glass kanner, liten rustfritt stål skjermen og en [glass] graduate sylinder. Avsatt til tørr opp-ned. Skyll polytetrafluoroethylene (PTFE) foret caps to ganger med 95% EtOH bare (kloroform vil skade de ytre materialene i cap) og satt til tørk.
- Kombiner 1 del behandlet blomster til 9 deler kloroform (1 wt: 9 vol ratio) i et beaker (blomster deretter kloroform), forsiktig virvel for 30 s og belastning gjennom en rustfritt stål skjermen i andre begeret. Hell lm-FE fra andre begeret i kultur glassrør (10-15 mL) og påføre PTFE cap. Pakk lue med parafilm å hindre fordampning.
- Dette preparatet er kloroform-baserte floral ekstrakt (lm-FE). Lagre utvalg i mørket (å nedskrive lys degradering) på 4 ° C til rekreasjonsbruk. Gjenta utdrag med flere prøver å gi replikerer (minst 3 per eksempel type).
5. samling av regnvann fra blåbær blomster (BB rw-FE)16
Merk: Blåbær floral regnvann samling enheten består av en luft spray pistol disponibel maling spray cup med connection-kortet (cup: kvinnelige tråden, adapter: male til hann tråden), 50 mL sentrifuge rør (polypropylen), parafilm og plast belagt ledninger ( standard telefonkabel, personlige interne wire strand innholdet).
- Velg flere steder innenfor et blåbær bush å fange opp regnvann kjøre av blomster før du oppretter samlingen enheter. Disse inkluderer direkte under inflorescences (blomst) til den svært base av bush (kronen). Registrere diameter av stilkene (alt fra 1-5 cm) på utvalgte steder, da dette vil diktere størrelsen på hullene brukes for enhet vedlegg, beskrevet nedenfor.
- Opprette en samling enhet for hver valgte plassering. Først bor et hull på bunnen av en spray kopp (der Koppen svinger mot gjenger åpningen) til tilsvarende stilk diameteren, med en trinn-bit knyttet til en drill trykk. Deretter klippet en rett linje fra toppen av thehole til munningen av spray koppen. Borehull 4 equidistant (store nok til tråden plastikk belagt ledning), ved munningen av spray cup, og fest en ende av plast belagt ledningene forlate ene gratis.
- Bore et hull store nok til tråden male sprøyta cup kortet i 50 mL sentrifuge cap lokk. Forsegle kortet tråder med parafilm å hindre lekker. Fest dette til både sentrifuge cap og gjenget del av sprøyta cup. Fest parret 50 mL sentrifuge røret.
- Gjenta 5.3-5.4 for å opprette flere enheter per valgte plasseringer, minimum 4 samling enheter per prøvetaking plassering.
- Distribuere enheter på utvalgte steder bevegelse sprøyta koppene å anfall på stammer. Plasser klippe-siden av spray cup oppover med plastbelagt ledninger festet til andre stammer (for å sikre vannet forbi blomstene er fanget). Påføre parafilm noen åpninger som kan lekke regnvann. (Ekstra figur 3, supplerende figur 4, supplerende figur 5og supplerende figur 6).
- Etiketten samling rør med distribusjon dato / klokkeslett. Etter en regn-hendelse, fjerne og erstatte nederst (tube) havn av sentrifuger røret (merke dato / tid i samlingen). Bringe avrenning samlinger (referert til som blåbær regnvann planteekstrakter (BB rw-FE)) inne og vakuum filter (filtrering beskrevet i trinnene 2.4-2.5). Lagre som ovenfor (trinn 2,6), før brukes i en vannbasert bioassay.
6. samling av regnvann fra tranebær blomster (CB rw-FE)
- Floral regnvann samling enheten i tranebær består av en 7 X 7 cm polypropylen trakt, 50 mL sentrifuge rør (polypropylen), parafilm, og 4 standard, plast belagt vridningsbånd (per enhet).
- Først varme punktering 8 equidistant hull (diameter av vridningsbånd) rundt munningen av trakten med en metall sonde. Vridningsbånd inn 4 hull. Koble andre endene til denne hull motsatt plassering, danner en pen krysset mønster. Pakk trakt ned-stammen med parafilm og sett til side.
- Bore et hull store nok til å sette inn trakt ned-stammen i en 50 mL sentrifuge lue med trinn-litt. Forberedt trakt inn sentrifuge cap. Gjenta trinn 6.2-6.3 for å opprette flere enheter, minimum 4 samling enheter per prøvetaking plassering.
- Distribuere merket (dato/klokkeslett) enheter til valgte tranebær myrer. Pent tuck to blomsten bærende inflorescences (kjent som søyler) under krysset plast vri båndene. Deretter loddrett orientert enheten av piercing sentrifuge røret i tranebær tak (supplerende tall 7-8, supplerende Movie 3).
- Nedbør eller overhead vanning fjerne og erstatte nederst (tube) havn av sentrifuger røret (merke dato / tid i samlingen). Bringe avrenning (referert til som tranebær regnvann planteekstrakter (CB rw-FE)) inne og vakuum filter (filtrering beskrevet i trinnene 2.4-2.5). Lagre som ovenfor (trinn 2,6), før brukes i en vannbasert bioassay.
7. bioassay med vann basert Floral ekstrakter15,16 (aktiv-FE, passerer-FE, rw-FE)
Merk: Se figur 1.
- Denne bioassay er utarbeidet i laminær strømning hette. Forberede materialer: trippel skyll glass coverslips med 95% EtOH og luft tørke, deretter sette til side. Skjær papir håndkle disker til interne diameteren på et standard plast celle kultur retter (9 cm). Sted 2 lag av papir disker innen kultur retter og suge med 2 mL SDW.
- Forbered minst 5 mL av en 1.0 X 105 conidia per mL SDW spore suspensjon (C. fioriniae) ifølge ovenfor (trinn 1.2-1.4), satt til side. Neste, bland like volum av SDW og vannbasert planteekstrakter i 2 mL microcentrifuge rør. Deretter legge til en lik mengde spore suspensjon til forberedt 2 mL microcentrifuge rør (SDW pluss FE); den resulterende forberedelsen kalles en vandig behandling blanding. For kontrollen utelater FE delen og erstatte med SDW, å holde konsentrasjonen av conidial konsekvent.
Merk: del er avhengig av antall gjentak og tid-poeng. Vanligvis overstiger deler ikke 500 µL. Når conidia og FE kombineres har bioassay begynt, 0 h etter vaksinering. - Plassere pre renset glass coverslips over dynket papirhåndklær i celle kultur parabolen. Plass en 40 µL dråpe vandig behandling blanding på midten av en dekkglassvæske. Gjenta for ønsket behandlinger, inkludert kontroll, nær celle kultur parabolen. Gjenta i egen celle kultur retter for replikeringer (minst 3) og tidspunkt (hver rett er for 1 punkt). Når alle behandlinger og gjentak har blitt utlevert, plassere alle repliserte celle kultur retter i et forseglet plast container (30 x 13 x 7 mm) og ruge ved 25° C i mørket.
- Forhåndsdefinert tidspunkt, Legg til på 10 µL av et bindemiddel som lactophenol bomull-blå (20.0 g fenol krystaller, 20.0 mL 2,5% melkesyre, 40,0 mL glyserol, 0,05 g bomull blå) dråper, stoppe vekst og semi bevare mount.
- Vente 2 h å samle 0t tidspunktet som dette lar conidial vedheft til glassoverflaten, men er ikke lenge nok til conidial spiring. For alle andre tidspunkt, legge bindemiddel tilsvarende samtidig.
- Når et bindemiddel er lagt, nøye Inverter coverslips, plasserer dem slippverktøy side ned på en barometer microscope skyve å lette microscopic eksamen (1 dekkglassvæske per lysbilde). Når alle coverslips er objektglass glass, la dem å avgjøre og delvis tørr i flyt panseret for 20 min.
- Telle alle conidia (totalt conidia) presenterer på dekkglassvæske (primære conidia, spirer conidia og nylig dannet sekundære conidia) samt appressoria på enten 400 X forstørrelse (teller 16 felt) eller 200 X (teller 4 felt), totalt et område 3.808 mm 2. kopiere hele bioassay til statistisk analyse. For analyser med vannbasert FE, analysere data som beskrevet i Waller et al. 201716, vanligvis vises så bety teller/mm2 (totalt conidia eller appressoria).
8. bioassay med kloroform-baserte Floral utskrifter (lm-FE)17
Merk: Se figur 2.
- Forberede materialer og celle kultur retter som per ovenfor (trinn 7.1). I tillegg, skyll av Van Tieghem celler (VanT. celler) (8 mm OD, 6 mm ID) til coverslips, samt en glass pipette (1 mL med 1 µl trinn) i avtrekksvifte, (to ganger med 95% EtOH deretter to ganger med kloroform), og sett til side.
- På laminær strømning hette, bruker en 2 mL microcentrifuge tube legge to like volum (minst 500 µL deler) av SDW og 1 volume spore hjuloppheng, er satt til side. Dette er vandig behandling blandingen for lm-FE bioassay.
- Plass en VanT i avtrekksvifte. celle på et glass dekkglassvæske i forberedt plast celle kultur parabolen. Dispensere (med glass pipette) 33 µL ønsket lm-Fe i sentrum av Van T. cellen (ikke berør veggene i VanT. Cellen; for kontroll behandling, Legg til virgin kloroform), og la det tørke. Gjenta i egen celle kultur retter for replikeringer (minst 3).
- Når lm-FE har tørket, dispensere 99 µL av forberedt vandig behandling blandingen med en standard pipette i sentrum av VanT. cellen og deretter Lukk alle celle kultur retter. Når vandig behandling blandingen har kommet i kontakt med tørket lm-FE behandlinger, har bioassay startet, 0 h etter vaksinering.
- Når alle behandlinger og gjentak har blitt utlevert, plassere alle (lukket) celle kultur retter i et forseglet plast container (30 x 13 x 7 mm) og ruge ved 25° C i mørket.
- Legg til 15 µL av et bindemiddel (lactophenol bomull-blå) VanT på forhåndsbestemt tid-poeng. cellen og la sitte i minst 5 minutter å sikre tilstrekkelig fungal flekker. Etter nøye fjerne VanT. celle og følger dekkglassvæske inversjon og data oppkjøpet trinnene ovenfor (trinn 7.5-7.6). For dataanalyse, følger du beskrevet i Gager 201517, vanligvis vise data som appressorium formasjon, som er forholdet mellom total conidia å appressoria regnet i området observert (3.808 mm2).
9. tranebær Phenology-baserte utdrag17
- Hånd samle tranebær blomster (i juni; 100 g), umodne frukt (to ganger; Juli og August; 200 g), og modne tranebær frukt i høst (oktober; 200 g), plassere i riktig størrelse plastposer og kjøleskap på 4 ° C umiddelbart etter samlingen. Bruk forurensning forholdsregler skissert ovenfor (trinn 2.1).
Merk: Det vil være ekstra plantemateriale samlet på hver gang, men disse beløpene vakt mot utpakking åpenbart fungal infiserte eggstokkene og frukt (viser symptomer og tegn på sykdom). - Før ekstraksjon, Fjern eventuelle forverret, skadet, syk blomster og bruker bare friske blomster, fjerne kronblader, peduncles, corollas, stigmas, stiler og pollenbærere med buet tang (45 ° pinsett) og kast alle men eggstokkene. Når eggstokkene er samlet, utføre kloroform-baserte utvinning på 1 wt: 9 vol forholdet (beskrevet i trinnene 4.2-4.4, bruker bare eggstokkene). Lagre prøver til alle andre utdrag er fullført, dvs før bioassay konduktans.
- Når frukt er samlet, utføre en kloroform-baserte utvinning (trinn 4.2-4.4, bruke innsamlede frukt i stedet for blomster), men legge 10 g frukt til 90 mL kloroform og når utdraget, tillate løsningen fordampe til 9 mL (som fører til en 10 g: 9 mL wt : vol løsning).
- Gjøre frukt utdrag umiddelbart etter å samle i juli, August og oktober. Lagre som per ovenfor (trinn 4.4) til alle utdrag er samlet. Etter siste kloroform-baserte frukt utvinning, underlagt alle penology-baserte kloroform ekstrakter samlet for denne analysen til kloroform-basert bioassay og analysere tilsvarende (trinn 8.1-8.6).
Representative Results
Resultatene presenteres her er noen eksempler på de mange analyser som kan utføres med denne metoden. Figur 1 er en illustrert guide til vannbasert FE bioassay, og er supplert med figur 2 som følger til kloroform-baserte FE bioassay. Figur 3 gir en visuell guide til hva som kan forventes ved mikroskopisk evaluering av C. fioriniae på 24 h, i både vann - og kloroform-baserte bioassay (sammenlignet med SDW kontroller). Figur 4 detaljer en 24 h klokkeslett-retters studie med C. fioriniae i nærvær av tranebær ulike 'Stevens' lm-FE, og gir visuell referanse til en Importer resultat av denne forskningen: FE redusert tiden det tar å skjemaet infeksjon strukturer sammenlignet med SDW. Figur 5 gir et eksempel på data samlet inn fra en dekkglassvæske bioassay med tranebær floral regnvann avrenning (CB "Flower" rw-FE). Figur 6 representerer et annet viktig resultat: floral eggstokk lm-FE var mye mer stimulerende enn frukt lm-FE, indikerer viktigheten av blomstrer i livssyklusen til C. fioriniae. Supplerende bildene og filmene gir viktige visuelle blomstene som brukes i utdrag og floral regnvann samling enheter/distribusjon, i tillegg til filmer som Visualiser den aktive og passive - utvinning ( vannbasert) prosesser.
Figur 1 : Generell oversikt over vannbasert floral ekstrakt (FE) bioassay. Denne analysen ble benyttet for vannbasert floral ekstrakter med både blåbær og tranebær blomster: aktiv -floral utskrifter (aktiv-FE), passiv -floral utskrifter (pass-FE) og floral regnvann avrenning (rw-FE). -FE del vanligvis utgjør den eksperimentelle/variable faktoren. Omvendt-FE delen kan være konstant og tid poeng/timer etter vaksinering kan evalueres. Preferanse er gjort mot 4 field analyse på 200 X forstørrelse. Forkortelser: Sterile deionisert vann, SDW; Området per synsfelt, A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Generell oversikt over den kloroform-baserte floral ekstrakt (lm-FE) bioassay. Denne analysen ble benyttet for både blåbær og tranebær (blomster, eggstokkene og frukt). Bare én type vandig behandling blandingen ble brukt i denne analysen, 1 del spore suspensjon å 2 deler SDW (å holde conidial konsentrasjon konsekvent på grunn av lm-FE fordampning). Denne analysen kan brukes til å sammenligne flere ch-FE (voks fra ulike anlegg flater), eller flere tid poeng/timer etter vaksinering med en enkelt lm-FE. Forkortelser: Sterile deionisert vann, SDW; Van Tieghem [glass] celler, VanT. celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Visual sammenligning av Colletotrichum fioriniae i nærvær av vannbasert FE og ch-FE. I denne analysen blåbær 'Bluecrop' (aktiv-FE, vann-basert) (fungal isolere: BB #10) og tranebær 'Stevens' kloroform-basert (lm-FE) (fungal isolere: CB-PMAP182) floral ekstrakter ble sammenlignet med SDW kontroller. En dramatisk økning i sekundære conidiation (ringer) og appressorium dannelse (pilspisser) ble observert når du sammenligner conidia i nærvær av SDW (kontroll) (A) til aktiv-FE (B) på 24 timer etter vaksinering. Sekundære conidiation var imidlertid ikke så tydelig når man sammenligner kloroform bioassay SDW kontrollen (C) til lm-FE (D); snarere C. fioriniae vekst over til appressorial dannelse. Vist er et vanlig svar på hver utvinning type, vann-basert og kloroform-basert, uavhengig vert/floral Art beskrevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Tid-retters studie (24 h) med Colletotrichum fioriniae i nærvær av lm-FE. I denne analysen, var en SDW kontroll (A-D) og tranebær 'Stevens' lm-FE (E-F) visuelt inspisert på 0, 6, 12 og 24 timer etter vaksinering (et eksempel varierende poeng i stedet for å sammenligne flere FE). Appressorium formasjon (pilspisser) begynte på 6 h i lm-FE og økt stadig gjennom senere tidspunkt. Dette resulterer eludes til en viktig faktor for patogen biologi i bloom perioden: blomster redusere tiden det tar å skjemaet infeksjon strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Grafisk fremstilling av dataene samles inn med rw-FE i en bioassay. Regnvann kjøre av tranebær blomster (CB "Flower" rw-FE) og virgin regnvann som ikke hadde rørt alle tranebær anlegget vev ("Ground" rw-FE) fra én wetting-hendelse pluss en standard aktiv, tranebær vannbasert planteekstrakter (CB aktive -FE) (positiv kontroll) og SDW (negativ kontroll) ble utsatt for en vannbasert dekkglassvæske bioassay og evaluert for C. fioriniae vekst. CB "Blomst" rw-FE hadde samme nivå av sekundære conidiation og appressorium formasjon som den standard CB- aktivt-FE på 24 timer etter vaksinasjon, som indikerer at samlingen enhetene var effektive fange floral sentralstimulerende utgitt under en wetting-hendelse. Totalt conidia består av primære (avsatt), conidia og nylig dannet sekundære conidia. Bokstavene angir betydelige forskjeller på p < 0,05 ifølge Fischer minst signifikant forskjell test (LSD); store, total conidia; små, appressoria. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Tranebær phenology basert lm-FE bioassay, visuell inspeksjon. Sykdom ledelse for frukt råtnende sopp ofte innebærer blomst tid soppdreper programmer. Her, evaluert tranebær kloroform-baserte ekstrakter (lm-FE) fra flere vekst stadier av tranebær ('Stevens') visuelt for effekten av overflaten voks på C. fioriniae på 24 timer etter vaksinering. Eggstokkene samlet i juni (A), umodne frukt i juli og August (B, C), høstet frukt samlet i oktober (D), og en SDW-kontroll (E) var inspisert for appressorial formasjon (pilspisser). Eggstokken lm-FE hadde størst omfanget av appressorial formasjon, som indikerer at denne plante phenology (bloom) er kritisk viktig for livssyklus av C. fioriniae. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: blåbær kjørvel. Blueberry blomster ble samlet inn for utdrag i full blomst (April-mai i New Jersey, USA) (vist 'Bluecrop'). Merk overlappingen av corollas/eggstokkene fra tilstøtende blomster og den generelle arkitekturen for sitter sammenlignet med supplerende figur 2 (tranebær stående). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 2: tranebær oppreist. Tranebær blomster ble samlet inn for utdrag i full blomst (juni-juli i New Jersey, USA) (vist 'Stevens'). Merk den varierte blomst etapper på en enkelt tranebær sitter (stående) og den hekta, vann droplet beholder formen på corolla. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 3: blåbær regnvann distribusjon (blomst). Fullført blåbær floral regnvann samling enhet, plassert direkte under en klynge av inflorescences. Merk plastbelagt wire brukes til å vertikalt orientert enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 4: blåbær regnvann distribusjon (stem). Fullført blåbær floral regnvann samling enhet, plassert halvveis ned stammen mellom en sitter og kronen av bush. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 5: blåbær regnvann distribusjon (kronen). Fullført blåbær floral regnvann samling enhet, plassert ved foten av bush (kronen). Merk plast belagt ledninger kan fjernes hvis ikke nødvendig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 6: blåbær regnvann distribusjon (bakken). Fullført jomfru regnvann samling enhet, plassert ved siden av blåbær. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 7: tranebær regnvann distribusjon (close-up). Fullført tranebær floral regnvann samling enhet, med to søyler gjemt under pent krysset wire bånd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 8: tranebær regnvann distribusjon. Flere fullført tranebær floral regnvann enheter i en myr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra film 1: aktiv, vannbasert floral ekstrakter (aktiv -FE). Supplerende videostøtte følgende 2.3-2.5.1. Blueberry 'Bluecrop' blomster ble brukt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Ekstra Movie 2: Passive, vannbasert floral ekstrakter (pass-FE). Supplerende videostøtte følgende trinn 3.3-3.4. Blueberry 'Bluecrop' blomster ble brukt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Ekstra Movie 3: distribusjon av tranebær floral regnvann samling enheter. Supplerende videostøtte følgende trinn 6.4. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
Bioassay oppdage C. fioriniae svaret floral ekstrakter (FEs) ble utviklet for blåbær og tranebær frukt rot pathosystems men kan lett tilpasses andre hagebruk avlinger. Protokollen beskrevet ovenfor er verdifull i å skaffe mange viktige datasett inkludert, men ikke begrenset til: FE effekter på flere isolater av mange patogener, tid-retters informasjon om soppvekst stadier i nærvær av ulike FEs, sammenligning av utvinning teknikker, inspeksjon av personlige kjemikalier på C. fioriniae vekst og differensiering, evaluering av personlige blomst orgel ekstrakter, effekten av temperatur på C. fioriniae mens i nærvær av FE, effekter phenology avhengige voks utdrag og floral regnvann effekter. Ved hjelp av disse teknikkene har data generert også gitt en mye klarere forståelse av C. fioriniae livet scener og delvis kaster hvorfor blomst er så avgjørende for kontroll av mange frukt råtnende patogener.
I utgangspunktet alle blomstene ble behandlet identisk til det aktivt-FE, men utpakkingen har flyttet mot hjelp hele blomster. Floral disseksjon var tidkrevende og hadde liten betydning for bioactivity av den resulterende FEs. Imidlertid floral organer kan og har vært vurdert bruker denne protokollen, men stor forsiktighet må tas til ikke helt macerate floral vev (ekstra film 1, med forholdsregler i trinn 2.3), da dette kan resultere i utgitt sopp-giftig/statisk forbindelser i FE som kan forvrenge mikroskopiske evalueringene. Mindre invasiv utdrag som pass -er FE (supplerende Movie 2) og rw-FE nå mer gunstig på grunn av sin enkle anskaffelser. I tillegg krever følgende utvinning bare vakuum filtrering å erverve biologisk aktive floral kjemiske signaler.
Blomstene benyttes i alle utdrag var vanligvis kjøleskap i 0-3 dager før ekstrakt forberedelse. En utfordring i denne protokollen er tid ledelse av FE omsetning (feltet samlingen gjennom lagring av ekstrakter). Denne ble forverret etter mange prøvene fra flere kilder og datoer. Frosne blomster har ikke blitt evaluert til noen reell grad tinte blomster vises forverret og misfarget. Men når den vannbasert FEs er utarbeidet, gjentatt frysing og tining har vist ingen effekt på bioactivity Fe, så så lenge FE er raskt refrozen etter bioassay forberedelser (levedyktig 3 år gamle FE).
Kloroform-baserte utvinning kan etterforskningen av patogen Svar å tredimensjonale floral/frukt overflaten voks i en todimensjonal flyet via lm-FE fordampning på glass coverslips. Men er det usannsynlig at den faktiske krystallinske strukturer av voks avsatt fra lm-FE er identiske på overflaten som de ble samlet. Betydning, supplerende teknikker bør gjennomføres hvis fungal svar på bestemte voks strukturer i vivo er hovedfokus for undersøkelse. Kloroform-baserte ekstrakter trenger mer lagringsplass vedlikehold enn vannbasert utdrag. Holde lm-FE ekstrakter i mørket, PTFE foret cellekultur rør caps og parafilm tetting wrap må kontrolleres regelmessig fordamping lekkasjer og erstattet etter behov.
Begrepet overvåking floral regnvann avrenning er forankret i ideen om å fremme områdespesifikke sykdom overvåkingsverktøy. Regnvann samling enhetene kan tilpasses mange andre plante arkitekturer, så lenge samlingen enheten fanger regnvann som har kjørt ut av blomster. Denne tilnærmingen gir informasjon om hvorvidt floral stimulering finnes i feltet til enhver tid og kan overvåkes gjennom hele sesongen. Alternativt kan samling enheter distribueres på flere baldakin steder å finne ut hvor langt floral signaler har blitt vasket under enhver wetting-hendelse. I fremtiden eksperimenter, rw-FE vil diktere når soppdreper programmer skal begynne, og når de trygt kan ende. I tillegg ved å overvåke phenology avhengige voks utdrag (protocol delen 9), har betydningen av bloom perioden til patogen biologi blitt enda tydeligere. Denne delen ble også inkludert for å demonstrere fleksibilitet til disse bioassay, å tilby metoder som tillater side ved side sammenligning av verten overflaten voks som er timelig atskilt. Dataene som genereres ved hjelp av floral utvinning teknikker og bioassay representerer konkrete indikatorer på patogen stimulering, bestemte kjemiske klasser viktig å patogen biologi og mål for fremtidige kontroll strategier.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker William S. Haines, SR utstyrt tranebær Research Fund og New Jersey blåbær og tranebær Research Council, Inc. for støtte. Vi takker også Jennifer Vaiciunas (veiledning og floral forberedelser), Christine Constantelos (fungal kultur og floral forberedelser), David Jones (floral forberedelser og utdrag), Langley Oudemans (floral forberedelser, filming/foto), Jesse Lynch (floral forberedelser), Roxanne Tumnalis (generell støtte) og mange student/summer internship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
