Summary
Här beskrivs bioassays syftar till att övervaka utvecklingen av svamp patogener, Colletotrichum fioriniae, i närvaro av blåbär eller tranbär blommig extrakt på glas coverslips. Vatten-, kloroform och fältet regnvatten - baserat blommig utvinning tekniker är detaljerade samt fördjupad insikt i hur denna information kan tillämpas.
Abstract
För att noggrant övervaka fenologi för perioden bloom och tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om svamp frukt ruttna patogener, utvecklades blommig extraktionsmetoder och täckglas bioassays utnyttja Colletotrichum fioriniae. I blåbär och tranbär styrs denna patogen optimalt genom att tillämpa fungicider under perioden bloom på grund av den roll blommor spelar i de inledande skedena av infektion. Protokollet beskrivs här beskriver hur blommig extrakt (FE) erhölls med vatten - kloroform- och fältet regnvatten-baserade metoder för senare användning i motsvarande glas täckglas bioassays. Varje FE bidragit till en annan uppsättning information: svar av C. fioriniae mobiliserade blommig kemiska signaler i vatten (vattenbaserad), patogen reaktion på blomma och frukt ytan vaxer (kloroform-baserat), och fältbaserade övervakning av samlat blommig regnvatten, flytta in vitro- observationer till ett jordbrukslandskap. FE i huvudsak beskrivs som antingen vatten - eller kloroform-baserade, med en lämplig bioassay som beskrivs för att kompensera för de inneboende skillnaderna mellan dessa två material. Regnvatten som hade springa iväg blommor samlades i unika enheter för varje gröda, anspelar på den flexibilitet och tillämpningen av denna metod för andra grödor system. Bioassays är snabb, billig, enkel och ger förmågan att generera spatiotemporal och platsspecifika information om förekomst av stimulerande blommig föreningar från olika källor. Denna information kommer i slutändan bättre informera sjukdom förvaltningsstrategier, FE minska den tid som behövs för infektion förekommer, vilket ger inblick i föränderliga risker för patogen infektion under växtsäsongen.
Introduction
Colletotrichum fioriniae orsakar en frukt ruttna både allåkerbär blåbär (Vaccinium corymbosum L.) och den stora amerikanska tranbär (V. macrocarpon Aiton)1,2. Denna patogen var nyligen avgränsas från C. acutatum arter komplexa3,4,5,6 och är en kausal agent för blåbär anthracnos och medlem av tranbär frukt röta komplexa, förutom att orsaka många andra växt sjukdomar världen över7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner som inträffar under blom och symptom utveckling inte blir uppenbara tills frukten är i slutfasen av mognad9. I blåbär och tranbär kontrolleras frukt ruttna endast med fungicid ansökningar under perioden bloom. Patogenen övervintrar i vilande blåbär blommig knopp skalor10 och sporulates under bloom. Conidia flyttas hela trädkronorna via regn-splash spridning11,12 och inokulum uppbyggd har varit starkt korrelerad till bloom perioden13. Svar av Colletotrichum arter till värd blommor är inte unik för Vaccinium, eftersom blommor är viktiga komponenter av citrus post bloom frukt drop (PFD)14 samt jordgubb anthracnos15, i båda fallen som orsakar patogenen till sporulate. Alla dessa fall belysa behovet av effektiva metoder för att utvärdera tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om C. fioriniae och andra patogener som infekterar under bloom. De insikter som tillhandahålls av metoderna som beskrivs här blir allt mer värdefull.
Detta protokoll metoder blommig extrakt (FE) upphandling och guider utvärderingen av C. fioriniae Svaren till FE via glas täckglas bioassays15,16. De blommiga utvinning teknikerna är indelade i två huvudtyper; vatten-baserade extraktioner (aktiv-FE, passiv (pass -FE) och fältet regnvatten-baserade (rw-FE)), och kloroform-baserade (ch-FE)17 extraktioner. De vattenbaserade extraktioner möjliggör inspektion av vatten mobiliserade blommig kemiska signaler. Dessa mobiliserade ledtrådar är sannolikt viktiga komponenter domstolens infektion eftersom FE kraftigt ökar hastigheten på infektion16, förutom att ge fukt krävs för infektionen att inträffa. Dessutom utgör de ett mer naturligt tillstånd som blommig stimulering kan tvättas i hela kapellet under vätning-händelser som tidigare observerats i blåbär och andra gröda system14,16. Kloroform-baserade blommig extraktioner (ch-FE) ger också värdefull information som hänför sig till patogen svar värd yta vaxer17,18, belysa tillväxten tidigt i conidia en gång deponeras på mottagliga mottagande organ (dvs. blommor, äggstockarna och utveckla frukt). Patogen svar på säsongsmässiga förändringar i värd yta vaxer kan också övervakas med hjälp av detta protokoll. Följaktligen skräddarsys bioassays arbetar med antingen vatten-baserade FE eller kloroform-baserade FE för att mildra de inneboende skillnaderna mellan dessa två material.
De data som genereras från bioassays avslöjade att vattenbaserade extraktioner stimulera högre nivåer av sekundära conidiation än kloroform-baserade extraktioner där det fanns en definitiv appressorial svar, därför ifrågasätta flera föreningar närvarande i FE. Intressant, observerades båda dessa tillväxt-svar när använder regnvatten som hade sprungit bort av blåbär och tranbär blommor, som anger flera stimulerande föreningar kan tvättas från ytan av blommor. Således, övervakning för blommig stimulering ger inblick i sannolikheten för patogen framgång i ett jordbrukssystem.
Det slutliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att generera biologiska originalplansinformation på svamp växt patogener som svar på blommiga kemiska signaler, samt initierande metoder som kan utnyttja denna blommiga information till stöd i platsspecifika sjukdom förvaltning och beslutsfattande processer.
Protocol
1. svamp isolat och Spore suspensioner
- Isolera Colletotrichum fioriniae från en naturligt infekterade värd19. Sedan lagra de rena kulturerna på majsmjöl agar (CMA) vinklingar. Placera plug av kultur (från CMA vinkling) på en standard plast cell kultur maträtt (9 cm i diameter) som innehåller antingen förtydligas V8 juice agar (cV8A) (modifierad från Miller 1955), eller icke-klargj橬一j V8 juice agar (V8A)20. När kolonierna börjar sporulate, streak conidia (orange conidial massorna) på en annan cV8A eller V8A som innehåller cell kultur skålen (med en steril standardslinga) för att producera en hög densitet sporulating kultur.
Obs: Någon protokollstegen med svampar bör utföras i en LAF att minska risken för kontamination med svamp kulturer eller bioassays. - Efter 7 dagar av tillväxt, med hjälp av en steril standardslinga samla en liten mängd conidia från högdensitets kulturen (genom att lätt röra slingan till conidial samlas) och rör ner detta i en 15 mL centrifugrör innehållande 10 mL sterilt avjoniserat vatten (SDW). Vortex detta prov för 10 s, sedan använda en vanlig pipett störta upp och ner flera gånger att ytterligare blanda provet.
- Sedan placera en droppe av vortexed provet på hemocytometer och uppskatta spore koncentrationer. Räkna 5-10 fält på hemocytometer, erhålla genomsnittet och multiplicera genomsnittet med lämpliga utspädningsfaktorn (dvs. 10,000), därmed få conidial koncentrationen per mL SDW.
- Sedan använda en volym (V) / koncentration (C) ekvation (V1● [C1] = V2● [C2]) justera (med SDW) till 1,0 X 105 conidia per mL SDW med en 5 mL slutlig volym. Detta kallas sporsuspensionen och endast görs omedelbart före användning i antingen bioassay.
2. aktiv, vatten-baserade blommig extrakt (aktiv -FE)15,16
Obs: Se kompletterande figur 1, kompletterande diagram 2, kompletterande diagram 3och kompletterande film 1.
- Noggrant hand-samla blåbär (April-maj) och tranbär (juni-juli) blommor under deras respektive peak blommar i fältet (kompletterande figur1). Bära och ändra nitrilhandskar mellan mätplatser (sorter/sorter/fysiska platser) hämmar mänsklig hud olja kontaminering samt korskontaminering mellan blommiga sorter. Placera antingen blåbär eller tranbär blommor (från en enda källa) i plastpåsar (fylla en påse 100 x 150 mm) och omedelbart kyla vid 4 ° C när blommor samlas.
Obs: Aktiv - utvinning ändras från Leandro et al. (2003) 16. - Före extraktion, ta bort eventuella försämrats, skadade, sjuka blommor, då med friska blommor bort äggstockarna, foderblad och blomstänglar med böjd pincett (45˚ pincett) och kassera. Använd endast de återstående organ (corolla, stigma, stil och ståndare) för aktiv - extraktioner. Skär cheesecloth (150 x 150 mm) och placera inom en 7 x 7 mm-tratt, placera i en ren 50 mL centrifugrör och ställ åt sidan.
- Kombinera 1 delvis bearbetat blommor till 9 delar SDW (1 wt: 9 baserat på vol) i en mortel. Slipa försiktigt med en mortelstöt för 30 s (var försiktig att inte fullständigt pulverisera proverna). Sila resulterande massan genom förberedda cheesecloth/tratt och samla i centrifugeringsröret (50 mL). Rengör eller använda nya murbruk/mortel mellan varje extraktion med 95% EtOH och rinnande varmt vatten.
- Förbereda en dammsugarfilter apparater: samla Buchner tratt, vakuum filter Erlenmeyerkolv (upp till 1 000 mL kapacitet), 55 mm cirkel filterpapper och vakuum slang/källa. Lägg till filter papper till en lämplig storlek Buchner tratt och placera ovanpå kolven, sedan ansluta apparaten till ett vatten / sug källa via sugslang och avsätta.
- Ytterligare klargöra blommig extrakt av blåbär genom centrifugering för 10 min vid 8.055 x g. Häll bort supernatanten i beredda vakuum filter apparat, slå på vakuumkällan, filtrera supernatanten, sedan Häll kolv innehållet i ett nytt centrifugrör (50 mL). Ren alla apparater komponenter mellan varje filtrering med 95% EtOH och rinnande varmt vatten. Ytterligare filter genom en spruta anpassade med 0,22 µm porstorlek, acetat sterilisering, filter i en ny centrifugrör (50 mL).
- För tranbär blommig extrakt, bara Dammsug filtret genom filtrerpapper och häll kolv innehållet i ett nytt centrifugrör (50 mL).
- Resulterande beredning benämns som aktiv- blommig extrakt (aktiv -FE). Lagra alla vattenbaserade blommig extrakt (aktiv- passiv-, regnvatten samlingar) vid-20 ° C i 5-50 mL alikvoter tills experimentell användning. Upprepa extraktioner med flera prover (minst 3 extraktioner per Provtyp) för att ge replikat.
3. passiv , vatten-baserade blommig extrakt ( passera -FE) 16
Obs: Se kompletterande film 2.
- Hand samla hela blåbär blommor (50 g) som ovan, och kyla efter insamling. Före extraktion, ta bort eventuella försämrats, skadade, sjuka blommor och endast stjälkar från intakt blomma. Kylskåp beredda proverna tills den passiv - utvinningssystem, som beskrivs nedan, är på plats.
- Skölj alla komponenter före användning med 95% etanol (EtOH) och rinnande varmt vatten för att förhindra kontaminering (plastnät ark, två plastnät korgar, glas bröd pan och mist pumpflaska). Också förbereda ett 4 lager cheesecloth/tratt/50 mL centrifugrör för varje extraktion som beskrivits ovan (i steg 2.2), och ställ åt sidan.
- Förbereda sikten: placera ett plastnät ark (aka klar bar mattor) in ett plastnät korgen (114 x 102 mm). Placera en andra, identiska, mesh korgen uppochner mesh (inverterad) i ett glas bröd-pan (127 x 229 mm) (för att undvika blommor sitter i SDW) och plats och blad innehållande korg ovanpå. Tillsätt 50 g av beredda blommor i sikten.
Obs: Alternativt små provrör [rengöring] korgar kan användas i stället för den ursprungligen använda plastnät korgar (gamla, grön, strawberry mesh pint korgar är ofta svåra att källa). - Jämnt mist blommor med 250 mL med hjälp av en pump dimma flaska och fånga avrinning i glas bröd-pannan. Sedan stam filtratet genom förberedda cheesecloth/tratten i en ren centrifugrör. Resulterande beredning benämns som passiv- blommig extrakt (pass -FE); lagra som per ovan (steg 2,6).
- Ren alla komponenter mellan varje extraktion med 95% EtOH och rinnande varmt vatten. Upprepa extraktioner med flera prover att tillhandahålla replikat (minst 3 per Provtyp).
4. kloroform-baserade blommig extrakt (ch-FE) 17
- Samla blåbär och tranbär blommor per ovan (steg 2.1), och förbereda blommor för extraktion (steg 2.2, utan cheesecloth/tratt förberedelse). Hålla förberedda blommor kylda tills före användning.
- Något arbete utförs med kloroform måste utföras i dragskåp av säkerhetsskäl. Detta inkluderar beredning av material / glas, extraktionsmetoder och bioassay konduktans (steg med ch-FE).
- Rengör alla komponenter med 95% EtOH två gånger och sedan två gånger med kloroform att förhindra föroreningar för varje utvinning: gängade kultur glasrör, 2 glasbägare, liten rostfri skärm och en [glass] graduate cylinder. Avsatts för att torka upp och ner. Skölj av polytetrafluoreten (PTFE) fodrade mössor två gånger med 95% EtOH bara (kloroform kommer att skada de yttersta material av den gemensamma jordbrukspolitiken) och ställ åt sidan för att torka.
- Kombinera 1 delvis bearbetat blommor till 9 delar kloroform (1 wt: 9 baserat på vol) i en bägare (blommor sedan kloroform), försiktigt virvel för 30 s och sila genom en rostfri skärm i den andra bägaren. Häll ch-FE från andra bägaren i kultur glasröret (10-15 mL) och anbringa PTFE locket. Linda den gemensamma jordbrukspolitiken med parafilm att förhindra avdunstning.
- Detta preparat är kloroform-baserade blommig extraktet (ch-FE). Förvara provet i mörker (för att minska ljus nedbrytning) vid 4 ° C tills experimentell användning. Upprepa extraktioner med flera prover att tillhandahålla replikat (minst 3 per Provtyp).
5. insamling av regnvatten från blåbär blommor (BB rw-FE)16
Obs: Blåbär blommig regnvatten samling enheten består av en luften sprutpistol disponibla paint spray cup med anslutning adapter (cup: invändig gänga, adapter: hane till hane tråd), 50 mL centrifugrör (polypropen), parafilm och plast bestruket ledningar ( vanlig telefontråd, enskilda ledarstoppet strand innehållet).
- Välj flera platser inom en blueberry bush att fånga regnvatten köra från blommorna innan du skapar samling enheter. Dessa inkluderar direkt under blomställningarna (blomma) till den själva basen av busken (crown). Spela in diameter av stjälkarna (allt från 1-5 cm) på utvalda platser, eftersom detta kommer att diktera storleken på hålen används för enheten fastsättning, beskrivs nedan.
- Skapa en samling enhet för varje vald plats. Först borra ett hål på botten av en spray kopp (där koppen kurvor mot gängad öppning) till motsvarande stjälkens diameter, med en steg-bitars bifogas en drill press. Sedan skär en rak linje från toppen av thehole till mynningen av spray koppen. Borra 4 ekvidistanta hål (tillräckligt stor för att gänga av plast belagd tråd), vid mynningen av spray koppen, och fäst ena änden av plast bestruket ledningarna lämnar ena änden gratis.
- Borra ett hål stort nog för att trä färg spruta cup adaptern i ett 50 mL centrifug cap lock. Försegla adapter trådar med parafilm att förhindra läckage. Koppla detta till både den centrifug cap och gängade delen av spruta cup. Bifoga det Parade 50 mL centrifugröret.
- Upprepa steg 5.3-5.4 skapa flera enheter enligt valda platser, minst 4 samling enheter per provtagning läge.
- Distribuera enheter på utvalda platser genom böjning spruta koppar på stjälkar. Orient på klippa sida spray Cup uppåt med plastbelagda kablar anslutna till andra stammar (för att försäkra vatten passerar över blommor fångas). Anbringa parafilm öppningarna som kunde läcka regnvatten. (Kompletterande figur 3, kompletterande diagram 4, kompletterande diagram 5och kompletterande figur 6).
- Etikett samling rör med distribution datum / tid. Efter en regn-händelse, ta bort och ersätta den nedre (tub) delen av centrifugröret (etikett datum / tid för samling). Ta avrinning samlingar (kallad Blåbärsextrakt (BB rw-FE) Free regnvatten blommig) inuti och vakuum filter (filtrering beskrivs i steg 2,4-2,5). Butiken som ovan (steg 2,6), fram till och med en vattenbaserad bioassay.
6. insamling av regnvatten från tranbär blommor (CB rw-FE)
- Blommig regnvatten samling enheten i tranbär består av en 7 X 7 cm polypropylen tratt, 50 mL centrifugrör (polypropen), parafilm, och 4 standard, plast belagd twist band (per enhet).
- Först värme punktering 8 ekvidistanta hål (diameter av twist band) runt munnen i tratten med en metall sond. Sätt twist band i 4 hål. Fäst de andra ändarna som hål motsatt läge, bildar en snygg passage mönstret. Wrap tratten ner-stammen med parafilm och ställ åt sidan.
- Borra ett hål tillräckligt stort för att infoga tratten ner-stammen i en 50 mL centrifug mössa med en steg-bitars. Sätt beredda tratt i centrifug locket. Upprepa stegen 6.2-6.3 för att skapa flera enheter, minst 4 samling enheter per provtagning läge.
- Distribuera märkt (datum/tid) enheter i valda tranbär mossar. Prydligt tuck två blomma uthärda blomställningar (känd som stolpar) under de korsade plastiska twist band. Sedan vertikalt orientera enheten av piercing centrifugröret i tranbär trädkronorna (kompletterande siffrorna 7-8, kompletterande Movie 3).
- Efter regn eller overhead bevattning ta bort och ersätta den nedre (tub) delen av centrifugröret (etikett datum / tid för samling). Ta avrinning (kallad tranbär regnvatten blommig extrakt (CB rw-FE)) inuti och vakuum filter (filtrering beskrivs i steg 2,4-2,5). Butiken som ovan (steg 2,6), fram till och med en vattenbaserad bioassay.
7. bioassay med vatten baserat blommig extrakt15,16 (aktiv-FE, passera-FE, rw-FE)
Obs: Se figur 1.
- Denna bioassay bereds i en LAF. Förbereda material: trippel skölj glas coverslips med 95% EtOH och torka, sedan gallrat. Skär papper handduk diskar till den inre diametern av en standard plast cell kultur rätter (9 cm). Placera 2 lager av papper diskar inom kultur rätter och blöt med 2 mL SDW.
- Bered minst 5 mL av en 1,0 X 105 conidia per mL SDW sporsuspensionen (C. fioriniae) som per ovan (steg 1.2-1.4), ställ åt sidan. Nästa, blanda lika stora volymer av SDW och vattenbaserade blommig extrakt i 2 mL mikrocentrifugrör. Sedan lägger du till en lika stor volym av sporsuspensionen beredda 2 mL mikrocentrifugrör (SDW plus FE); den resulterande beredningen benämns som en vattenlösning behandlingsblandningen. För kontroll, utelämna FE portion och ersätta med SDW, att hålla conidial koncentrationerna förenliga.
Obs: portionsstorleken är beroende av antalet replikat och tidpunkter. Vanligtvis överstiger delar inte 500 µL. När conidia och FE kombineras har bioassayen börjat, 0 h efter inympningen. - Plats i förväg rengjorda glas coverslips ovanpå de blöt hushållspapper inom cell kultur skålen. Placera en 40 µL droplet av vattenhaltigt behandlingsblandningen på mitten av ett täckglas. Upprepa för önskad behandlingar, inklusive kontroll, nära cell kultur skålen. Upprepa i separat cell kultur rätter för replikeringar (minst 3) och tidpunkter (varje maträtt är för 1 tidpunkt). När alla behandlingar och replikat har hällts, placera alla replikerade cell kultur rätter i en försluten plastbehållare (30 x 13 x 7 mm) och inkubera vid 25° C i mörker.
- På förutbestämda tidpunkter, Lägg till 10 µL av ett fixativ som lactophenol bomull-blå (20,0 g fenol kristaller, 20,0 mL 2,5% mjölksyra, 40,0 mL glycerol, 0,05 g bomull blå) droppar, stoppa tillväxt och semi bevara fästet.
- Vänta 2 h att samla 0 h tidpunkten som detta tillåter conidial vidhäftning till glasytan men är inte tillräckligt lång för conidial grobarhet. För alla andra tidpunkter, lägga fixativ vid motsvarande tid.
- När ett fixativ har lagts, noggrant Invertera den coverslips, placera dem droplet sida ner på ett glas objektglas att underlätta mikroskopisk undersökning (1 täckglas per bild). När alla coverslips på objektglas av glas, lämna dem att bosätta sig och delvis torra i flödet huven i 20 min.
- Räkna alla conidia (totala conidia) presenterar på täckglaset (primära conidia, grodda conidia och nybildade sekundära conidia) samt appressoria på antingen 400 X förstoring (räkna 16 fält) eller 200 X (räkna 4 fält), totalt en yta på 3.808 mm 2. replikera hela bioassay för statistisk analys. För analyser med hjälp av vattenbaserad FE, analysera data som beskrivs i Waller et al. 201716, vanligtvis visar så genomsnittliga count mm2 (totalt conidia eller appressoria).
8. bioassay med kloroform-baserade blommig extrakt (ch-FE)17
Obs: Se figur 2.
- Förbereda material och cell kultur rätter som per ovan (steg 7.1). Dessutom, skölj lika antal Van Tieghem celler (VanT. celler) (8 mm OD, 6 mm ID) till coverslips, liksom glas pipett (1 mL med ökningar på 1 µl) inom dragskåp, (två gånger med 95% EtOH sedan två gånger med kloroform), och ställ åt sidan.
- I LAF, med en 2 mL mikrocentrifug rör Lägg till två lika stora volymer (minst 500 µL portioner) av SDW och 1 volymdel sporsuspensionen och ställ åt sidan. Detta är den aqueous behandlingsblandningen för ch-FE bioassays.
- I ett dragskåp, placera ett VanT. cell på ett täckglas inom beredda plast cell kultur skålen. Dispensera (med glas pipett) 33 µL av önskad ch-FE in i centrera av cellen Van T. (rör inte väggarna i VanT. Cell; för kontroll behandling, Lägg oskuld kloroform), och Låt torka. Upprepa i separat cell kultur rätter för replikeringar (minst 3).
- När ch-FE har torkat, Dispensera 99 µL av beredda aqueous behandlingsblandningen med en vanlig pipett in i centrera av VanT. cell, då nära all cell kultur rätter. När den aqueous behandlingsblandningen har kommit i kontakt med de torkade ch-FE behandlingarna, har bioassayen börjat, 0 h efter inympningen.
- När alla behandlingar och replikat har hällts, placera alla (sluten) cell kultur rätter i en försluten plastbehållare (30 x 13 x 7 mm) och inkubera vid 25° C i mörker.
- Vid förutbestämda tidpunkter, tillsätt 15 µL av ett fixativ (lactophenol bomull-blå) till VanT. cell och Låt sitta i minst 5 min att försäkra tillräckligt svamp färgning. Efter den tiden, och ta försiktigt bort VanT. cell och följa täckglas inversion och data förvärv steg ovan (steg 7,5-7,6). För analys av data, Följ metoder som beskrivs i Gager 201517, vanligtvis visar data som appressorium bildning, som är förhållandet mellan totala conidia till appressoria räknas i området observerade (3.808 mm2).
9. tranbär fenologi-baserade extraktioner17
- Hand samla tranbär blommor (i juni; 100 g), omogen frukt (två gånger; Juli och augusti; 200 g), och mogen tranbär frukt vid skörd (oktober; 200 g), placera i lämplig storlek plastpåsar och kyla vid 4 ° C omedelbart efter uppsamlingen. Använd de förorening försiktighetsåtgärder som beskrivs ovan (steg 2.1).
Obs: Det kommer att finnas extra växtmaterial som samlas in varje gång men dessa belopp vakt mot utvinna uppenbarligen svamp infekterade äggstockarna och frukt (visar symtom och tecken på sjukdom). - Före extraktion, bort något sliten, skadade, sjuka blommor, sedan använder endast friska blommor, bort foderblad, stjälkar, korolla, pistillmärken, stilar och ståndare med böjd pincett (45 ° pincett) och kassera alla utom äggstockarna. När äggstockarna samlas, utföra kloroform-baserade utvinning på 1 wt: 9 vol baserat (detaljerad i steg 4.2-4.4, använder endast äggstockarna). Lagra prover tills alla andra extraktioner är komplett, dvs tills bioassay konduktans.
- När frukt samlas, utföra en kloroform-baserat extraktion (steg 4.2-4.4, med insamlade frukt i stället för blommor), men tillsätt 10 g frukt till 90 mL kloroform och en gång extraheras, låt lösningen avdunsta till 9 mL (vilket resulterar i en 10 g: 9 mL wt : vol lösning).
- Gör frukt extraktioner omedelbart efter insamling i juli, augusti och oktober. Lagra som per ovan (steg 4.4) tills alla extraktioner samlas. Efter sista kloroform-baserade frukt utvinning, angående alla penologi-baserade kloroform extrakt som samlats in för denna analys kloroform-baserade bioassayen och analysera med detta (steg 8,1-8,6).
Representative Results
Resultaten presenteras här är några exempel på de många analyser som kan utföras med hjälp av denna metod. Figur 1 är en illustrerad guide till vattenbaserade FE bioassayen, och kompletteras av figur 2 som följer till kloroform-baserade FE bioassayen. Figur 3 ger en visuell guide till vad som kan förväntas vid mikroskopisk utvärdering av C. fioriniae på 24 h, både vatten - och kloroform-baserade bioassays (jämfört SDW kontroller). Figur 4 beskriver en studie på 24 h tid-kurs med C. fioriniae i närvaro av tranbär sorten 'Stevens' ch-FE, och ger visuell referens till en import resultatet av denna forskning: FE minskade den tid som behövs för att bilda infektion strukturer jämfört med SDW. Figur 5 ger ett exempel på data som samlats in från ett täckglas bioassay med tranbär blommig regnvatten (CB ”blomma” rw-FE). Figur 6 representerar ett annat viktigt resultat: blommig äggstock ch-FE var mycket mer stimulerande än frukt ch-FE, om vikten av bloom i livscykeln för C. fioriniae. Kompletterande bilder och filmer ger viktiga visuella av blommorna används i extraktioner och blommig regnvatten samling enheter/distribution, förutom filmer som visualiserar den aktiva och passiva - utvinning ( vattenbaserade) processer.
Figur 1 : Allmän översikt över den vattenbaserade blommig extrahera (FE) bioassay. Denna analys var utnyttjas för vattenbaserade blommig extrakt med både blåbär och tranbär blommor: aktiv -blommig extrakt (aktiv-FE), passiv -blommig extrakt (passera-FE) och blommig regnvatten (rw-FE). -FE del utgör vanligtvis den experimentella/variabel faktorn. Omvänt-FE portion kan vara konstant och tid punkter/timmar efter inympningen kan utvärderas. Preferens har gjorts mot 4 fält analys på 200 X förstoring. Förkortningar: Sterilt avjoniserat vatten, SDW; Areal per synfält, A. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Allmän översikt över den kloroform-baserade blommig extrahera (ch-FE) bioassay. Denna analys var utnyttjas för både blåbär och tranbär (blommor, äggstockarna och frukt). Endast en typ av vattenhaltigt behandlingsblandningen användes i denna analys, 1 del sporsuspensionen till 2 delar SDW (att hålla conidial koncentration konsekvent genom avdunstning. ch-FE). Denna analys kan användas för att jämföra flera ch-FE (vaxer från olika växt ytor) eller flera tid punkter/timmar efter inympningen med hjälp av en enda ch-FE. Förkortningar: Sterilt avjoniserat vatten, SDW; Van Tieghem [glass] celler, VanT. cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Visuell jämförelse av Colletotrichum fioriniae i närvaro av vatten-baserade FE och ch-FE. I denna analys blåbär 'Bluecrop' (aktiv-FE, vattenbaserade) (svamp isolatet: BB #10) och tranbär 'Stevens' kloroform-baserade (ch-FE) (svamp isolatet: CB-PMAP182) blommiga extrakt jämfördes SDW kontroller. En dramatisk ökning av sekundära conidiation (ringar) och appressorium bildning (pilspetsar) observerades när man jämför conidia i närvaro av SDW (kontroll) (A) till aktiv-FE (B) på 24 h efter inympningen. Sekundära conidiation var dock inte lika uppenbart när man jämför kloroform bioassay SDW kontroll (C) till ch-FE (D); snarare, C. fioriniae tillväxt skiftat mot appressorial bildning. Visas är ett gemensamt svar på varje typ av utvinning, vattenbaserad och kloroform-baserade, oavsett host/blommiga arter beskrivs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tid-rätters studie (24 h) med Colletotrichum fioriniae i närvaro av ch-FE. I denna analys inspekterades visuellt en SDW kontroll (A-D) och tranbär 'Stevens' ch-FE (E-F) på 0, 6, 12 och 24 h efter inympningen (ett exempel på variabla punkter istället för att jämföra flera FE). Appressorium formation (pilspetsar) började på 6 h i ch-FE och ökat stadigt under hela efterföljande tidpunkter. Detta resultat undflyr till en viktig faktor för patogen biologi under perioden bloom: blommor minska den tid som behövs för att bilda infektion strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Grafisk visning av data som samlas in med rw-FE i en bioassay. Regnvatten köra från tranbär blommor (CB ”blomma” rw-FE) och virgin regnvatten som inte hade berört någon tranbär växt vävnader (”Ground” rw-FE) från en enda vätning-event plus en standard aktiva, vatten-baserade blommig Tranbärsextrakt (CB aktiva -FE) (positiv kontroll) och SDW (negativ kontroll) utsattes för en vattenbaserad täckglas bioassay och utvärderas för C. fioriniae tillväxt. CB ”blomma” rw-FE hade samma nivå av sekundär conidiation och appressorium bildning som den vanliga CB active-FE på 24 h efter inympningen, som anger att strömavtagare var effektiva i att fånga blommig stimulantia släppt under en vätning-händelse. Totala conidia består av primär (deponeras), conidia och nybildade sekundära conidia. Bokstäver anger signifikanta skillnader på p < 0,05 enligt Fischers minst signifikant skillnad testa (LSD); versaler, totala conidia; gemener, appressoria. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Tranbär fenologi baserat ch-FE bioassay, okulärbesiktning. Sjukdomsbehandling för frukt ruttna svampar ofta innebär bloom tid fungicid applikationer. Här utvärderades visuellt tranbär kloroform-baserade extrakt (ch-FE) från flera tillväxtstadierna för tranbär ('Stevens') effekten av surface vaxer på C. fioriniae på 24 h efter inympningen. Äggstockarna samlas i juni (A), omogen frukt samlas i juli och augusti (B, C), skördat frukt samlas in i oktober (D)och en SDW kontroll (E) inspekterades för appressorial bildandet (pilspetsar). Äggstocken ch-FE hade största omfattningen av appressorial bildas, som visar att denna anläggning fenologi (bloom) är kritiskt viktigt att den lifecycle av C. fioriniae. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur1: Blueberry Blomställning. Blåbär blommor samlades för extraktioner under full blom (April-maj i New Jersey, USA) (visas 'Bluecrop'). Observera överlappningen av korolla/äggstockar från intilliggande blommor och den övergripande arkitekturen av Blomställningen jämfört med kompletterande figur 2 (tranbär upprätt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: tranbär upprätt. Tranbär blommor samlades för extraktioner under full blom (juni-juli i New Jersey, USA) (visas 'Stevens'). Observera de omväxlande blomma stegen på en enda tranbär Blomställning (upprätt), och den krokiga, vatten droplet behålla formen på corolla. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Blueberry regnvatten distribution (blomma). Färdig blåbär blommig regnvatten samling enhet, placerad direkt under ett kluster av blomställningar. Observera de plastbelagda wire används för att orientera enheten vertikalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: Blueberry regnvatten distribution (stem). Avslutade blåbär blommig regnvatten samling anordning, placerat halvvägs ner stjälken mellan en blomställning och kronan på busken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 5: Blueberry regnvatten distribution (crown). Färdig blåbär blommig regnvatten samling anordning, placerat vid basen av busken (crown). Obs plast bestruket ledningar kan avlägsnas om det inte behövs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 6: Blueberry regnvatten distribution (marken). Avslutade jungfru regnvatten samling enheten, placeras intill blåbär buskar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 7: tranbär regnvatten distribution (närbild). Färdig tranbär blommig regnvatten samling enhet, med två stolpar instoppat under de prydligt korsade tråd band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 8: tranbär regnvatten distribution. Flera avslutade tranbär blommig regnvatten-enheter som distribueras i en mosse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: aktiv, vatten-baserade blommig extrakt (aktiv -FE). Kompletterande stöd för video följande steg 2,3-2.5.1. Blåbär 'Bluecrop' blommor användes. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande Movie 2: passiv, vatten-baserade blommig extrakt (passera-FE). Kompletterande stöd för video följande steg 3.3-3.4. Blåbär 'Bluecrop' blommor användes. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande film 3: distribution av tranbär blommig regnvatten samling enheter. Kompletterande stöd för video följande steg 6,4. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
De bioassays att upptäcka C. fioriniae svar blommig extrakt (FEs) utvecklades för blåbär och tranbär frukt ruttna pathosystems men kan lätt anpassas till andra trädgårdsgrödor. Det protokoll som anges ovan har varit värdefullt att förvärva många viktiga data set inklusive, men inte begränsat till: FE effekter på flera isolat av många patogener, tidsförlopp information som rör svamptillväxt stadier i närvaro av olika FEs, jämförelse av utvinning tekniker, inspektion av enskilda kemikalier på C. fioriniae tillväxt och differentiering, utvärdering av enskilda blomma orgel extrakter, effekter av temperatur på C. fioriniae medan i närvaro av FE, effekter fenologi beroende vax extraktioner och blommig regnvatten effekter. Med hjälp av dessa tekniker har data som genereras också lämnat en mycket tydligare förståelse av C. fioriniae liv arrangerar och delvis förtydligar varför perioden bloom är så kritiskt att kontroll av många frukter ruttna patogener.
Inledningsvis alla blommor bearbetades identiskt till det aktivt-FE, men extraheringen har rört sig mot med hjälp av hela blommor. Blommig dissektion var tidskrävande och hade mycket liten inverkan på bioaktiviteten av den resulterande FEs. Dock blommig individorgan kan och har varit utvärderade använder detta protokoll, men stor omsorg måste tas att inte helt lös upp blommig vävnader (kompletterande film 1, med försiktighetsåtgärder som beskrivs i steg 2,3), eftersom detta kan leda till frisläppt svampar-giftigt/statiska föreningar i FE som kan snedvrida de mikroskopiska utvärderingarna. Mindre invasiva extraktioner som pass -är FE (kompletterande Movie 2) och rw-FE nu mer gynnsam på grund av sin användarvänlighet förvärv. Dessutom kräver dessa utvinning tekniker endast dammsugarfilter att förvärva biologiskt aktiva blommig kemiska signaler.
Blommorna används i alla extraktioner var vanligen kyld för 0-3 dagar före extrahera förberedelse. En utmaning i detta protokoll är tid förvaltning av FE omsättning (fältuppsättningen genom lagring av extrakt). Detta förvärrades av många prover från flera källor och datum. Frusna blommor har inte utvärderats i någon verklig omfattning, som tinade blommorna försämrats och missfärgat. Dock när den vattenbaserade FEs har upprättats, upprepad frysning och upptining har inte visat någon effekt på bioaktiviteten i FE, så så länge som FE är snabbt omfrysning efter bioassay förberedelse (livskraftiga 3-årig FE).
Kloroform-baserat extraktion kan utredningen av patogen Svaren till tredimensionella blommig/frukt ytan vaxer i ett tvådimensionellt plan via ch-FE avdunstning på glas coverslips. Det är dock osannolikt att de faktiska kristallina strukturerna av vaxer deponeras från ch-FE är identiska till ytan där de samlades. Menande, kompletterande tekniker bör genomföras om svamp svar på specifika vax strukturer i vivo är i fokus för undersökningen. Kloroform-baserade extrakt behöver mer lagring underhåll än de vattenbaserade extraktioner. Förutom att hålla i ch-FE extrakt i mörkret, PTFE fodrad cellkulturen röret caps och parafilm tätning wrap behöver kontrolleras regelbundet för avdunstning läckor och ersättas vid behov.
Begreppet övervakning blommig regnvatten är rotad i idén om advancing platsspecifika sjukdom övervakningsverktyg. De regnvatten strömavtagare kan anpassas till många andra växt-arkitekturer, så länge samling enheten fångar regnvatten som har körts bort av blommor. Detta tillvägagångssätt ger information om huruvida blommig stimulering är närvarande på fältet vid varje given tidpunkt och kan övervakas under hela säsongen. Alternativt, samling enheter kan distribueras på flera kapell platser att avgöra hur långt blommig cues har tvättats under varje given vätning-event. I framtiden experiment, rw-FE kommer att diktera när fungicid program ska börja och när de kan säkert slut. Dessutom, genom att övervaka fenologi beroende vax extraktioner (protokoll avsnitt 9), har vikten av bloom perioden till patogen biologi blivit ännu tydligare. Det avsnittet ingick också för att Visa flexibiliteten i dessa bioassays, tillhandahålla metoder som möjliggör en sida-vid-sida jämförelse av värd yta vaxer som är tidsmässigt avgränsade. De data som genereras med hjälp av blommig utvinning tekniker och bioassays utgör konkreta indikatorer av patogen stimulering, specifika kemiska klasser viktigt att patogenen biologi och mål för framtida kontrollstrategier.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar den William S. Haines, Sr. begåvad tranbär forskningsfond och New Jersey blåbär och tranbär Research Council, Inc. för stöd. Vi vill också tacka Christine Constantelos (svamp kultur och blommig preparat), Langley Oudemans (blommig preparat, Filmning/fotografering), David Jones (blommig preparat och extraktioner), Jennifer Vaiciunas (vägledning och blommig preparat), Jesse Lynch (blommig preparat), Roxanne Tumnalis (allmänt stöd) och ett flertal student/Sommarpraktikanter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
