Summary
. הנה, מתוארים bioassays שנועד לעקוב אחר ההתפתחות של חיידקים פטריות, Colletotrichum fioriniae, בנוכחות תמציות פרחים עם אוכמניות או חמוציות על coverslips זכוכית דקה. מים, כלורופורם- ו שדה מי גשמים - מבוסס פרחוני מיצוי טכניקות מפורטים כמו גם תובנה איך המידע הזה יכול להיות מיושם.
Abstract
לעקוב במדויק את פנולוגיה של תקופת פריחה ואת הדינמיקה הטמפורלי של סימנים כימיים פרחוני פטרייתי פירות רקובים פתוגנים, שיטות הפקת פרחוני ו- coverslip bioassays פותחו ניצול Colletotrichum fioriniae. אוכמניות, חמוציות, זה פתוגן נשלטת בצורה אופטימלית על ידי יישום קוטלי פטריות במהלך תקופת פריחה בגלל משחק התפקידים פרחים בשלבים הראשונים של זיהום. פרוטוקול מפורט כאן מתאר איך פרחוני תמציות (FE) התקבלו באמצעות מים, כלורופורם- ושיטות שדה מבוססת על מי גשמים לשימוש מאוחר יותר ב- bioassays coverslip זכוכית המתאימים. כל FE שימש כדי לספק ערכה שונה של מידע: התגובה של fioriniae ג כימי פרחוני גויסו רמזים במים (על בסיס מים), פתוגן התגובה פרח פרי שעוות משטח (מבוסס על כלורופורם) ושל שדה מבוסס ניטור של אספו פרחים מי גשמים, עוברים במבחנה תצפיות סביבה חקלאית. פה בהרחבה מתואר כמו גם או כלורופורם-על בסיס מים, עם bioassay המתאימה המתוארת שפיצתה ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה. מי גשמים זה ברחה פרחים נאספה במכשירים ייחודי עבור כל יבול, המאזכרים הגמישות ואת יישום של גישה זו עבור מערכות חיתוך אחרות. Bioassays מהירה, זולה, פשוטה, ומספקים את היכולת להפיק ייתכן בייעודי לאתר מידע על הנוכחות של תרכובות פרחוני מופחתים ממקורות שונים. מידע זה בסופו של דבר מוטב יעדכן אסטרטגיות ניהול המחלה, כפי FE לקצר את הזמן הדרוש עבור זיהום להתרחש, ובכך לספק תובנה שינוי הסיכונים לזיהום הפתוגן במהלך עונת הצמיחה.
Introduction
Colletotrichum fioriniae גורמת פירות הריקבון Highbush אוכמניות (Vaccinium corymbosum ל') והן את1,גדול אמריקאי חמוציות (נ' macrocarpon ואיתן)2. הפתוגן הזה היה מותווה לאחרונה acutatum ג מינים מורכבות3,4,5,6 , הוא סוכן סיבתי של אוכמניות anthracnose וחבר הריקבון פרי החמוציות מורכבות, מעורר רבים אחרים צמח מחלות ברחבי העולם7. Fioriniae ג יש רדומים, hemibiotrophic סגנון חיים8, עם זיהומים המתרחשים במהלך בלום ופיתוח סימפטום לא הופך להיות לכאורה עד הפרי נמצאים בשלבים הסופיים של התבגרות9. אוכמניות, חמוציות, פירות רוט נשלטת רק בצורה הולמת עם פטריות יישומים שנעשו במהלך תקופת פריחה. המחלה overwinters אוכמניות רדום באד פרחוני סולמות10 , sporulates במהלך בלום. Conidia מועברים במהלך החופה באמצעות גשם-splash פיזור11,12 , הצטברות inoculum יש כבר בקורלציה חריפה תקופה פריחה13. תגובתה של מינים Colletotrichum פרחים המארח אינה ייחודית Vaccinium, כמו פרחים חשובים מרכיבי פוסט הדר בלום פירות טיפה (PFD)14 , כמו גם anthracnose תות15, בשני המקרים הגורם המחלה כדי sporulate. לכל המקרים הללו מדגישות את הצורך בשיטות יעילות להעריך את הדינמיקה הטמפורלי של רמזים כימי פרחוני על fioriniae ג ו פתוגנים אחרים הפוגעים במהלך בלום. התובנות שמספקת בשיטות המתוארות כאן הופכים להיות יותר ויותר יקר יותר.
פרוטוקול זה מפרט שיטות רכש תמצית פרחים (FE) ומנחה הערכת התגובות fioriniae כ FE דרך זכוכית coverslip bioassays15,16. טכניקות החילוץ פרחוני מחולקות לשני סוגים עיקריים; עקירות על בסיס מים (פעיל-FE, פסיבי (pass -FE), ולא שדה מבוססת על מי גשמים (rw-FE)), והשאיבה17 מבוססי כלורופורם (ch-FE). הקוד שיחולץ על בסיס מים מאפשרים בדיקה של מים גייסה סימנים כימיים פרחוני. אלו רמזים גויסו הם מרכיבים חשובים עשוי בית המשפט זיהום, מאז FE מגדיל מאוד את המהירות של זיהום16, בנוסף לספק את הלחות הדרושה הזיהום להתרחש. בנוסף, הם מייצגים מצב טבעי יותר כמו גירוי פרחוני יכולים להישטף לאורך החופה במהלך הרטבה-אירועים כפי שנצפו בעבר אוכמניות,14,אחרים מערכות חיתוך16. עקירות פרחוני מבוסס כלורופורם (ch-FE) מספקים גם מידע חשוב המתייחס הפתוגן בתגובה מארח משטח waxes17,18, הבהרת בשלבים צמיחה מוקדמת של conidia פעם הנמסרים רגישים האיברים המארח (קרי פרחים, השחלות, פרי פיתוח). הפתוגן בתגובה לשינויים עונתיים שעוות משטח מארח ניתן גם לנטר שימוש בפרוטוקול זה. בהתאם לכך, bioassays מותאמים לעבודה עם או פה על בסיס מים או מבוססי כלורופורם FE כדי להמתיק את ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה.
הנתונים המופקים bioassays חשף כי על בסיס מים עקירות לעורר רמות גבוהות יותר של conidiation משנית יותר מבוסס כלורופורם עקירות איפה שהיתה היענות appressorial מוחלטת, ולכן שמערבות תרכובות מרובים נוכח פה. מעניין, שניהם מהתגובות צמיחה נצפו כאשר באמצעות מי גשמים הפועלות מחוץ פרחים אוכמניות, חמוציות, המציין תרכובות מופחתים מרובים יכולים להישטף מפני השטח של פרחים. לפיכך, ניטור לגירוי פרחוני יספקו תובנה ההסתברות להצלחה פתוגן בכל מערכת חקלאית.
המטרה הסופית של פרוטוקול זה נועד לספק מתודולוגיה למידע ביצירת הבסיס הביולוגי על פתוגנים צמח פטרייתי בתגובה סימנים כימיים פרחוני, וכן ייזום מתודולוגיות יכול להשתמש במידע פרחוני זה כדי לסייע תהליכי קבלת החלטות וניהול מחלה הספציפיות-לאתר.
Protocol
1. פטרייתי מבודד, המתלים נבג
- לבודד Colletotrichum fioriniae מן המארח באופן טבעי נגוע19. לאחר מכן, לאחסן את התרבויות נקי כשהתירס אגר (CMA) מלוכסנים. מקום הכנס של תרבות (מתוך שיפוע CMA) על גבי תא פלסטיק סטנדרטי תרבות מאכל (9 ס מ קוטר) המכיל שגם מובהר V8 מיץ אגר (cV8A) (שונה מ- 1955 מילר), או שאינו מובהר V8 מיץ אגר (V8A)20. כאשר המושבות להתחיל sporulate, פסים conidia (גושים conidial כתום) אל cV8A או V8A אחר המכיל תא תבשיל תרבות (עם לולאה סטרילי סטנדרטי) כדי לייצר תרבות sporulating בצפיפות גבוהה.
הערה: כל הפעולות פרוטוקול עם פטריות צריכה להתבצע בתוך תא למינארי כדי לצמצם את האפשרות של זיהום פטרייתי תרבויות ו/או bioassays. - לאחר 7 ימים של צמיחה, באמצעות לולאה סטרילי סטנדרטי לאסוף כמות קטנה של conidia מתרבות בצפיפות גבוהה (על-ידי בקלילות לגעת הלולאה למסה conidial) ומערבבים את זה לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, המכיל 10 מ"ל מים יונים סטרילי (SDW). מערבולת את הדוגמית הזו. במשך 10 s, ואז בעזרת פיפטה סטנדרטי של מים עמוקים למעלה ולמטה פעמים רבות כדי ערבוב נוסף המדגם.
- לאחר מכן, מקום טיפה של הדגימה vortexed אל hemocytometer, להעריך את הריכוזים. נבג. ספירת 5-10 השדות ב- hemocytometer, לקבל את הממוצע, הכפל ממוצע בהגורם המתאים דילול (קרי 10,000), ובכך להשיג את הריכוז conidial לכל mL SDW.
- ואז באמצעות אמצעי אחסון (V) / משוואת ריכוז (C) (V1● [C1] = V2● [C2]) להסתגל 1.0 X 10 conidia5 לכל מיליליטר SDW עם אמצעי אחסון הסופי של 5 מ"ל (עם SDW). זו נחשבת ההשעיה נבג, מתבצע רק מיד לפני השימוש בגם bioassay.
2. פעיל, על בסיס מים תמציות פרחים (פעיל -FE)15,16
הערה: ראה משלימה איור 1, 2 איור משלים, משלימה איור 3 ומשלימה סרט 1.
- בזהירות יד-לאסוף אוכמניות (אפריל-מאי) ופרחים (יוני-יולי) חמוציות במהלך שלהם פורחת שיא המתאימים בשדה (משלימה איור 1). ללבוש ושנה nitrile כפפות בין מיקומים דגימה (הזנים/סוגים/פיזי מיקומים) לעכב בזיהום שמן של העור האנושי, כמו גם לחצות זיהום בין זני פרחים. במקום פרחים, או אוכמניות או חמוציות (ממקור יחיד) בשקיות פלסטיק (למלא שקית 100 x 150 מ מ), ומעבירים מיד ב 4 ° C ברגע פרחים נאספים.
הערה: פעיל - הפקת שינוי מפני ליאנדרו ואח. (2003) 16. - לפני החילוץ, להסיר כל הפרחים הורע, פגוע, חולה ולאחר מכן באמצעות פרחים בריא להסיר את השחלות, עלי גביע ו peduncles עם מלקחיים מעוקל (45˚ פינצטה) ולמחוק. השתמש רק האיברים שנותרו (קורולה, סטיגמה, סגנון, אבקן) פעיל - עקירות. לחתוך גזה (150 x 150 מ מ), מניחים בתוך משפך 7 x 7 מ מ למקם לתוך שפופרת צנטרפוגה נקי 50 מ ל, להפריש.
- לשלב 1 החלק מעובד פרחים SDW 9 חלקים (1 wt: יחס כרך 9) במרגמה. בעדינות לטחון עם כבעלי ב-30 s (שמור כדי לא לגמרי pulverize הדגימות). זן זולה שנוצר דרך גזה מוכן/משפך ולאסוף בצינור צנטריפוגה (50 מ"ל). נקי או שימוש חדש מרגמה איחדו בין כל חילוץ עם 95% EtOH מים זורמים חמים.
- הכן מנגנון סינון ואקום: לאסוף בוכנר משפך, מסנן ואקום Erlenmeyer הבקבוק (עד 1000 מ"ל קיבולת), 55 מ מ מעגל מסנן נייר, צינור ואקום/מקור. להוסיף נייר סינון משפך בוכנר בגודל המתאים למקם על גבי הבקבוק, ואז להתחבר מכשיר מים / שאיבה מקור דרך צינור ואקום ו להפריש.
- כמוסיף תמציות פרחים אוכמניות על ידי צריך שתוציאו 10 דקות ב 8,055 x g. יוצקים את תגובת שיקוע לתוך מסנן ואקום מוכן המנגנון, להפעיל מקור ואקום, לסנן תגובת שיקוע, ואז שופכים את תוכן הבקבוק לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש (50 מ"ל). לנקות את כל הרכיבים מכשיר בין כל סינון עם 95% EtOH מים זורמים חמים. מסנן נוסף באמצעות מזרק הותאם 0.22 מיקרומטר נקבוביות בגודל, אצטט לחיטוי, מסנן לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש (50 מ"ל).
- תמציות פרחים חמוציות, רק אבק מסנן דרך נייר סינון, שופכים את תוכן הבקבוק לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש (50 מ"ל).
- הכנה המתקבל מכונה פעיל- תמצית פרחים (פעיל -FE). לאחסן כל על בסיס מים פרחוני תמציות (פעיל-, פסיבית-, מי גשמים אוספים) ב-20 ° C ב- 5-50 מ"ל aliquots עד שימוש ניסיוני. חזור על עקירות עם מספר דוגמאות (לפחות 3 עקירות לפי סוג הדגימה) כדי לספק משכפל.
3. פסיבי , על בסיס מים תמציות פרחים ( עוברים -FE) 16
הערה: ראה הסרט משלים 2.
- יד פרחים לאסוף אוכמניות שלמה (50 גרם) כאמור לעיל, להכניס למקרר לאחר איסוף. לפני החילוץ, להסיר כל הפרחים הורע, פגוע, חולות, להסיר רק את peduncles של פרח ללא פגע. להכניס למקרר דגימות מוכן עד פסיבי - מערכת חילוץ, המתוארים להלן, נמצא במקום.
- לשטוף כל רכיבי מראש לשימוש עם 95% אתנול (EtOH), מים זורמים חמים למניעת זיהום (גיליון פלסטיק רשת, שתי סלסילות רשת פלסטיק, זכוכית לחם פן ו משאבה לערפל בקבוק). גם להכין שפופרת צנטרפוגה שכבה 4 בכותנה/משפך/50 מ"ל לכל חילוץ כמפורט לעיל (בשלב 2.2), או להניח בצד.
- מכינים המסננת: הנח גיליון פלסטיק רשת (aka ברורות בר מחצלות) לסל אחד רשת פלסטיק (114 x 102 מ מ). מניחים סלסלת רשת נוספת, זהה, הפוך (הפוכה) לתוך זכוכית לחם-פאן (127 x 229 מ"מ) (כדי למנוע פרחים יושב SDW) המקום רשת השינוי גיליון המכיל סל על גבי. להוסיף 50 גר' של פרחים מוכן לתוך המסננת.
הערה: לחלופין, סלים מבחנה קטנה [טיהור] יכול לשמש במקום הסלים בשימוש במקור רשת פלסטיק (רשת הישן, ירוקים, תות ליטר סלים הם לעתים קרובות קשה את המקור). - אחיד ערפל פרחים עם 250 מ ל באמצעות משאבה ערפל בקבוק וללכוד נגר במחבת זכוכית הלחם. לאחר מכן מסננים פילטרט של דרך גזה/המשפך מוכן לתוך שפופרת צנטרפוגה נקי. הכנה המתקבל מכונה פסיבית- תמצית פרחים (pass -FE); חנות לפי לעיל (שלב 2.6).
- לנקות את כל הרכיבים בין כל חילוץ עם 95% EtOH מים זורמים חמים. חזור על עקירות עם דגימות מרובים כדי לספק משכפל (לפחות 3 לפי סוג הדגימה).
4. כלורופורם המבוסס על תמציות פרחים (ch-FE) 17
- לאסוף פרחים אוכמניות, חמוציות לפי לעיל (שלב 2.1) והכן פרחים לחילוץ (שלב 2.2, ללא הכנה בכותנה/משפך). שמור פרחים מוכן בקירור עד לפני השימוש.
- יש לבצע כל עבודה שבוצעה עם הכלורופורם בשכונה fume מטעמי בטיחות. זה כולל הכנה של חומרים / כלי זכוכית, מיצוי הליכים, מוליכות bioassay (השלבים באמצעות ch-FE).
- לנקות את כל הרכיבים עם 95% EtOH פעמיים ולאחר מכן פעמיים עם הכלורופורם למניעת זיהום לחילוץ כל: משורשרות צינורות תרבות זכוכית, 2 ספלים מזכוכית, מסך קטן נירוסטה וגליל לתואר שני [זכוכית]. להפריש על ההפוכות יבש. לשטוף טפלון (PTFE) מרופדת כמוסות פעמיים עם 95% EtOH בלבד (כלורופורם יגרום נזק החומרים החיצוניים של הכיפה) להפריש להתייבש.
- לשלב 1 החלק מעובד פרחים 9 חלקים כלורופורם (1 wt: יחס כרך 9) בתוך (פרחים כלורופורם ואז), בעדינות מערבולת 30 s, מסננים דרך מסך נירוסטה לתוך כשהספל השני. שופכים ch-FE מ הספל השני לתוך הצינור תרבות זכוכית (10-15 מ ל), ולהצמיד את הכובע PTFE. לעטוף את הכובע עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות.
- ההכנה הזאת היא התמצית פרחוני מבוסס כלורופורם (ch-FE). לאחסן מדגם בחשיכה (כדי להפחית את השפלה אור) ב 4 ° C עד שימוש ניסיוני. חזור על עקירות עם דגימות מרובים כדי לספק משכפל (לפחות 3 לפי סוג הדגימה).
5. איסוף מי גשמים מ פרחים אוכמניות (BB rw-FE)16
הערה: המכשיר אוסף של מי גשמים פרחוני אוכמניות מורכב גביע ספריי אוויר צבע חד פעמיות אקדח ריסוס עם חיבור מתאם (גביע: חוט הנשי, מתאם: זכר זכר חוט), 50 מ ל צנטריפוגה צינורות (פוליפרופילן), מצלמות-מיקרוסקופים (חוטים מצופה פלסטיק טלפון רגיל חוט, חוט פנימי בודדים סטרנד תוכן).
- בחר מספר מיקומים בתוך שיח האוכמניות ללכוד את מי גשמים להפעיל את הפרחים לפני יצירת אוסף התקנים. אלה כוללים ישירות מתחת התפרחות (פרח) על בסיס מאוד של בוש (כתר). קוטר הרשומה הגבעולים (הנע בין 1-5 ס מ) במיקומים שנבחרו, כמו זה יכתיב את גודל חורים משמש התקן המצורף, המתוארים להלן.
- עבור כל מיקום שנבחר ליצור התקן אוסף. תחילה לקדוח חור בתחתית כוס ספריי (איפה בגביע מתעקם לכיוון הפתח משורשרות) עד לקוטר גזע המתאים, עם מעט-שלב מצורף לי.. לאחר מכן, חותכים קו ישר מהחלק העליון של thehole הפה של הגביע ספריי. קודחים חורים קו מקביל 4 (גדול מספיק כדי חוט חוט מצופה פלסטיק), בפתחו של הגביע ספריי, וחבר קצה אחד החוטים מצופה פלסטיק עוזב קצה אחד חינם.
- לקדוח חור גדול מספיק להפעיל את המתאם גביע ריסוס צבע לתוך צנטריפוגה 50 מל מכסה כיפה. חותם חוטי מתאם עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע דליפה. לחבר את זה כובע צנטריפוגה והן משורשרות חלק בגביע ריסוס. לצרף את הצינור צנטריפוגה ובסיומה 50 מ.
- חזור על שלבים 5.3-5.4 כדי ליצור התקנים מרובים לפי המיקומים הנבחרים, מינימום של אוסף 4 מכשירים לפי מיקום הדגימה.
- לפרוס את ההתקנים במיקומים שנבחרו על ידי כיפוף ריסוס כוסות כדי להתאים אל הגבעולים. אוריינט את הצד החלק של גביע ספריי כלפי מעלה באמצעות החוטים מצופה פלסטיק המחוברים אחרים הגבעולים (כדי להבטיח מים עובר על פרחים נלכד). מוספית מצלמות-מיקרוסקופים מקומות פנויים שיכול לדלוף מי גשמים. (משלימה איור 3, 4 איור משלים, משלימה איור 5ו משלימה איור 6).
- תווית צינורות אוסף עם פריסה תאריך / זמן. לאחר אירוע גשם, להסיר ולהחליף את החלק התחתון (שפופרת) של הצינור צנטריפוגה (תווית תאריך / זמן של אוסף). אוספים נגר (המכונה אוכמניות מי גשמים פרחוני תמצית (BB rw-FE)) בתוך ומביא אבק מסנן (סינון שמתואר צעדים 2.4-2.5). החנות מעל (שלב 2.6), עד בשימוש של bioassay על בסיס מים.
6. איסוף מי גשמים מפרחים חמוציות (CB rw-FE)
- המכשיר איסוף מי גשמים פרחוני של חמוציות מורכב 7 X 7 ס מ פוליפרופילן משפך, צינורות צנטריפוגה 50 מ ל (פוליפרופילן), מצלמות-מיקרוסקופים, תקן 4, פלסטיק מצופה טוויסט קשרים (לפי התקן).
- ראשית, חום לנקב חורים קו מקביל 8 (קוטר של קשרים טוויסט) סביב הפה של המשפך באמצעות בדיקה מתכת. להוסיף טוויסט קשרים 4 חורים. לצרף את הקצוות האחרים מיקום מול את הבורות, ויוצרים דפוס מעבר מסודר. לעטוף את משפך למטה-גזע עם מצלמות-מיקרוסקופים, מניחים בצד.
- לקדוח חור גדול מספיק כדי להוסיף מטה-הגזע משפך לתוך כובע צנטריפוגה 50 מ עם מעט שלב. הכנס משפך מוכן הכיפה צנטריפוגה. חזור על שלבים 6.2-6.3 כדי ליצור התקנים מרובים, מינימום של אוסף 4 מכשירים לפי מיקום הדגימה.
- פריסת התקנים עם תוויות (תאריך/שעה) לתוך ביצות חמוציות שנבחרו. בצורה מסודרת טאק 2 פרח ברינג התפרחות (המכונה שלד) תחת הקשרים טוויסט פלסטיק מוצלב. ואז אנכית אוריינט את המכשיר על ידי פירסינג הצינור צנטריפוגה לתוך החופה חמוציות (משלימה דמויות 7-8, 3 הסרט משלים).
- לאחר גשמים או מקרן השקיה להסיר ולהחליף את החלק התחתון (שפופרת) של הצינור צנטריפוגה (תווית תאריך / זמן של אוסף). נגר (המכונה תמצית חמוציות מי גשמים פרחוני (CB rw-FE)) בתוך ומביא אבק מסנן (סינון שמתואר צעדים 2.4-2.5). החנות מעל (שלב 2.6), עד בשימוש של bioassay על בסיס מים.
7. bioassay באמצעות מים מבוסס פרחוני תמציות15,16 (פעיל-FE, עוברים-FE, rw-FE)
הערה: ראה איור 1.
- Bioassay הזה מוכן בתוך תא למינארי. להכין חומרים: שטיפה טריפל coverslips זכוכית דקה עם 95% EtOH, אוויר יבש, ואז לשים בצד. לחתוך נייר מגבת דיסקים הקוטר הפנימי של מנות התרבות תאים פלסטיק סטנדרטי (9 ס מ). מקום 2 שכבות של נייר דיסקים בתוך תרבות מנות ומשרים עם 2 מ"ל SDW.
- להכין לפחות 5 מ של 1.0 X 10 conidia5 לכל מיליליטר SDW נבג ההשעיה (fioriniae ג) לפי לעיל (שלב 1.2-1.4), מניחים בצד. בשלב הבא, מערבבים נפחים שווים של SDW ואת תמצית פרחים על בסיס מים ב- 2 mL צינורות microcentrifuge. לאחר מכן, להוסיף אמצעי שווה של ההשעיה נבג הצינורות microcentrifuge mL 2 מוכן (SDW בתוספת FE); הכנת המתקבל מכונה תערובת מימית טיפול. עבור הפקד, להשמיט את החלק FE והחלף SDW, כדי לשמור על עקביות ריכוזי conidial.
הערה: גודל המנות תלוי מספר משכפל ואת הזמן-נקודות. בדרך כלל, חלקים לא יעלה על 500 µL. ברגע conidia ו- FE משולבים bioassay החלה, פוסט-חיסון הו. - מקם את coverslips זכוכית נקי מראש דקה על גבי מגבות הנייר ספוג בתוך המנה התרבות תאים. במקום droplet 40 µL תערובת מימית טיפול במרכז coverslip. חזור עבור טיפולים הרצוי, כולל את הפקד, קרוב המנה התרבות תאים. חזור על מנות התרבות תאים נפרדים עבור שכפולי (לפחות 3) נקודות זמן (כל מנה היא נקודת זמן 1). לאחר כל הטיפולים, משכפל יש כבר ויתרו, למקם את כל המנות תרבות תא משוכפלת לתוך מיכל פלסטיק אטום (30 x 13 x 7 מ מ) ואת דגירה 25° c בחושך.
- זמן קבוע מראש-נקודות, להוסיף 10 µL של מקבע כמו lactophenol כותנה-כחול (20.0 גר' פנול קריסטלים, 20.0 מ"ל 2.5% חומצה לקטית, 40.0 mL גליצרול, 0.05 גרם כותנה כחול) טיפות, עצירת גדילה ו למחצה שמירה על ההר.
- לחכות שעתיים כדי לאסוף את נקודת הזמן הו זה מאפשרת הדבקה conidial על משטח זכוכית, אך זה לא מספיק זמן עבור נביטה conidial. עבור כל שאר הנקודות זמן, הוסף מקבע בזמן המתאים.
- פעם אחת לשבועיים נוספה, היפוך בקפידה על coverslips, הצבתם droplet בצד למטה על משטח זכוכית מיקרוסקופ כדי להקל על בדיקה מיקרוסקופית (1 coverslip לכל שקופית). כאשר כל coverslips בשקופיות זכוכית מיקרוסקופ, להשאיר אותם להתיישב ויבש חלקית בשכונה זרימה עבור 20 דקות.
- ספירת שכל conidia (סה כ conidia) להציג על coverslip (conidia ראשי conidia מונבטים, שהוקם conidia משניים) כמו גם appressoria או 400 X הגדלה (ספירת שדות 16) או 200 X (ספירת 4 תחומים), בהיקף של שטח של 3.808 מ מ 2. לשכפל את כל התכולה יוצאת לשם ניתוח סטטיסטי. עבור מבחני באמצעות FE על בסיס מים, לנתח נתונים כמתואר וולר. et al. 201716, בדרך כלל הצגת רשע מ"מ/ספירה2 (סה כ conidia או appressoria).
8. bioassay באמצעות מבוססי כלורופורם פרחוני תמציות (ch-FE)17
הערה: ראה באיור 2.
- להכין חומרים וסלולרי תרבות מנות לפי לעיל (שלבים 7.1). בנוסף, לשטוף מספר שווה של ואן Tieghem תאים (רועים גרמני. תאים) (8 מ מ OD, 6 מ מ ID) coverslips, כמו גם על פיפטה מזכוכית (1 מ"ל עם בהפרשים קבועים של 1 µl) בתוך ברדס fume, (פעמיים עם 95% EtOH ואז פעמיים עם הכלורופורם), להפריש.
- למינארי, באמצעות צינור microcentrifuge 2 מ ל להוסיף שני נפחים שווים (לפחות 500 µL חלקים) SDW ונפח 1 נבג השעיה ולאחר מכן להפריש. זוהי תערובת מימית טיפול עבור bioassays ch-FE.
- במקום ברדס fume, של רועים גרמני. תא אל coverslip זכוכית בתוך המנה תרבות מוכן תא פלסטיק. לוותר על (פיפטה מזכוכית) 33 µL של ch-FE הרצוי לתוך המרכז של התא ואן ט (אל תיגע קירות רועים גרמני. תא; לטיפול שליטה, להוסיף כלורופורם בתולה), ואפשר להתייבש. חזור על מנות התרבות תאים נפרדים עבור שכפולי (לפחות 3).
- ברגע ch-פה יש מיובשים, לוותר על µL 99 של תערובת מוכנה טיפול מימית עם פיפטה סטנדרטי למרכז רועים גרמני. תא, ואז הכל קרוב תא תרבות מנות. ברגע תערובת מימית טיפול בא במגע עם הטיפולים ch מיובשים-FE, bioassay החלה, פוסט-חיסון הו.
- לאחר כל הטיפולים, משכפל יש כבר ויתרו, למקם את כל המנות התרבות התא (סגור) לתוך מיכל פלסטיק אטום (30 x 13 x 7 מ מ), דגירה 25° c בחושך.
- זמן קבוע מראש-נקודות, להוסיף 15 µL של מקבע (lactophenol כותנה-כחול) רועים גרמני. התא ואת בסדר לפחות 5 דקות להבטיח מכתים פטרייתי נאותה. לאחר מכן, הסר בזהירות את רועים גרמני. תא ובצע coverslip היפוך ונתונים רכישה השלבים לעיל (שלבים 7.5-7.6). עבור ניתוח נתונים, פעל בשיטות המתוארות Gager 201517, בדרך כלל הצגת נתונים כמו היווצרות appressorium, אשר הוא היחס בין סה כ conidia כדי appressoria נספרים באזור שנצפו (3.808 מ מ2).
9. חמוציות עקירות מבוססי פנולוגיה17
- היד לאסוף פרחים חמוציות (בחודש יוני; 100 גרם), לא בוגר פרי (פעמיים; יולי ואוגוסט; 200 גרם), ולומדים פירות חמוציות על הקציר (אוקטובר; 200 גרם), במקום בשקיות פלסטיק בגודל מתאים, ומעבירים ב 4 ° C מיד לאחר איסוף. השתמש באמצעי הזהירות זיהום שפורטו לעיל (שלב 2.1).
הערה: תהיה צמח נוסף החומר שנאסף בכל מועד אבל סכומים אלה להתגונן מפני חילוץ השחלות נגוע ברור פטרייתי ופירות (מראה תסמינים וסימנים של המחלה). - לפני החילוץ, להסיר כל הפרחים הורע, פגוע, חולה ולאחר מכן באמצעות פרחים רק בריא, להסיר את עלי גביע, peduncles, corollas, סטיגמות, סגנונות, אבקנים עם מלקחיים מעוקל (45 ° פינצטה) ולמחוק הכל חוץ השחלות. ברגע השחלות נאספים, מבצע החילוץ מבוססי כלורופורם ב 1 wt: יחס כרך 9 (מפורט בשלבים 4.2-4.4, שימוש רק השחלות). לאחסן דגימות עד כל עקירות אחרים הושלמו, דהיינו עד bioassay מוליכות.
- ברגע פירות נאספים, ביצוע של כלורופורם מבוססי החילוץ (השלבים 4.2-4.4, באמצעות פירות שנאספו במקום פרחים), אבל להוסיף 10 גרם של פירות 90 מ של כלורופורם, פעם חילוץ, לאפשר את הפתרון מתמוססות 9 מ ל (וכתוצאה wt 9 מ ל ז: 10 : פתרון vol).
- לבצע עקירות פירות מיד לאחר איסוף בחודשים יולי, אוגוסט, אוקטובר. חנות לפי לעיל (שלב 4.4) עד כל עקירות נאספים. אחרי החילוץ פירות מבוסס כלורופורם האחרון, נושא כל תמציות כלורופורם מבוססי פנולוגיה אנו אוספים עבור זה וזמינותו bioassay מבוססי כלורופורם ולנתח בהתאם (צעדים 8.1-8.6).
Representative Results
התוצאות המובאות כאן הן מספר דוגמאות מבחני רבים שניתן לבצע באמצעות מתודולוגיה זו. איור 1 הוא מדריך מאויר bioassay FE על בסיס מים, בתוספת איור 2 אשר מלווה את bioassay FE מבוססי כלורופורם. איור 3 מספק מדריך ויזואלי מה אפשר לצפות על ההערכה מיקרוסקופיים של fioriniae ג 24 שעות, בשניהם bioassays מים כלורופורם מבוססות (בהשוואה SDW פקדי). איור 4 פרטים ללמוד מסלול הזמן 24 שעות ביממה עם fioriniae ג בנוכחות המגוון חמוציות 'סטיבנס' ch-FE, ונותנת התייחסות חזותית תוצאה ייבוא של מחקר זה: FE ירד את הזמן הדרוש כדי מבנים הזיהום דמויי לעומת SDW. איור 5 מספק דוגמה לנתונים שנאספו bioassay coverslip באמצעות מי גשמים פרחוני חמוציות נגר (CB "פרח" rw-FE). איור 6 מייצגת תוצאה חשובה נוספת: שחלה פרחוני ch-FE היה מופחתים הרבה יותר מאשר פרי ch-FE, ומציין את החשיבות של בלום במחזור החיים של fioriniae ג. משלימה תמונות וסרטים מספקים רכיבים חזותיים חשובים של הפרחים לשימוש עקירות התקנים אוסף מי גשמים פרחוני/פריסה, בנוסף סרטים להמחיש את (מיצוי פעיל - וגם פסיבי- תהליכים מבוססי-מים).
איור 1 : סקירה כללית של מבוסס מים פרחוני לחלץ bioassay (FE). Assay הזה היה מנוצל על בסיס מים תמציות פרחים עם פרחים הן אוכמניות, חמוציות: פעיל -פרחוני תמציות (פעיל-FE), פסיבית -פרחוני תמציות (עוברים-FE) פרחוני מי גשמים ונגר (rw-FE). FE-החלק בדרך כלל מהווה הגורם ניסויית/משתנה. לעומת זאת-FE החלק יכול להישאר קבוע, ניתן להעריך זמן נקודות/שעות לאחר חיסון. העדפה הפך לקראת ניתוח שדה 4-200 X הגדלה. קיצורים: מים יונים סטרילי, SDW; שטח, שדה ראייה, א אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : סקירה כללית של מבוססי כלורופורם פרחוני לחלץ bioassay (ch-FE). Assay הזה היה מנוצל עבור נוחות אוכמניות וחמוציות (פרחים, השחלות ופירות). רק סוג אחד של תערובת מימית הטיפול היה בשימוש זה וזמינותו, ההשעיה נבג חלק 1 ל 2 חלקים SDW (כדי לשמור על ריכוז conidial עקביות בשל התאיידות ch-FE). Assay זה יכול לשמש כדי להשוות מרובים ch-FE (שעוות של משטחי המפעל השונים), או מרובות זמן נקודות/שעות לאחר חיסון באמצעות ch-פה אחד. קיצורים: מים יונים סטרילי, SDW; ואן Tieghem [זכוכית] תאים, רועים גרמני. תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : השוואה חזותית של Colletotrichum fioriniae בנוכחות בסיס מים FE ו- ch-FE- ב זה אוכמניות assay 'Bluecrop' (פעיל-FE, על בסיס מים) (בידוד פטרייתי: BB #10) וחמוציות 'סטיבנס' מבוססי כלורופורם (ch-FE) (בידוד פטרייתי: CB-PMAP182) תמציות פרחים, לעומת SDW פקדים. עלייה דרמטית משני conidiation (טבעות) ויצירת appressorium (חץ) נצפו בעת השוואת conidia בנוכחות SDW (בקרה) (א) ל פעיל-FE (B) -חיסון לאחר 24 שעות. עם זאת, conidiation משני ניכרה לא כמו בהשוואת כלורופורם bioassay SDW לפקד (ג) ch-FE (ד); במקום זאת, fioriniae ג הצמיחה נעה לעבר היווצרות appressorial. הראו תגובה שכיחה כל סוג הוצאה, על בסיס מים, מבוססי כלורופורם, ללא קשר מינים מארח/פרחוני המתואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הזמן-קורס לימוד (24 שעות) עם Colletotrichum fioriniae בנוכחות ch-FE- ב assay הזה, SDW שליטה (A-D) ו- "סטיבנס" חמוציות ch-FE (E-F) נבדקו באופן חזותי ב- 0, 6, 12 ו- 24 שעות לאחר חיסון (דוגמה של נקודות זמן משתנה השוואת FE מרובים). היווצרות Appressorium (חץ) החל ב- 6 ש ח בחודש ch-FE, גדל בהתמדה לאורך זמן עוקבות נקודות. התוצאה חומקת אל גורם חשוב בביולוגיה הפתוגן במהלך תקופת פריחה: פרחים לצמצם את הזמן הדרוש כדי מבנים הזיהום דמויי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : תצוגה גרפית של הנתונים שנאספו באמצעות rw-FE bioassay. מי גשמים לברוח ממני חמוציות פרחים (CB "פרח" rw-FE) ותתכבד בתולה אשר לא נגעו בכל רקמות הצמח חמוציות ("בשטח" FE-rw) מן הרטבה-אירוע אחד בתוספת של תקן פעיל, חמוציות על בסיס מים פרחוני תמצית (CB פעיל -FE) (בקרה חיובית) SDW (בקרה שלילית) היו לאמירה של bioassay coverslip על בסיס מים, הערכה לצמיחה fioriniae ג . CB "פרח" rw-FE היו באותה הרמה של משני צורה conidiation ו- appressorium כמו תקן CB פעיל-FE-24 שעות לאחר חיסון, המציין כי המכשירים אוסף היו יעילים בלכידת ממריצים פרחוני שפורסמו במהלך הרטבה-אירוע. Conidia סה כ מורכבת ראשי (הפקיד), conidia ו conidia משני שהוקם. אותיות מצביעים על הבדלים משמעותיים ב- p < 0.05 לפי הבדל משמעותי לפחות של פישר מבחן (LSD); אותיות רישיות, סה כ conidia; קטנות, appressoria. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : פנולוגיה חמוציות המבוסס על ch-FE bioassay, בדיקה ויזואלית. ניהול המחלה פירות רקובים פטריות לעתים קרובות כרוך בלום זמן פטריות יישומים. כאן, חמוציות מבוססי כלורופורם תמציות (ch-FE) בשלבים רבים הצמיחה של חמוציות ('סטיבנס') הוערכו באופן חזותי עבור האפקט של שעוות משטח על fioriniae ג -חיסון לאחר 24 שעות. השחלות שנאספו בחודש יוני (א), פרי לא בוגר שנאספו בחודשים יולי ואוגוסט (B, C), פירות שנקטפו שנאספו באוקטובר (ד)ופקד SDW (E) נבדקו על היווצרות appressorial (חץ). השחלה ch-FE היו בסדר הגודל הגדול ביותר של היווצרות appressorial, המציינת כי זה צמח פנולוגיה (בלום) חשובה ביותר מחזור החיים של fioriniae ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: תפרחת אוכמניות. פרחים אוכמניות נאספו על עקירות במהלך פריחתה (אפריל-מאי בניו ג'רזי, ארה ב) (מוצג 'Bluecrop'). שימו לב את החפיפה של corollas/שחלות מפרחים סמוכים, הארכיטקטורה הכוללת של התפרחת לעומת משלימה איור 2 (חמוציות זקופה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 2: זקוף חמוציות. פרחים חמוציות נאספו על עקירות במהלך פריחתה (יוני-יולי בניו ג'רזי, ארה ב) (מוצג "סטיבנס"). הערה את פרח מגוון דרגות על תפרחת חמוציות יחיד (אנכי), ולא את מכור, מים droplet שמירה על צורת corolla. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 3: אוכמניות מי גשמים פריסה (פרח). להשלים אוכמניות מי גשמים פרחוני אוסף התקן, ישירות תחת אשכול של התפרחות. שימו לב חוט מצופה פלסטיק נהגה אנכית אוריינט המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה באיור 4: אוכמניות מי גשמים פריסה (גזע). אוכמניות שהושלמו מי גשמים פרחוני אוסף התקן, מניחים מחצית הדרך הגבעול בין תפרחת של הכתר של בוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 5: אוכמניות מי גשמים פריסה (כתר). להשלים אוכמניות מי גשמים פרחוני אוסף התקן, ממוקם בבסיס של בוש (כתר). ניתן להסיר הערה חוטים מצופה פלסטיק אם לא הכרחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 6: אוכמניות מי גשמים פריסה (הקרקע). להשלים המכשיר אוסף מי גשמים בתולה, להציב סמוך שיחי האוכמניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 7: מי גשמים חמוציות פריסה (תקריב). הושלמה התקן איסוף מי גשמים פרחוני חמוציות, עם שלד שתי מקופלות מתחת הקשרים כבל מוצלב בצורה מסודרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 8: מי גשמים חמוציות הפריסה. מרובה להשלים מי גשמים פרחוני חמוציות התקנים לפרוס בביצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה סרט 1: תמציות פרחים פעיל, על בסיס מים (פעיל -FE). תמיכת וידאו משלימה ביצוע השלבים 2.3-2.5.1. אוכמניות 'Bluecrop' פרחים שימשו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
משלימה את הסרט 2: פסיבי, תמציות פרחים על בסיס מים (עוברים-FE). תמיכת וידאו משלימה בעקבות צעדים 3.3-3.4. אוכמניות 'Bluecrop' פרחים שימשו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
משלימה הסרט 3: פריסה של התקנים איסוף מי גשמים פרחוני חמוציות. תמיכת וידאו משלימה בעקבות צעד 6.4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Discussion
Bioassays גילוי התגובה fioriniae ג תמציות פרחים (FEs) פותחו עבור פרי אוכמניות, חמוציות רוט pathosystems אך ניתן להתאים בקלות אחרים צינה. פרוטוקול שתוארו לעיל יש כבר ערך להשגת ערכות נתונים חשובים רבים כולל, אך לא מוגבל: FE אפקטים מרובים מבודד של פתוגנים רבים, זמן-קורס מידע המתייחס צמיחה פטרייתי שלבים בנוכחות פס שונים, השוואה של טכניקות החילוץ, בדיקה של כימיקלים בודדים על צמיחה fioriniae ג ובידול, הערכה של פרחים בודדים איברים תמציות, השפעת טמפרטורה על fioriniae ג ואילו בנוכחות FE, אפקטים פנולוגיה שעווה התלויים עקירות, ואפקטים מי גשמים פרחוני. באמצעות שיטות אלה, נתונים שנוצרו יש גם בתנאי הבנה ברורה יותר של החיים fioriniae ג שלבים חלקית elucidates בגלל התקופה בלום היא כל כך קריטית השליטה של פירות רבים נרקב פתוגנים.
בתחילה, כל הפרחים עובדו באופן זהה פעיל-FE, אבל תהליך החילוץ עבר לכיוון באמצעות פרחים שלם. חיתוך פרחוני היה זמן רב, מעט מאוד השפעה על bioactivity של פס וכתוצאה מכך. עם זאת, איברים פרחים בודדים יכולים ויש כבר הערכה שימוש בפרוטוקול הזה, אבל זהירות רבה יש לנקוט כדי לא לגמרי macerate הרקמות פרחוני (1 סרט משלימה, עם הזהירות מפורט בשלב 2.3), כמו זה עלול לגרום שפורסמו פטריות-רעילים סטטיות תרכובות לתוך פה זה יכול לעוות את ההערכה מיקרוסקופיים. פחות עקירות פולשניים כגון מעבר -FE (משלימה את הסרט 2) ו- rw-FE הן כעת יותר חיובית עקב שלהם להקל על רכישת. בנוסף, טכניקות החילוץ אלה דורשים רק ואקום סינון כדי לרכוש פעילים ביולוגית סימנים כימיים פרחוני.
הפרחים מנוצל כל עקירות היו בדרך כלל בקירור של 0-3 ימים לפני הכנת תמצית. אתגר של פרוטוקול זה הוא ניהול זמן תחלופת FE (שדה אוסף דרך אחסון של תמציות). זה היה מתעצמת על דגימות רבות מספר מקורות ותאריכים. פרחים קפוא לא הוערכו במידה כלשהי אמיתי, כמו פרחים המופשרים מופיעים הורע, דהוי. עם זאת, ברגע הוכנו על פס על בסיס מים, חזר על הקפאת מפשיר הראה אין השפעה על bioactivity של פה, אז כל עוד פה והוקפאו הם במהירות לאחר הכנה bioassay (FE 3 בת קיימא).
כלורופורם מבוססי החילוץ מאפשר החקירה של פתוגן התגובות שעוות משטח תלת מימדי פרחוני/פרי במטוס מימדי באמצעות אידוי ch-FE על coverslips זכוכית דקה. עם זאת, סביר כי המבנים גבישי בפועל של שעוות שהופקדו מ ch-FE זהים השטח שממנו הם היו שנאספו. יש ליישם טכניקות משמעות, משלימה אם פטרייתי בתגובה שעווה ספציפי מבנים ויוו המוקד העיקרי של החקירה. תמציות מבוססי כלורופורם צריך תחזוקה אחסון יותר מאשר הקוד שיחולץ על בסיס מים. בנוסף לשמירת ch-FE תמציות בחושך, התרבות התא PTFE מרופדת צינור כובעים, מצלמות-מיקרוסקופים איטום גלישת צריך להיבדק באופן קבוע על הדלפות אויר והחליף במידת הצורך.
הרעיון של ניטור מי גשמים פרחוני נגר מושרשת ברעיון של קידום בכלי ניטור מחלות ספציפיות-לאתר. המכשירים איסוף מי גשמים ניתן להתאים ארכיטקטורות צמחים רבים אחרים, כל עוד המכשיר אוסף לוכדת מי גשמים יש להפעיל את הפרחים. גישה זו מספקת מידע על או לא גירוי פרחוני נוכח בשטח בכל זמן נתון, ניתן לנטר לאורך העונה. לחלופין, ניתן לפרוס אוסף התקנים במיקומים מרובים החופה כדי לקבוע עד כמה רמזים פרחוני נשטפו במהלך כל נתון הרטבה-אירוע. בעתיד ניסויים, rw-FE תכתיב כאשר יישומים פטריות כדאי להתחיל ולסיים מתי הם יכולים בבטחה. בנוסף, על ידי ניטור פנולוגיה שעווה התלויים עקירות (פרוטוקול סעיף 9), החשיבות של תקופת פריחה הפתוגן לביולוגיה הפך אפילו יותר ברור. מקטע זה נכללה גם להדגים את הגמישות של אלה bioassays, מתן שיטות המאפשרים השוואה side-by-side של שעוות משטח מארח המופרדות חנותם. הנתונים נוצר באמצעות טכניקות החילוץ פרחוני bioassays מייצגים מוחשי אינדיקטורים של גירוי הפתוגן, מחלקות כימי מסוים חשוב הפתוגן ביולוגיה, מטרות אסטרטגיות שליטה עתידית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים של ויליאם ס היינס, קרן מחקרים חמוציות ניחן האב ואת ניו ג'רזי אוכמניות וחמוציות מחקר המועצה, inc... על התמיכה. אנו מודים גם ג'ניפר Vaiciunas (והכוונה ההכנות פרחוני), כריסטין Constantelos (תרבות פטרייתי וההכנות פרחוני), דייוויד ג'ונס (תכשירים צמחיים, עקירות), לאנגלי Oudemans (תכשירים צמחיים, לצלם/צילום), ג'סי . לינץ ' (תכשירים צמחיים), רוקסן Tumnalis (תמיכה כללית), בו מתמחים סטודנט/קיץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
