Summary
Aqui, os bioensaios projetados para monitorar o desenvolvimento de um patógeno fúngico, Colletotrichum fioriniae, na presença de extractos florais mirtilo ou arando sobre as lamelas de vidro são descritos. Água, clorofórmio e água da chuva de campo - base floral extração técnicas são detalhadas bem como introspecção como esta informação pode ser aplicada.
Abstract
Para monitorar com precisão a fenologia do período de flor e a dinâmica temporal das sugestões químicas florais na fruta fungosas patógenos a apodrecer, foram desenvolvidos métodos de extração floral e lamela bioensaios utilizando Colletotrichum fioriniae. No mirtilo e amora, esse patógeno é otimamente controlado aplicando fungicidas durante o período de flor por causa da dramatização de flores na fase inicial da infecção. O protocolo detalhado aqui descreve como florais extratos (FE) foram obtidas utilizando água, clorofórmio e métodos de campo baseada em água da chuva para uso posterior em bioensaios de lamela de vidro correspondente. Cada FE serviu para fornecer um conjunto de informações diferentes: resposta de fioriniae c. a química floral mobilizada sugestões na água (à base de água), resposta de patógeno a flor e ceras de superfície de frutas (baseado em clorofórmio) e baseado no campo de monitoramento de coletados floral da água da chuva, movendo-se em vitro observações para um cenário agrícola. O FE é genericamente descrito como qualquer ou clorofórmio-à base de água, com um bioensaio apropriado descrito para compensar as diferenças inerentes entre estes dois materiais. Água da chuva que havia fugido de flores foi coletada em dispositivos exclusivos para cada cultura, aludindo à flexibilidade e à aplicação desta abordagem para outros sistemas de colheita. Bioensaios são rápidos, baratos, simples e fornecem a capacidade de gerar spatiotemporal e site-specific informações sobre a presença de compostos florais estimulatórios de várias fontes. Esta informação, finalmente, melhor informará estratégias de gestão de doença, como FE diminuir o tempo necessário para a infecção ocorrer, assim fornecendo a introspecção mudando os riscos para a infecção do patógeno sobre a estação de crescimento.
Introduction
Colletotrichum fioriniae provoca uma podridão de frutos de Highbush Blueberry (Vaccinium corymbosum L.) e o grande americano Cranberry (V. macrocarpon Aiton)1,2. Este patógeno foi recentemente delineado do c. acutatum espécies complexas3,4,5,6 e é um agente causal da antracnose de mirtilo e membro da podridão fruta amora complexos, além de causar inúmeras outras plantas doenças no mundo7. C. fioriniae tem uma latente, hemibiotrophic estilo de vida8, com infecções ocorrem durante o desenvolvimento de bloom e sintoma não se tornando aparente até que a fruta está em fase final de maturação9. Em blueberry e cranberry, fruta podre é apenas adequadamente controlada com aplicações de fungicida, feitas durante o período de flor. O patógeno overwinters em mirtilo dormente broto floral escalas10 e sporulates durante a flor. Conídios são movimentados em todo o dossel através de respingo de chuva dispersão11,12 e acúmulo de inóculo tem sido fortemente correlacionado a flor período13. Resposta de espécies de Colletotrichum às flores de anfitrião não é exclusiva de Vaccinium, como flores são importantes componentes da fruta de citrino post flor caiam (PFD)14 , bem como morango antracnose15, em ambos os casos causando o patógeno para esporular. Todos esses casos destacam a necessidade de métodos eficazes avaliar a dinâmica temporal das sugestões químicas florais na c. fioriniae e outros patógenos que infectam durante a flor. Os insights fornecidos pelos métodos descritos aqui estão se tornando cada vez mais valiosos.
Este protocolo detalha os métodos de aquisição de extrato floral (FE) e orienta a avaliação das respostas de c. fioriniae para FE através da lamela de vidro bioensaios15,16. As técnicas de extração florais são divididas em dois tipos principais; extrações de à base de água (ativo-FE, passiva (pass -FE) e campo baseado em água da chuva (rw-FE)) e extrações de17 baseado em clorofórmio (ch-FE). Inspeção de água mobilizada floral sugestões químicas permitem as extrações à base de água. Estes tacos mobilizados são prováveis componentes importantes do Tribunal de infecção, pois FE aumenta consideravelmente a velocidade de infecção16, além de fornecer a umidade necessária para a infecção ocorrer. Além disso, eles representam uma condição mais natural como estímulo floral pode ser lavado em toda o dossel durante eventos-umectante como observadas anteriormente em blueberry e outros sistemas de colheita14,16. Extracções florais baseado em clorofórmio (ch-FE) também fornecem informações valiosas referentes a resposta do patógeno a superfície do hospedeiro ceras17,18, elucidar os estágios iniciais de crescimento de conídios uma vez depositados em suscetíveis órgãos de host (ou seja, flores, ovários e frutos em desenvolvimento). Resposta do patógeno a mudanças sazonais na superfície ceras host também pode ser monitorada usando este protocolo. Por conseguinte, bioensaios são adaptados para trabalhar com FE à base de água ou FE baseado em clorofórmio para atenuar as diferenças inerentes entre estes dois materiais.
Os dados gerados a partir de bioensaios revelaram que extrações à base de água estimulam níveis mais elevados de conidiation secundário que extrações baseado em clorofórmio onde não havia uma resposta definitiva appressorial, implicando, portanto, vários compostos presente na fé. Curiosamente, ambos dessas respostas de crescimento foram observados quando usar água da chuva que tinha funcionado fora flores de mirtilo e amora, indicando vários compostos estimulatórios pode ser lavado da superfície das flores. Assim, monitoramento para estimulação floral irá fornecer insights sobre a probabilidade de sucesso do patógeno em um sistema agrícola.
O objetivo final do presente protocolo é fornecer uma metodologia para geração de base biológica obter informações sobre patógenos fúngicos planta em resposta a sinais químicos florais, bem como metodologias de iniciação que podem utilizar esta informação floral para auxiliar na processos de gestão e tomada de decisões específicas da doença.
Protocol
1. fungos isolados e suspensões de esporos
- Isole o Colletotrichum fioriniae de um hospedeiro naturalmente infectado19. Em seguida, armazene as culturas limpas em inclinações de ágar (CMA) de farinha de milho. Coloque o plugue de cultura (de cunho CMA) para uma cultura celular de plástico padrão prato (9 cm de diâmetro) contendo que também esclareceu ágar de suco V8 (cV8A) (modificado de Miller 1955), ou não-esclarecido V8 suco agar (V8A)20. Quando as colónias começam a esporular, raia conídios (laranja massas conidiais) em outro cV8A ou V8A contendo prato de cultura celular (com um loop padrão estéril) para produzir uma cultura sporulating high-density.
Nota: Quaisquer etapas de protocolo com fungos devem ser realizadas em uma capa de fluxo Laminar para reduzir a possibilidade de contaminação de culturas fúngicas e/ou bioensaios. - Após 7 dias de crescimento, usando um loop padrão estéril coletar uma pequena quantidade de conídios de cultura de alta densidade (tocando levemente o loop para a massa conidiais) e agitar isto em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de água destilada estéril (SDW). Vórtice esta amostra para 10 s e, em seguida, usando uma pipeta padrão mergulhar subir e descer inúmeras vezes a mistura mais a amostra.
- Em seguida, coloque uma gota da amostra para o hemocytometer vortexed e estimar as concentrações de esporos. Campos do Conde 5-10 sobre a hemocytometer, obter a média e multiplicar a média pelo fator de diluição adequada (ou seja, 10.000), obtendo-se assim a concentração conidiais por mL SDW.
- Em seguida, usando um volume (V) / equação de concentração (C) (V1● [C1] = V2● [C.2]) ajustar (com SDW) a 1,0 X 105 conídios / mL de SDW com um volume final de 5 mL. Isto é referido como a suspensão de esporos e é feito apenas imediatamente antes da utilização em qualquer bioensaio.
2. ativo, extratos florais à base de água (ativo -FE)15,16
Nota: Ver Figura suplementar 1, suplementar Figura 2, suplementar Figura 3e filme suplementar 1.
- Mirtilo cuidadosamente mão-coletar (abril-maio) e amora (Junho-Julho) flores, durante suas respectivas pico flores no campo (Supplemental Figura 1). Vestir e mudar de luvas de nitrilo entre locais de amostragem (locais de cultivares/variedades/físico) para inibir a contaminação do óleo de pele humana, bem como a contaminação cruzada entre variedades florais. Coloque as flores de mirtilo ou arando (a partir de uma única fonte) em sacos de plástico (encher um saco de 100 x 150 mm) e imediatamente refrigerar a 4 ° C, uma vez que as flores são coletadas.
Nota: A extração do ativo - é modificada de Leandro et al. (2003) 16. - Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes, em seguida, usando flores saudáveis remover os ovários, sépalas e pedúnculos com pinça curvada (pinça de 45º) e descarte. Use apenas os restantes órgãos (corolla, estigma, estilo e estame) para ativo - extrações. Corte a gaze (150 x 150 mm) e coloque dentro de um funil de 7 x 7 mm, coloque em um tubo de centrífuga de 50ml limpo e reserve.
- Combine 1 parte processada flores para 9 partes SDW (1 wt: 9 relação de vol) em um almofariz. Lixar suavemente com um pilão para 30 s (tome cuidado para não completamente pulverizar as amostras). Coe a polpa resultante através da gaze/funil preparado e coletar em tubo de centrífuga (50 mL). Limpar ou usar argamassa/pilão novo entre cada extracção com 95% EtOH e água corrente morna.
- Preparar um aparelho de vácuo filtração: reunir funil Buchner, frasco de Erlenmeyer de filtro de vácuo (até 1.000 mL de capacidade), papel de filtro 55mm círculo e mangueira de vácuo/fonte. Adicionar o papel de filtro para um funil de Buchner de tamanho adequado e coloque no topo do balão, em seguida, conectar o aparelho a uma água / fonte via vácuo mangueira de sucção e reserve.
- Esclarecer os extratos florais de mirtilo por centrifugação por 10min a 8.055 x g. Decantar o sobrenadante no aparelho preparado filtro de vácuo, ligue a fonte de vácuo, filtrar o sobrenadante e, em seguida, despeje o conteúdo do frasco para um novo tubo de centrifugação (50 mL). Limpe todos os componentes do aparelho entre cada filtração com 95% EtOH e água corrente morna. Filtro adicional através de uma seringa adaptada com um 0,22 µm tamanho do pore, acetato de esterilização, filtro para um novo tubo de centrifugação (50 mL).
- Para os extratos florais arandos, só vácuo filtrar através de filtro de papel e despeje o conteúdo do frasco para um novo tubo de centrifugação (50 mL).
- Preparação resultante é referida como ativo- extrato floral (ativo -FE). Armazene todos os extractos florais à base de água (ativo- passivo-, coleções de água da chuva) a-20 ° C em alíquotas de 5-50 mL até o uso experimental. Repita as extrações com várias amostras (pelo menos 3 extrações por tipo de amostra) para fornecer Replica.
3. passivo , extratos florais à base de água ( passe -FE) 16
Nota: Ver filme suplementar 2.
- Dê flores de mirtilo todo cobrar (50 g) como acima e leve à geladeira após a coleta. Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes e remover apenas os pedúnculos de flor intacta. Refrigere amostras preparadas até o passivo - sistema de extração, descrito abaixo, está no lugar.
- Enxague todas antes de componentes para usar com 95% de etanol (EtOH) e água corrente quente para evitar a contaminação (folha do engranzamento plástico, duas cestas de engranzamento plástico, vidro Cuba e garrafa de névoa de bomba). Também prepare um tubo de centrifugação de gaze/funil/50 mL de 4 camadas para cada extração como descrito acima (passo 2.2) e reserve.
- Preparar a peneira: Coloque uma folha de plástico malha (aka clara bar esteiras) em uma cesta de uma malha de plástico (114 x 102 mm). Coloque um cesto de malha segundo, idênticos, de cabeça para baixo (invertido) em um vidro pão-pan (127 x 229 mm) (para evitar flores sentado em SDW) e coloc a malha folha contendo cesta no topo. Adicione 50 g de flores preparadas para a peneira.
Nota: Como alternativa, cestas de pequeno tubo de ensaio [limpeza] podem ser usadas no lugar das cestas de engranzamento plástico originalmente usado (malha Velha, verde, morango pinta cestas são frequentemente difíceis de fonte). - Uniformemente névoa flores com 250 mL, usando uma bomba de garrafa da névoa e capturar o segundo turno em vidro pão-pan. Depois coe filtrado através do gaze/funil preparado em um tubo de centrifugação limpo. Preparação resultante é conhecida como passivo- extrato floral (pass -FE); loja conforme acima (passo 2.6).
- Limpe todos os componentes entre cada extracção com 95% EtOH e água corrente morna. Extrações de repetição com várias amostras para fornecer Replica (pelo menos 3 por tipo de amostra).
4. baseado em clorofórmio extratos florais (ch-FE) 17
- Recolher flores de mirtilo e cranberry como por acima (passo 2.1) e preparar as flores para extração (passo 2.2, sem preparação de gaze/funil). Manter flores preparadas refrigeradas até antes da utilização.
- Qualquer trabalho realizado com clorofórmio deve ser executado em uma coifa por razões de segurança. Isso inclui a preparação de materiais / produtos vidreiros, procedimentos de extração e condutância bioensaio (etapas usando ch-FE).
- Limpar todas as peças com 95% EtOH duas vezes, em seguida, duas vezes com clorofórmio para evitar a contaminação por cada extracção: rosca tubos de cultura de vidro, 2 copos de vidro, tela pequena de aço inoxidável e um cilindro graduado [vidro]. Reserve a seco de ponta-cabeça. Lave as tampas de politetrafluoretileno (PTFE) alinhada duas vezes com 95% EtOH apenas (clorofórmio irá danificar os materiais exteriores da PAC) e reserve para secar.
- Combinar 1 parte processada flores para 9 partes de clorofórmio (1 wt: rácio de vol 9) num copo (flores então clorofórmio), suavemente redemoinho por 30 s e a tensão através de uma tela de aço inoxidável para o segundo copo. Despeje o tubo de cultura de vidro (10-15 mL) ch-FE do segundo copo e fixe a tampa PTFE. Enrole a tampa com o parafilm para evitar a evaporação.
- Esta preparação é o extrato floral baseado em clorofórmio (ch-FE). Armazenar a amostra na escuridão (para reduzir a degradação de luz) a 4 ° C até o uso experimental. Extrações de repetição com várias amostras para fornecer Replica (pelo menos 3 por tipo de amostra).
5. coleta de água da chuva de flores de mirtilo (BB rw-FE)16
Nota: O dispositivo de recolha de águas pluviais floral mirtilo consiste de um copo de pulverizador ar injetor de pulverizador pintura descartável com adaptador de conexão (Copa: BSP, adaptador: rosca macho/macho), tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm e fios revestidos de plástico ( telefone padrão fio, conteúdo de vertente individual fio interno).
- Selecione vários locais dentro de um arbusto de mirtilo para capturar executada fora flores antes da criação de dispositivos de captação de água de chuva. Estes incluem diretamente sob inflorescências (flor) para a mesma base da sarça (coroa). Registro diâmetro das hastes (variando de 1 a 5 cm) em locais selecionados, como isso vai ditar o tamanho dos buracos utilizados para fixação do dispositivo, descrita abaixo.
- Para cada local selecionado crie um dispositivo de recolha. Primeiro faça um furo no fundo de um copo de pulverizador (onde a Copa curvas para a abertura de rosca) para o correspondente diâmetro do caule, com um passo-bit ligado a uma imprensa de broca. Em seguida, corte uma linha reta do topo da solitária para a boca do copo pulverizador. Broca 4 furos equidistantes (grandes o suficiente para fio o fio revestido plástico), na foz da Copa do pulverizador e anexar a uma das extremidades dos fios revestidos plásticos deixando uma extremidade livre.
- Um buraco grande o suficiente para o adaptador de Copa de pulverizador de tinta da linha em uma tampa de tampa de centrífuga de 50 mL. Selo de segmentos de adaptador com parafilm para evitar fugas. Este fixe a tampa centrífuga e a parte rosqueada da Copa do pulverizador. Prenda o tubo de centrífuga de 50ml acasaladas.
- Repita as etapas 5.3-5.4 para criar vários dispositivos como por locais seleccionados, um mínimo de dispositivos de recolha 4 por local de amostragem.
- Implante dispositivos em locais selecionados flexionando copos de pulverizador para caber em hastes. Oriente o lado do corte da Copa do pulverizador para cima usando os fios revestidos de plástico ligados a outras hastes (para segurar a água passando por cima de flores é capturada). Apor parafilm quaisquer aberturas que poderiam vazar a água da chuva. (Supplemental Figura 3 suplementar Figura 4, suplementar Figura 5e suplementar Figura 6).
- Tubos de colheita de rótulo com implantação de data / hora. Após um evento de chuva, remover e substituir a parte inferior (tubo) do tubo (rótulo data / hora da coleção). Trazer coleções de escoamento (referidas como extrato de mirtilo águas pluviais floral (BB rw-FE)) dentro e vácuo filtro (filtração descrito em etapas 2.4-2.5). Loja como acima (passo 2.6), até que usei em um bioensaio à base de água.
6. coleta de água da chuva de flores de Cranberry (CB rw-FE)
- O dispositivo de recolha de águas pluviais floral em cranberry consiste de um funil polipropileno 7 X 7 cm, tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm, e 4 padrão, plástico revestido laços de torção (por dispositivo).
- Primeiro, o calor punção 8 furos equidistantes (diâmetro de laços de torção) ao redor da boca do funil usando uma sonda de metal. Laços de torção Insira 4 furos. Afixe as outras pontas para local oposto dos furos que, formando um padrão de cruzamento perfeito. Enrole para baixo-haste de funil com parafilm e reserve.
- Um buraco grande o suficiente para inserir o funil para baixo-tronco em um boné de centrífuga de 50 mL com um pouco de passo. Insira a tampa da centrífuga, funil preparado. Repita as etapas 6.2-6.3 para criar dispositivos múltiplos, um mínimo de dispositivos de recolha 4 por local de amostragem.
- Implante dispositivos etiquetados (data/hora) para pântano amora selecionado. Ordenadamente aconchegar duas flor rolamento inflorescências (conhecidas como verticalidades) sob os laços de torção plásticos cruzados. Então verticalmente Oriente o dispositivo perfurando o tubo de centrifugação para o dossel amora (Supplemental figuras 7-8, suplementar Movie 3).
- Após a precipitação ou sobrecarga de irrigação remover e substituir a parte inferior (tubo) do tubo (rótulo data / hora da coleção). Trazer o escoamento (referido como extrato de águas pluviais amora floral (CB rw-FE)) dentro e vácuo filtro (filtração descrito em etapas 2.4-2.5). Loja como acima (passo 2.6), até que usei em um bioensaio à base de água.
7. bioensaio usando água com base em extratos florais15,16 (ativo-FE, passar-FE, FE-rw)
Nota: Consulte a Figura 1.
- Este bioensaio é preparado em uma capa de fluxo Laminar. Preparar materiais: enxágue triplo as lamelas de vidro com 95% EtOH e ar seco, em seguida colocar de lado. Corte discos de toalha de papel para o diâmetro interno de um pratos de cultura celular de plástico padrão (9 cm). Coloque 2 camadas de discos de papel dentro de pratos de cultura e mergulhe com 2ml SDW.
- Prepare pelo menos 5 mL de um 1.0 X 105 conídios / mL de SDW suspensão de esporos (c. fioriniae) como por acima (passo 1.2-1.4), reservados. Em seguida, Misture volumes iguais de SDW e extrato floral à base de água em 2 mL microcentrifuge tubos. Em seguida, adicionar um volume igual da suspensão de esporos aos tubos de microcentrifuga de 2ml preparado (SDW mais FE); a preparação resultante é referida como uma mistura de tratamento aquoso. Para o controle, omitir parte FE e substitua SDW, para manter concentrações conidiais consistente.
Nota: o tamanho da parcela é dependente do número de repetições e tempo-pontos. Normalmente, porções não exceda 500 µ l. Uma vez conídios e FE são combinados o bioensaio começou, após inoculação de 0 h. - Coloque as lamelas de vidro previamente limpos em cima as toalhas de papel embebido dentro do prato de cultura de células. Coloque uma gota de 40 µ l da mistura aquosa tratamento no centro de uma lamela. Repita para tratamentos desejados, incluindo o controle, feche a placa de cultura de células. Repita em pratos de cultura celular separado para replicações (pelo menos 3) e os pontos de tempo (cada prato é para 1 ponto de tempo). Uma vez que o fornecimento de todos os tratamentos e repetições, colocar todos os pratos de cultura celular replicada em um recipiente plástico selado (30 x 13 x 7 mm) e incube a 25° C, no escuro.
- Nos pontos de tempo pré-determinado, adicionar 10 µ l de um fixador como algodão-azul de lactophenol (cristais de fenol 20,0 g, o ácido láctico de 20,0 mL 2,5%, glicerol 40,0 mL, 0,05 g algodão azul) para as gotas, impedindo o crescimento e semi preservando a montagem.
- Espere 2h para coletar o ponto de tempo de 0 h como este permite conidiais aderência à superfície de vidro, mas não é tempo suficiente para a germinação conidiais. Para todos os outros pontos de tempo, adicione o fixador na hora correspondente.
- Uma vez que foi adicionado um fixador, cuidadosamente inverta as lamelas, colocando-os lado da gota para baixo em um vidro de microscópio para facilitar o exame microscópico (1 lamela por slide). Quando todas as lamelas são nas corrediças de vidro de microscópio, deixá-los para resolver e parcialmente seco do capuz de fluxo por 20 min.
- Contagem de todos os conídios (totais conídios) presentes na lamela (conídios primários, germinados conídios e recém-formado conídios secundários) bem como apressórios ou 400 X ampliação (contando 16 campos) ou 200X (contando 4 campos), totalizando uma área de 3,808 mm 2. replicar todo bioensaio para análise estatística. Para os ensaios usando FE à base de água, analisar os dados, conforme descrito em Waller et al 201716, exibindo normalmente como média contagem/mm2 (conídios totais ou apressórios).
8. bioensaio usando baseado em clorofórmio extrai Floral (ch-FE)17
Nota: Consulte a Figura 2.
- Preparar materiais e pratos da cultura como por (passos 7.1) acima da pilha. Além disso, um número igual de Van Tieghem células (VanT.) enxaguar (8 mm de diâmetro externo, 6 mm ID) lamelas, bem como uma pipeta de vidro (1 mL com incrementos de 1 µ l) dentro de uma coifa, (duas vezes com 95% EtOH então duas vezes com clorofórmio) e reserve.
- Na capa do fluxo laminar, usando um tubo de microcentrifugadora 2 mL adicionar dois volumes iguais (pelo menos 500 porções µ l) de SDW e 1 volume de suspensão de esporos, então Reserve. Esta é a mistura de tratamento aquoso para bioensaios ch-FE.
- Em uma coifa, coloque um VanT. célula em uma lamela de vidro dentro do prato de cultura celular de plástico preparado. Dispensar (pipeta de vidro) 33 µ l de ch-FE desejado para o centro da célula T. Van (não toque as paredes do VanT. Celular; para o tratamento de controle, adicionar clorofórmio virgem) e deixe para secar. Repita em pratos de cultura celular separado para replicações (pelo menos 3).
- Uma vez que ch-FE tem secado, dispense 99 µ l da mistura preparada tratamento aquosa com uma pipeta padrão em centro do VanT. célula e, em seguida, fechar todos os pratos de cultura de células. Uma vez que a mistura de tratamento aquoso tem entrar em contato com os tratamentos secos ch-FE, o bioensaio começou, após inoculação de 0 h.
- Uma vez que o fornecimento de todos os tratamentos e repetições, colocar todos os pratos de cultura de pilha (fechado) em um recipiente plástico selado (30 x 13 x 7 mm) e incube a 25° C, no escuro.
- Nos pontos de tempo pré-determinado, adicione 15 µ l de um fixador (lactophenol algodão-azul) para o VanT. célula e deixe descansar pelo menos 5 min garantir adequada mancha fúngica. Após esse tempo, Retire cuidadosamente o VanT. cela e siga os passos de aquisição inversão e dados lamela acima (medidas 7.5-7,6). Para análise de dados, siga os métodos descritos em 2015 Gager17, normalmente, exibindo dados como formação de apressório, qual é a proporção de conídios totais de apressórios contados na área observada (3,808 mm2).
9. amora baseada na fenologia extrações17
- Mão recolher flores de amora (em junho; 100 g), imaturos de fruta (duas vezes; Julho e agosto; 200 g) e amadurecer a fruta amora na colheita (outubro; 200 g), colocar em sacos de plástico de tamanhos adequado e refrigerar a 4 ° C, imediatamente após a colheita. Use as precauções de contaminação descritas acima (passo 2.1).
Nota: Haverá material extra planta coletada em cada momento, mas estes montantes precaver-se contra a extração de ovários infectados obviamente fúngicos e frutas (mostrando os sinais e sintomas da doença). - Antes da extracção, remover qualquer flores deterioradas, danificados, doentes, em seguida, usando flores só saudáveis, remover as sépalas, pedúnculos, corolas, estigmas, estilos e estames com pinça curvada (pinça de 45 °) e descartar tudo, mas os ovários. Uma vez que os ovários são coletados, realizar a extração baseado em clorofórmio em um 1 wt: 9 relação de vol (detalhados em etapas 4.2-4.4, usando apenas os ovários). Armazenar as amostras até que todas as outras extrações são completas, ou seja, até a condutância de bioensaio.
- Uma vez que os frutos são coletados, realizar uma extração baseado em clorofórmio (passos 4.2-4.4, usando frutas coletadas em vez de flores), mas adicionem 10 g de fruta para 90 mL de clorofórmio e uma vez extraído, deixe a solução evaporar a 9 mL (resultando em um peso de 9 mL 10 g: : solução vol).
- Fazer extrações de frutas imediatamente após a coleta em julho, agosto e outubro. Armazenar conforme acima (passo 4.4) até que todas as extracções são coletadas. Após a última extração de frutas baseado em clorofórmio, sujeitar todos os extractos de clorofórmio baseada no direito penal coletados para este ensaio para o bioensaio baseado em clorofórmio e analisar adequadamente (etapas 8.1-8,6).
Representative Results
Os resultados apresentados aqui são alguns exemplos dos muitos ensaios que podem ser executados usando esta metodologia. Figura 1 é um guia ilustrado para o bioensaio de FE à base de água e é complementada pela Figura 2 , que dá seguimento para o bioensaio de FE baseado em clorofórmio. A Figura 3 fornece um guia visual para o que pode ser esperado após a avaliação microscópica de c. fioriniae a 24 h, em ambos os bioensaios e clorofórmio-à base de água (em comparação com controles SDW). Figura 4 detalha um estudo do tempo-curso de 24 h com c. fioriniae na presença da variedade de uva 'Stevens' ch-FE e dá uma referência visual para um resultado de importação desta pesquisa: FE diminuiu o tempo necessário para formar estruturas de infecção comparado a SDW. Figura 5 fornece um exemplo de dados coletados de um bioensaio de lamela usando o escoamento de águas pluviais floral amora (CB "Flor" rw-FE). A Figura 6 representa outro importante resultado: ovário floral ch-FE era muito mais estimulante do que fruta ch-FE, indicando a importância da flor do ciclo de vida de c. fioriniae. As fotos suplementares e filmes fornecem importantes elementos visuais das flores utilizadas nas extrações e a água da chuva floral coleção dispositivos/implantação, além de filmes que Visualizar o ativo e passivo - extração ( processos à base de água).
Figura 1 : Visão geral da base de água floral extrair bioensaio (FE). Este ensaio foi utilizado para extratos florais à base de água com flores tanto mirtilo e amora: active -floral extrai (ativo-FE), passivo -floral extrai (passe-FE) e escoamento de águas pluviais floral (rw-FE). A - FE parte normalmente constitui o fator experimental/variável. Por outro lado a - FE parte pode permanecer constante e inoculação pós de tempo horas/pontos pode ser avaliada. Tornou-se preferência para análise de campo 4 ampliação de X 200. Abreviaturas: Estéril deionizada, SDW; Área por campo de visão, A. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Visão geral da base de clorofórmio floral extrair bioensaio (ch-FE). Este ensaio foi utilizado para tanto mirtilo e cranberry (fruta e flores, ovários). Apenas um tipo de mistura de tratamento aquoso foi usado neste ensaio, 1 suspensão de esporos de parte para 2 partes SDW (para manter a concentração conidiais consistente devido a evaporação de ch-FE). Este ensaio pode ser usado para comparar vários ch-FE (ceras de várias superfícies de planta), ou Múltiplo tempo pontos/horas após inoculação usando um único ch-FE. Abreviaturas: Estéril deionizada, SDW; Células de Van Tieghem [vidro], VanT. célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Comparação visual de Colletotrichum fioriniae na presença de FE à base de água e FE-ch. No mirtilo ensaio 'Bluecrop' (ativo-FE, à base de água) (isolar fungo: BB #10) e amora 'Stevens' baseado em clorofórmio (ch-FE) (isolar fungo: CB-PMAP182) extratos florais foram comparados aos controles SDW. Um aumento dramático na conidiation secundária (anéis) e formação de apressório (setas) foram observados quando comparando conídios na presença de SDW (controle) (A) ativo-FE (B) no pós-inoculação de 24 h. No entanto, conidiation secundário não era tão evidente quando se compara o clorofórmio bioensaio SDW controle (C) ch-FE (D); em vez disso, c. fioriniae crescimento para formação de appressorial. Mostrada é uma resposta comum para cada tipo de extração, à base de água e baseado em clorofórmio, independentemente do anfitrião/floral espécies descritas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Estudo do tempo-curso (24 h) com Colletotrichum fioriniae na presença de FE-ch. Neste ensaio, um controle SDW (A-D) e amora 'Stevens' ch-FE (E-F) foram inspecionados visualmente em 0, 6, 12 e 24 h após inoculação (um exemplo de pontos de tempo variável em vez de comparar vários FE). Formação de apressório (setas) começou às 6h em ch-FE e aumentou ao longo de pontos de tempo subsequente. Este resultados escapa ao fator importante da biologia do patógeno durante o período da flor: flores reduzem o tempo necessário para formar estruturas de infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Exibição gráfica de dados coletados usando rw-FE em um bioensaio. Águas pluviais executado fora flores amoras (CB "Flor" rw-FE) e águas pluviais virgem que não tinham tocado qualquer tecidos de planta amora (rw-FE "Chão") de um único evento-umectante, mais um padrão ativo, à base de água floral extracto de airela (CB ativo -FE) (controle positivo) e SDW (controle negativo) foram submetidos a um bioensaio lamela à base de água e avaliados para o crescimento de c. fioriniae . CB "Flor" rw-FE tinha o mesmo nível de formação secundária de conidiation e apressório como o padrão CB ativo-FE na inoculação após 24 h, indicando que os dispositivos de coleta foram eficazes na captura de estimulantes florais lançados durante um umectantes-evento. Conídios totais é composto de primária (depositado), conídios e recém-formado conídios secundários. Letras indicam diferenças significativas no p < 0,05 de acordo com menos diferença Fischer significativa teste (LSD); conídios em maiusculas, totais; minúsculos, apressórios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Fenologia cranberry baseado ch-FE bioensaio, inspeção visual. Gestão de doença para a fruta apodrecer fungos frequentemente envolve aplicações de fungicida de tempo de florescer. Aqui, extratos de baseado em clorofórmio amoras (ch-FE) de vários estágios de crescimento de cranberry ('Stevens') visualmente foram avaliados para o efeito de superfície ceras em c. fioriniae no pós-inoculação de 24 h. Ovários, coletados em junho (A), frutos imaturos coletados em julho e agosto (B, C), coletados de fruta colhida em outubro (D)e um controle SDW (E) foram inspecionadas para formação de appressorial (setas). Ovário ch-FE tinha a maior magnitude da formação appressorial, indicando que esta fenologia da planta (flor) é criticamente importante para o ciclo de vida de c. fioriniae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: inflorescência de mirtilo. Flores de mirtilo foram coletadas para extrações durante plena floração (abril-maio, em Nova Jersey, EUA) (mostradas 'Bluecrop'). Observe a sobreposição de corolas/ovários de flores adjacentes e a arquitetura geral da inflorescência comparada ao suplementar a Figura 2 (airela na vertical). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 2: Cranberry eretas. Flores de amora foram coletadas para extrações durante plena floração (junho-julho, em Nova Jersey, EUA) (mostradas 'Stevens'). Note-se a estágios variados flor em uma inflorescência amora única (vertical) e o gancho, gotículas de água, mantendo a forma do corolla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 3: implantação de águas pluviais de mirtilo (flor). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral mirtilo, colocado diretamente sob um cluster de inflorescências. Observe o arame revestido de plástico usado para orientar verticalmente o dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 4: implantação de águas pluviais de mirtilo (tronco). Dispositivo de recolha em águas pluviais floral mirtilo concluído, colocado a meio caminho para baixo a haste entre uma inflorescência e a coroa da sarça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 5: implantação de águas pluviais de mirtilo (coroa). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral de mirtilo, colocado na base da sarça (coroa). Nota de fios revestidos plásticos podem ser removidos se não for necessário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 6: implantação de águas pluviais de mirtilo (terra). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais virgem, colocado adjacente de arbustos de mirtilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 7: implantação de Cranberry da água da chuva (close-up). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral amora, com 2 colunas enfiadas sob os laços do fio ordenadamente cruzados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 8: implantação de águas pluviais Cranberry. Múltiplos completaram dispositivos amora floral da água da chuva, implantados em um pântano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar 1 filme: extratos florais ativos, à base de água (ativo -FE). Suporte de vídeo suplementar as seguintes etapas 2.3-2.5.1. Mirtilo 'Bluecrop' as flores foram usadas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Suplementar Movie 2: passiva, extratos florais à base de água (passe-FE). Suporte de vídeo suplementar seguinte etapas 3.3-3.4. Mirtilo 'Bluecrop' as flores foram usadas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Suplementar Movie 3: implantação de dispositivos de captação de águas pluviais floral amora. Suporte de vídeo suplementar seguindo passo 6.4. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Discussion
Os bioensaios para detectar a resposta c. fioriniae de extractos florais (FEs) foram desenvolvidos para a fruta mirtilo e cranberry podridão pathosystems mas podem ser facilmente adaptados a outras culturas hortícolas. O protocolo detalhado acima tem sido valiosa na aquisição de muitas importantes conjuntos de dados incluindo, mas não se limitando a: efeitos de FE em múltiplos isolados de inúmeros patógenos, tempo-curso informações referentes às fases de crescimento dos fungos na presença de vários FEs, comparação de técnicas de extração, inspeção de produtos químicos individuais na fioriniae c. crescimento e diferenciação, avaliação de órgão individual flor extrai, efeitos da temperatura na c. fioriniae , enquanto na presença de FE, efeitos de extrações de cera dependente de fenologia e efeitos florais da água da chuva. Através da utilização destas técnicas, dados gerados também deu uma compreensão muito mais clara de c. fioriniae vida dos estágios e parcialmente elucida porque o período de flor é tão crítico para o controle de muitas frutas apodrecendo patógenos.
Inicialmente, todas as flores foram processadas de forma idêntica para o ativo-FE, mas o processo de extração, mudou-se para a utilização de flores toda. Floral dissecção era demorada e teve muito pouco efeito sobre a bioatividade de FEs o resultante. No entanto, os órgãos florais individuais pode e tem sido avaliado usando este protocolo, mas muito cuidado deve ser tomado para não completamente macerar os tecidos florais (suplementar 1 filmecom precauções detalhadas no passo 2.3), como isto pode resultar em lançado compostos de fungos tóxicos/estático para o FE que poderia distorcer as avaliações microscópicas. Menos invasivas extrações como pass -FE (Supplemental Movie 2) e rw-FE são agora mais favoráveis devido a sua facilidade de aquisição. Além disso, essas técnicas de extração requerem apenas vácuo filtração para adquirir sugestões químicas florais biologicamente ativas.
As flores utilizadas em todas as extrações foram tipicamente refrigeradas para 0-3 dias antes da preparação do extrato. Um desafio do presente protocolo é de gerenciamento de tempo do volume de negócios FE (coleção campo através do armazenamento dos extratos). Isso foi agravado por numerosas amostras de várias fontes e datas. Flores congeladas não foram avaliadas de forma real, como descongeladas flores aparecem deterioradas e descoloridos. No entanto, uma vez que o FEs à base de água foram preparadas, repetidos de congelamento e descongelamento não tem mostrado nenhum efeito a bioatividade de fé, então contanto que o FE rapidamente são recongelados após preparação de bioensaio (FE viável para 3 ano de idade).
Extração baseado em clorofórmio permite a investigação de respostas do patógeno para ceras de superfície tridimensional floral/frutas em um plano bidimensional, através da evaporação do ch-FE em lamelas de vidro. No entanto, é improvável que o reais estruturas cristalinas das ceras depositadas de ch-FE são idênticas à superfície da qual foram recolhidos. Significado às técnicas suplementares devem ser implementadas se resposta fúngica a cera específica estruturas na vivo é o foco principal de investigação. Baseado em clorofórmio extrai precisa de manutenção de armazenamento mais do que as extrações à base de água. Além de manter o ch-FE extratos no escuro, a cultura de células PTFE revestida tubo tampões e parafilm envoltório precisam ser verificadas regularmente para detectar possíveis vazamentos por evaporação de vedação e substituído, se necessário.
O conceito de escoamento de águas pluviais floral de monitoramento está enraizado na ideia de promover ferramentas de monitoramento de sites específicos da doença. Os dispositivos de captação de água da chuva podem ser adaptados para muitas outras arquiteturas de planta, desde que o dispositivo de recolha capta água da chuva que tem executado fora flores. Essa abordagem fornece informações sobre ou não estímulo floral está presente no campo em um determinado momento e pode ser monitorado ao longo da temporada. Alternativamente, dispositivos de coleta podem ser implantados em vários locais do dossel para determinar até onde sugestões florais foram lavadas durante qualquer dado umectante-evento. No futuro, experiências, rw-FE ditarão quando aplicações de fungicida devem começar e quando eles podem acabar com segurança. Além disso, através da monitorização extrações de cera dependente de fenologia (protocolo seção 9), a importância do período de flor à biologia do patógeno tornou-se ainda mais evidente. Essa seção também foi incluída para demonstrar a flexibilidade destes bioensaios, fornecendo métodos que permitem a comparação lado a lado das ceras de superfície de anfitrião que são temporalmente separados. Os dados gerados usando as técnicas de extração floral e bioensaios representam indicadores tangíveis da estimulação do patógeno, classes químicas específicas importantes à biologia do patógeno e alvos de estratégias de controle futuro.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a William S. Haines, fundo de pesquisa dotado de Cranberry Sr. e a New Jersey Blueberry e Cranberry Research Council, Inc. para suporte. Agradecemos também a Jennifer Vaiciunas (orientação e preparações florais), Christine Constantelos (cultura fúngica e preparações florais), David Jones (preparações florais e extrações), Langley Oudemans (preparações florais, filmagem/fotografia), Jesse Lynch (preparações florais), Roxanne Tumnalis (apoio geral) e inúmeros estagiários de estudante/verão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
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