Summary
Burada, BİYOANALİZLER bir mantar patojen, Colletotrichum fioriniae, yaban mersini yoksa yabanmersini çiçek özleri cam coverslips Tarih huzurunda gelişimini izlemek için tasarlanmıştır açıklanmıştır. Su - kloroform-, dayanarak ve alan yağmur suyu - çiçek çıkarma teknikleri bu bilgileri uygulanabilir nasıl fikir yanı sıra ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Çiçeklenme dönemi fenoloji ve çiçek kimyasal yardımlar üzerinde mantar meyve patojenler çürüyen zamansal dinamiği doğru bir şekilde izlemek için çiçek çıkarma yöntemleri ve coverslip BİYOANALİZLER Colletotrichum fioriniaekullanarak geliştirilmiştir. Yaban mersini ve kızılcık, bu patojen nedeniyle enfeksiyon, ilk evrelerinde rol çiçek çiçeklenme döneminde mantar ilaçları uygulayarak en uygun şekilde denetlenir. Burada ayrıntılı protokolünü açıklar nasıl çiçek özleri (FE) karşılık gelen cam coverslip BİYOANALİZLER daha sonra kullanmak için su, kloroform ve alan yağmur suyu tabanlı yöntemleri kullanarak elde edilmiştir. Farklı bilgi sağlamak için her FE hizmet: C. fioriniae yanıt seferber çiçek kimyasal için ipuçları su (su bazlı), çiçek ve meyve yüzey mumlar (kloroform tabanlı) ve alan bazlı izlenmesi patojen yanıt vitro gözlemler bir tarım ayarı için hareketli çiçek yağmur suyu, toplanan. FE geniş ya su veya kloroform tabanlı olarak, uygun bir bioassay telafi etmek için bu iki malzeme arasında içsel farklılıklar açıklanan ile tanımlanır. Çiçek çalıştırmak vardı yağmur suyu içinde benzersiz aygıt her ürün için toplanan esneklik ve uygulama diğer ürün sistemleri için bu yaklaşımın ima. BİYOANALİZLER hızlı, ucuz, basit ve uyarıcı Çiçek bileşikleri varlığı hakkında kronolojik zamanmekansal ve siteye özgü bilgileri çeşitli kaynaklardan oluşturma yeteneği sağlar. FE azaltmak gibi enfeksiyon gerçekleşmesi gereken süreyi bu bilgileri sonuçta daha iyi hastalık yönetimi stratejileri, böylece içine büyüyen sezon boyunca patojen enfeksiyon riskleri değişen bilgiler sağlayan bilgi verecektir.
Introduction
Colletotrichum fioriniae bir meyve çürüklüğü Highbush yaban mersini (Vaccinium corymbosum L.) ve büyük Amerikan kızılcık (macrocarpon V. Aiton)1,2neden olur. Bu patojen son zamanlarda C. acutatum tür karmaşık3,4,5,6 belirlendi ve yaban mersini Antraknoz nedensel bir ajan ve kızılcık meyve çürüklüğü üyesi karmaşık, yanı sıra çok sayıda diğer bitki hastalıkları dünya çapında7neden. C. fioriniae bir gizli, hemibiotrophic yaşam tarzı8, meyve olgunlaşma9son aşamasında kadar belirgin hale değil bloom ve belirti geliştirme sırasında ortaya çıkan enfeksiyonlar ile vardır. Yaban mersini ve yaban mersini meyve çürüklüğü sadece yeterince çiçeklenme döneminde yapılmış mantar ilacı uygulamaları ile kontrol edilir. Patojen uyuyan yaban mersini çiçek tomurcuk ölçekler10 ' overwinters ve çiçeklenme sırasında sporulates. Conidia gölgelik via yağmur-splash dağılma11,12 taşınır ve inoculum birikimi güçlü çiçeklenme dönemi13ile ilişkili. Çiçek narenciye yazı bloom meyve bileşenleri (PFD)14 yanı sıra çilek Antraknoz15, neden her iki durumda da bırak önemli olduğu gibi ana çiçek Colletotrichum türlerin yanıt Vacciniumiçin benzersiz değil sporulate patojen. Tüm bu durumlarda çiçek kimyasal yardımlar C. fioriniae ve çiçeklenme sırasında enfekte diğer patojenleri üzerinde zamansal dinamiği değerlendirmek etkili yöntemler ihtiyacını vurgulamak. Burada açıklanan yöntemler tarafından sağlanan anlayışlar giderek daha değerli hale gelmektedir.
Bu iletişim kuralı çiçek özü (FE) satın alma yöntemleri detayları ve FE C. fioriniae yanıt değerlendirilmesi via cam coverslip BİYOANALİZLER15,16kılavuzları. Çiçek çıkarma teknikleri iki ana tipe ayrılır; su bazlı çekimi (etkin-FE, pasif (pass -FE) ve alan yağmur suyu tabanlı (rw-FE)) ve kloroform tabanlı (ch-FE)17 çekimi. Su bazlı çekimi seferber su çiçek kimyasal cues incelenmesi için izin. FE, büyük ölçüde enfeksiyon enfeksiyon gerçekleşmesi gerekli nem sağlayan ek16, hızını artırır bu yana seferber bu ipuçları büyük olasılıkla önemli enfeksiyon mahkemenin bileşenleridir. Ayrıca, temsil ettikleri çiçek stimülasyon-ebilmek var olmak yıkamak gölgelik ıslatma-olaylar daha önce gözlenen yaban mersini ve diğer kırpma sistemleri14,16olarak sırasında gibi daha doğal bir durum. Çiçek çekimi (ch-FE) kloroform tabanlı bir sağlamak aynı zamanda değerli bilgileri patojen yanıt-e doğru ev sahibi yüzey17,18conidia bir kez duyarlı üzerine yatırılır erken büyüme dönemlerinde elucidating, mumlar Ana organlar (Yani çiçekler, yumurtalıklar ve gelişmekte olan meyve). Patojen yanıt-e doğru ev sahibi yüzey Vakslar mevsimsel değişimler de bu iletişim kuralını kullanan izlenebilir. Buna göre BİYOANALİZLER su bazlı FE veya kloroform tabanlı FE bu iki malzeme arasında içsel farklılıklar azaltmak için olan çalışma için düzenlenmiştir.
Su bazlı çekimi ikincil conidiation yüksek düzeyde kloroform tabanlı çekimi daha uyarmak BİYOANALİZLER oluşturulan verilerin ortaya olduğu yere kesin appressorial yanıt, bu nedenle birden çok bileşikleri göstermek için FE mevcut. İlginçtir, bu büyüme yanıt-e doğru her ikisi de ne zaman birden fazla uyarıcı bileşikler gösteren yaban mersini ve kızılcık çiçek kapalı çalıştırmak vardı yağmur suyu kullanarak çiçek yüzeyinden yıkanabilir tespit edildi. Böylece, çiçek uyarılması için izleme patojen başarı bir tarım sisteminde görmemizi sağlar.
Bu iletişim kuralı, nihai hedefi mantar bitki patojenleri çiçek kimyasal ipuçlarını yanıt getirici temel biyolojik bilgi için bir metodoloji yanı sıra yardım çiçek bu bilgi-ebilmek kullanmak Başlatan metodolojileri sağlamaktır siteye özel hastalık yönetimi ve karar alma süreçleri.
Protocol
1. mantar yalıtır ve spor süspansiyonlar
- Colletotrichum fioriniae doğal enfekte konak19yalıtmak. O zaman, temiz kültürler Mısır yemek agar (CMA) yatık depolar. Fiş üzerine standart plastik hücre kültür çanak (9 cm Çap) ya V8 suyu agar (cV8A) (Miller 1955 değiştirilmiş) veya sigara açıklık V8 suyu agar (V8A)20açıklık içeren bir kültür (dan CMA eğik) yerleştirin. Koloniler sporulate başlar, conidia (turuncu conidial kütlesi) başka bir cV8A veya V8A çizgi bir yüksek yoğunluklu sporulating kültür üretmek için hücre kültür çanak (ile standart bir kısır döngü) içeren.
Not: Mantarlar ile herhangi bir iletişim kuralı merdiven mantar kültürleri ve/veya BİYOANALİZLER kirletici olasılığını azaltmak için Laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. - Sonra büyüme, standart bir kısır döngü kullanarak 7 gün (hafifçe döngü conidial kitle için dokunarak) yüksek yoğunluklu kültüründen conidia az miktarda toplamak ve bu 10 mL steril deiyonize su (SDW) içeren bir 15 mL santrifüj tüpüne karıştırın. Girdap 10 için bu örnek s, daha sonra standart bir pipet kullanarak Dalma yukarı ve aşağı birçok kere daha da karıştırmak için örnek.
- Sonra bir damla vortexed örnek hemasitometre üzerine yerleştirin ve spor konsantrasyonları tahmin ediyoruz. Hemasitometre sayısı 5-10 alanların ortalama almak ve ortalama uygun seyreltme faktörü tarafından (Yani 10.000), çarpma böylece mL SDW başına conidial konsantrasyonu elde etmek.
- Bir birim (V) için / konsantrasyon (C) denklemi (V1● [C1] V2● [C2] =) (SDW) 1.0 X 105 conidia SDW mL 5 mL son hacim ile başı için ayarlayın. Bu, spor süspansiyon adlandırılır ve yalnızca her iki bioassay kullanmak için hemen önce yapılır.
2. aktif, su bazlı çiçek özleri (etkin -FE)15,16
Not: Bkz: tamamlayıcı şekil 1, tamamlayıcı Şekil 2, tamamlayıcı şekil 3ve tamamlayıcı film 1.
- Dikkatle el-blueberry (Nisan-Mayıs) ve kızılcık (Haziran-Temmuz) çiçekler (tamamlayıcı şekil 1) alanında onların anılan sıraya göre en yüksek blooms sırasında ödemeli. Giyim ve nitril eldiven yanı sıra insan derisi yağ kirlenme inhibe kirlenme çiçek çeşitleri arasında çapraz için örnekleme konum (çeşitlerin/çeşitleri/fiziksel konumlar) arasında değiştirmek. Yaban mersini veya kızılcık çiçek (tek bir kaynaktan) (100 x 150 mm çantayı Doldur) plastik torbalar yerleştirin ve çiçekleri toplanan bir kez 4 ° C'de hemen buzdolabına.
Not: Etkin - ekstraksiyon Leandro ve arkdeğiştirilir. (2003) 16. - Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek kaldırın ve sonra sağlıklı çiçek kullanarak eğri forseps (45˚ cımbız) ile yumurtalık, sepals ve peduncles kaldırmak ve atmak. Sadece kalan organları (corolla, stigma, stil ve ercik) aktif - çekimi için kullanın. Tülbent (150 x 150 mm) kesip bir 7 x 7 mm huni içinde yer, bir temiz 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve bir kenara koyun.
- 1 birleştirmek bölümü işlenen 9 parça SDW çiçek (1 wt: 9 vol oranı) bir harç içinde. Yavaşça 30 bir havaneli ile eziyet s (tamamen örnekleri ezmek için göz kulak). Elde edilen hamuru hazır tülbent/huni strain ve santrifüj tüpü (50 mL) toplamak. Temiz ya da yeni harç/havaneli %95 alkol ile her çıkarma ve sıcak su arasında kullanın.
- Bir vakum filtrasyonu cihaz hazırlamak: Buchner huni, vakum filtre Erlenmeyer şişesi (en çok 1000 mL kapasiteli), 55 mm daire filtre kağıdı ve vakum hortumu/kaynak toplamak. Filtre kağıdı için uygun ölçekli Buchner huni ekleyin ve balonun yerleştirin sonra bir su cihazları bağlamak / kaynak yolu ile vakum hortumu emme ve bir kenara koyun.
- Daha fazla yaban mersini çiçek özleri 8,055 x g, 10 dk centrifuging tarafından açıklığa kavuşturmak. Süpernatant hazırlanan vakum filtre aparatı dökün, vakum kaynağında açmak, süpernatant filtre sonra şişeye içeriği yeni santrifüj tüpüne (50 mL) dökün. Tüm cihazlar bileşenler arasında her filtrasyon %95 alkol ve sıcak su temiz. Bir şırınga aracılığıyla daha fazla filtre uygulamak 0,22 µm gözenek boyutu, sterilizasyon, asetat filtre yeni santrifüj tüpü (50 mL) içine uyarlanmış.
- Kızılcık çiçek özleri için yalnızca filtre filtre kağıdı ile vakum ve şişesi içeriği yeni santrifüj tüpüne (50 mL) dökün.
- Elde edilen hazırlık için etkinolarak - çiçek özü (etkin -FE) denir. Tüm su bazlı çiçek özleri (aktif- pasif-, yağmur suyu koleksiyonları) 5-50 mL aliquots-20 ° c kadar deneysel kullanım saklayın. Birden çok örnekleri (örnek türü başına en az 3 çekimi) ile çekimi çoğaltır sağlamak için yineleyin.
3. pasif , su bazlı çiçek özleri ( geçmek -FE) 16
Not: Ek 2filme.
- Toplamak tüm yaban mersini çiçekler (50 g) Yukarıdaki gibi el ve topladıktan sonra buzdolabında bekletin. Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek sadece peduncles sağlam çiçek sökün ve. Aşağıda açıklanan pasif - emme sistemi, yer kadar hazır örnekleri buzdolabında bekletin.
- % 95 etanol (alkol) ve sıcak su ile (plastik kafes sayfası, iki plastik hasır sepet, cam ekmek pan ve pompa sis şişe) önlemek amacıyla kullanmadan tüm bileşenleri önce yıkayın. Ayrıca her ayıklama açıklandığı gibi yukarıda (Adım 2.2) ve kenara için 4 katman tülbent/huni/50 mL santrifüj tüpü hazırlayın.
- Elek hazırlamak: bir plastik kafes levha (aka Örtüleme bar açık) bir plastik hasır sepet (114 x 102 mm) içine yerleştirin. Baş aşağı bir ikinci, benzer, hasır sepet koyun (bir cam ekmek-(SDW içinde oturan çiçekler) önlemek için pan (127 x 229 mm) ve yer ters) mesh sac üstüne içeren sepet. Hazır çiçekler 50 g elek ekleyin.
Not: Alternatif olarak, küçük tüp [temizlik] sepetleri (eski, yeşil, çilek kafes pint sepetler genellikle kaynak zordur) başlangıçta kullanılan plastik hasır sepetleri yerine kullanılabilir. - Eşit olarak sis çiçeklerle bir pompa kullanarak 250 mL şişe mist ve akış cam ekmek tavada yakalamak. O zaman filtrate hazır tülbent/huni temiz santrifüj tüpüne süzün. Elde edilen hazırlık için pasif- çiçek özü (pass -FE); denir olarak başına (yukarıdaki adım 2.6) depolar.
- Tüm bileşenler arasında her çıkarma %95 alkol ve sıcak su temiz. Sağlamak için birden çok örnekleri ile tekrar çekimi (örnek türü başına en az 3) çoğaltır.
4. kloroform tabanlı çiçek özleri (ch-FE) 17
- (Adım 2.1) yukarıda olarak başına yaban mersini ve kızılcık çiçekleri toplamak ve çiçekler çıkarılması (Adım 2.2, tülbent/huni hazırlık yapmadan) için hazır olun. Hazır çiçekler kullanımı kadar önce buzdolabında tutun.
- Güvenlik nedeniyle bir duman başlıklı kloroform ile gerçekleşen herhangi bir çalışma yapılması gerekiyor. Bu malzemelerin hazırlanması içerir / Züccaciye Mağazaları, çıkarma işlemleri ve bioassay gürültülerinden (ch-FE kullanarak adımları).
- % 95 ile tüm bileşenleri temiz alkol iki kez, o zaman iki kez her çıkarılması için kontaminasyonu önlemek için kloroform ile: dişli cam kültür tüpleri, 2 cam şişeler, küçük paslanmaz çelik ekran ve [cam] lisansüstü silindir. Kuru baş aşağı için kenara koyun. 95 ile iki kez politetrafloroetilin (PTFE) kaplı kapaklar durulama % alkol sadece (kloroform kap dış malzemelerin hasar) ve kuruması için bir kenara koyun.
- 1 birleştirmek bölümü işlenen 9 parça kloroform çiçek (1 wt: 9 vol oranı) bir ölçek (sonra kloroform, yavaşça çiçekler) girdap 30 s ve zorlanma ikinci kabı içine bir paslanmaz çelik ekran aracılığıyla. CH-ikinci kabı FE'den cam kültür tüp (10-15 mL) içine dökün ve PTFE kap yapıştırmayın. Buharlaşma önlemek için parafilm kapaklı sarın.
- Bu hazırlık kloroform tabanlı çiçek özü (ch-FE) benzer. Örnek (hafif bozulma azaltmak için) 4 ° C'de karanlık kadar deneysel kullanım saklayın. Sağlamak için birden çok örnekleri ile tekrar çekimi (örnek türü başına en az 3) çoğaltır.
5. yağmur suyu Blueberry çiçekler (BB rw-FE)16 topluluğu
Not: Yaban mersini çiçek yağmur suyu toplama aygıt bir hava tabancası tek kullanımlık boya sprey Kupası konnektör adaptör'ü ile oluşur (Kupası: kadın iş parçacığı, adaptörü: erkek-erkek iplik), 50 mL santrifüj tüpleri (polipropilen), parafilm ve plastik kaplı teller () Standart telefon kablosu, bireysel iç tel strand içeriği).
- Yağmur suyu toplama aygıtları oluşturmadan önce çiçek kapalı çalıştırmak yakalamak için bir yaban mersini çalı içinde çoklu konumlarını seçin. Bunlar doğrudan altında çiçek (çiçek) için üsten Bush (taç) içerir. (1-5 cm arasında değişen) kaynaklanıyor bu seçili yerlerde kayıt çapı aygıt eki, aşağıda açıklanan için kullanılan delik boyutunu belirleyecektir.
- Seçilen her konum için bir koleksiyon aygıt oluşturabilirsiniz. İlk adım biraz bir matkap basın bağlı (doğru dişli açılış Kupası nerede eğrileri) bir sprey kupasına karşılık gelen kök çapı dibinde bir delik delme. Sonra çukuru üstünden düz bir çizgi ağız spreyi Kupası için kesti. 4 eşit uzaklıkta (plastik kaplı tel iş parçacığına büyüklükte), sprey Kupası ağzında delik ve bir ucu serbest bırakarak plastik kaplı tellerin bir ucunu takın.
- Boya püskürtme Kupası bağdaştırıcısı 50 mL santrifüj kap kapağı iplik kadar büyük delik. Bağdaştırıcı konu sızıntı önlemek için parafilm ile kapatın. Bu santrifüj kap ve püskürtücü Kupası dişli bölümü ekleyin. Şeklindeki 50 mL santrifüj tüpü takmak.
- Seçilen konumları, örnekleme konum başına 4 koleksiyonu cihazların en az göre birden çok aygıt oluşturmak için 5,3 5,4 adımları yineleyin.
- Seçilen konumları cihazlar kaynaklanıyor uyacak püskürtücü bardak esneme tarafından dağıtın. Sprey fincan yukarı doğru (çiçek geçen su yakalanır sigorta ettirmeleri) diğer kaynaklanıyor bağlı plastik kaplı teller kullanarak kesme tarafına gelecek şekilde yönlendirin. Parafilm yağmur suyu sızdırabilirsiniz herhangi bir açıklıklar yapıştırmayın. (Tamamlayıcı şekil 3, tamamlayıcı şekil 4, tamamlayıcı Şekil 5ve ek şekil 6).
- Etiket koleksiyonu tüpler dağıtımı ile tarih / saat. Bir yağmur olaydan sonra kaldırmak ve santrifüj tüpü alt (tüp) bölümünü değiştirin (etiket tarih / zaman koleksiyonu). İçinde (yaban mersini yağmur suyu çiçek özü (BB rw-FE) anılacaktır) ikinci tur koleksiyonlarını getirin ve filtre (filtrasyon açıklanan adımları 2.4-2.5) vakum. Deposu olarak (Adım 2.6), yukarıda bir su bazlı bioassay kullanana kadar.
6. yağmur suyu kızılcık çiçekler (CB rw-FE) üzerinden topluluğu
- Kızılcık çiçek yağmur suyu toplama cihazda bir 7 X 7 cm polipropilen huni, 50 mL santrifüj tüpleri (polipropilen), parafilm, oluşur ve büküm bağları (aygıt başına) 4 standart, plastik kaplı.
- İlk olarak, ısı 8 eşit uzaklıkta delik (twist kravat çapını) bir metal sonda kullanarak huni ağız çevresindeki delik. Twist Kravat 4 deliklere yerleştirin. Diğer uçları düzgün geçiş desen oluşturan bu delik ters konumuna, iliştirin. Huni aşağı-kök parafilm ile sarın ve bir kenara koyun.
- Adım biraz 50 mL santrifüj kap içine huni aşağı kök eklemek için büyük delik. Hazırlanan huni santrifüj kap yerleştirin. Birden çok aygıt, örnekleme konum başına 4 koleksiyonu cihazların en az oluşturmak için 6.2-6,3 adımları yineleyin.
- Etiketli (Tarih/Saat) aygıtları seçili kızılcık bataklıkları dağıtın. Düzgünce (diki da bilinir) iki çiçek taşıyan çiçeklenme çapraz plastik twist kravat altında tuck. Sonra dikey olarak cihaz santrifüj tüpü kızılcık tepeye (tamamlayıcı rakamlar 7-8, tamamlayıcı film 3) delici tarafından yönlendirmek.
- Yağış veya ek yük sulama sonra kaldırmak ve santrifüj tüpü alt (tüp) bölümünü değiştirin (etiket tarih / zaman koleksiyonu). İçinde (kızılcık yağmur suyu çiçek özü (CB rw-FE) anılacaktır) akış getirmek ve filtre (filtrasyon açıklanan adımları 2.4-2.5) vakum. Deposu olarak (Adım 2.6), yukarıda bir su bazlı bioassay kullanana kadar.
7. bioassay15,16 su dayalı çiçek özleri kullanarak (etkin-FE, pass-FE, rw-FE)
Not: Bkz. şekil 1.
- Bu bioassay bir Laminar akış mahallede hazırlanır. Malzemeleri hazırlamak: %95 alkol ve hava kuru, çift durulama cam coverslips bir kenara koymak. Kağıt havlu diskleri standart plastik hücre kültür yemekleri (9 cm) iç çapını kesti. 2 kat kağıt disklerin kültür yemekleri içinde yerleştirin ve 2 mL SDW ile ıslatın.
- En az 5 mL 1.0 X 10 mL SDW spor süspansiyon (C. fioriniae) olarak başına (Adım 1.2-1.4), yukarıda başına5 conidia bir kenara koyun hazırlamak. Daha sonra microcentrifuge tüpler SDW ve 2 mL su bazlı çiçek özü eşit miktarda karıştırın. Sonra spor süspansiyon, eşit bir birim hazır 2 mL microcentrifuge tüpler (SDW artı FE); ekleme elde edilen hazırlık bir sulu tedavi karışımı adlandırılır. Denetimin, FE bölümü atlayın ve conidial konsantrasyonları tutarlı tutmak için SDW ile değiştirin.
Not: porsiyon büyüklüğü çoğaltır ve zaman-puan sayısına bağlıdır. Tipik olarak, bazı bölümleri 500 µL fazla olamaz. Bir kez conidia ve FE kombine bioassay başladı, 0 h sonrası aşılama. - Önceden temizlenmiş cam coverslips batırılmış kağıt havlu üzerine hücre kültür tabak içinde yerleştirin. 40 µL damlacık sulu tedavi karışımı bir coverslip merkezine yerleştirin. Hücre kültür çanak yakın, denetimi de dahil olmak üzere istenilen tedavi için yineleyin. Ayrı hücre kültür yemekleri çoğaltmalar (en az 3) ve zaman puan (her yemeğin 1 saat için noktasıdır) için yineleyin. Bir kez tüm tedaviler ve çoğaltır reçete, tüm çoğaltılmış hücre kültür yemekler mühürlü plastik kap (30 x 13 x 7 mm) yerleştirin ve 25 ° c karanlıkta kuluçkaya.
- Önceden belirlenen zaman-noktalarda, lactophenol pamuk-mavi (20.0 g fenol kristalleri, 20.0 mL % 2.5 laktik asit, 40.0 mL gliserol, 0,05 g pamuk mavi) gibi bir sabitleştirici 10 µL büyüme durdurma damlacıkları için eklemek ve yarı konserve mount.
- 2 h 0 h saat noktası olarak bu cam yüzeye conidial yapışma sağlar ancak conidial çimlenme için uzun değildir toplamak için bekleyin. Diğer tüm zaman puan için karşılık gelen sabitleştirici ekleyebilirsiniz.
- Bir sabitleştirici eklendikten sonra dikkatle onları damlacık yan aşağı mikroskobik inceleme (slayt başına 1 coverslip) kolaylaştırmak için cam mikroskop slayda yerleştirerek coverslips, tersine çevirin. Tüm coverslips cam mikroskop slaytlar üzerinde olduğunda, altlık yerleşmek ve kısmen kuru akışı başlıklı 20 dk için.
- Tüm conidia (Toplam conidia) yanı sıra appressoria de 400 X büyütme (16 alanları hariç) veya 200 X (4 alanları hariç), coverslip (birincil conidia, germinated conidia ve yeni kurulan ikincil conidia) mevcut sayısı 3.808 mm bir alan toplam alma 2. çoğaltmak istatistiksel analiz için tüm bioassay. Su bazlı FE kullanarak deneyleri için Waller ve ark. içinde açıklandığı gibi veri analiz genellikle görüntülenen olarak ortalama sayısı/mm2 (Toplam conidia veya appressoria) 201716.
8. bioassay17 çiçek özleri (ch-FE) kloroform tabanlı kullanma
Not: Şekil 2bakın.
- Malzemeleri hazırlamak ve kültür yemekleri olarak başı yukarıda (merdiven 7.1) hücre. Ayrıca, coverslips, bir duman başlık içinde cam pipet (1 mL 1 µl artışlarla) olarak (8 mm OD, 6 mm ID) Van Tieghem hücreler (VanT. hücreleri) eşit sayıda durulama (iki kez ile % 95 alkol sonra kloroform ile iki kez) ve bir kenara koyun.
- Laminar akış Hood, 2 mL microcentrifuge tüp kullanarak iki eşit birim SDW (en az 500 µL bölümleri) ve 1 spor süspansiyon hacmi ekleyin, sonra bir kenara koyun. Ch-FE BİYOANALİZLER sulu tedavi karışımı bu.
- Bir duman başlık, bir VanT yerleştirin. hazır plastik hücre kültür çanak içinde bir cam coverslip hücreye. (Cam pipet ile) istenen ch-Fe 33 µL Van T. hücrenin merkezine dağıtmak (VanT duvarlara dokunma. Hücre; Denetim tedavisi için bakire kloroform Ekle) ve kurumasını bekleyin. Ayrı hücre kültür yemekleri çoğaltmalar (en az 3) için yineleyin.
- Bir kez standart bir pipet ile hazırlanan sulu tedavi karışımı 99 µL VanT merkezine dağıtmak kurutulmuş, CH-FE vardır. hücre, sonra yakın tüm kültür yemekleri hücre. Bir kez sulu tedavi karışımı kurutulmuş ch-FE tedaviler ile temas geldi, bioassay başladı, 0 h sonrası aşılama.
- Bir kez tüm tedaviler ve çoğaltır reçete, tüm (kapalı) hücre kültür yemekler mühürlü plastik kap (30 x 13 x 7 mm) yerleştirin ve 25 ° c karanlıkta kuluçkaya.
- Önceden belirlenen zaman-noktalarda, bir sabitleştirici (lactophenol pamuk-mavi) 15 µL VanT için ekleyin. hücre ve yeterli mantar boyama sigortalamak en az 5 min için oturmak izin. Bu saatten sonra VanT dikkatli bir şekilde çıkarın. hücre ve (adım 7.5-7,6) Yukarıdaki coverslip inversiyon ve veri alma adımları izleyin. Veri analizi için Gager 201517(3.808 mm2) gözlenen alanında sayılan appressoria için toplam conidia oranı olan appressorium oluşumuolarak, genellikle veri görüntüleme, açıklanan yöntemleri uygulayın.
9. kızılcık fenoloji tabanlı çekimi17
- El kızılcık çiçek toplamak (Haziran; 100 g), olgunlaşmamış meyve (iki kez; Temmuz ve Ağustos; 200 g) ve olgun kızılcık meyve hasat (Ekim; 200 g), uygun ölçekli plastik torbalar içine yerleştirin ve 4 ° C'de hemen toplandıktan sonra buzdolabında bekletin. (Yukarıdaki adım 2.1) özetlenen kirlenme önlemleri kullanın.
Not: Her zaman toplanan ilave bitki materyali olacak ama bu tutarları belli ki mantar virüslü yumurtalıklar ve (belirtiler ve hastalığın belirtileri gösteren) meyve ayıklama karşı korumak. - Önce çıkarımı, bozulan, hasarlı, hastalıklı çiçek kaldırın ve sonra sadece sağlıklı çiçek kullanarak, sepals, peduncles, corollas, Tepecik, stilleri ve stamens eğri forseps (45 ° cımbız) ile kaldırmak ve tüm yumurtalık atın. Sonra yumurtalık toplanır, bir 1 kloroform tabanlı ayıklama gerçekleştirmek wt: 9 vol oranı (yalnızca yumurtalık kullanarak adımları 4.2-4.4, ayrıntılı). Saklamak örnekleri diğer çekimi tamamlanana kadar Yani bioassay gürültülerinden kadar.
- Meyve toplanan, kloroform tabanlı ayıklama (Adım 4.2-4.4,), toplanan meyve çiçek yerine kullanarak yapmak ama kloroform için 90 mL 10 g meyve ekleyin ve kez kez çözüm 9 ml (10 g 9 mL wt sonuçlanan buharlaşır için bekleyin : vol çözüm).
- Meyve çekimi hemen Temmuz, Ağustos ve Ekim aylarında topladıktan sonra olun. Olarak başına kadar tüm çekimi toplanır (yukarıdaki adım 4.4) depolar. Son kloroform tabanlı meyve ayıklama sonra bu tahlil için kloroform tabanlı bioassay için toplanan tüm penoloji tabanlı kloroform özleri konu ve buna göre analiz (8.1-8,6 adımlar).
Representative Results
Sonuçları burada sunulan bu metodoloji kullanarak gerçekleştirilen birçok deneyleri birkaç örnektir. Şekil 1 su bazlı FE bioassay resimli bir kılavuzdur ve kloroform tabanlı FE bioassay izleyen Şekil 2 desteklenmiştir. Şekil 3 ne C. fioriniae mikroskobik değerlendirilmesi, 24 h, her iki su ve kloroform tabanlı BİYOANALİZLER (göre SDW denetimleri) üzerine beklenebilir için görsel bir kılavuz sağlar. Şekil 4 kızılcık çeşitli 'Stevens' ch-FE huzurunda C. fioriniae ile 24 h saat ders çalışma detayları ve bu araştırma bir alma sonucu için görsel referans verir: FE azalmıştır zaman formu enfeksiyon yapıları için gerekli SDW için karşılaştırıldı. Şekil 5 kızılcık çiçek yağmur suyu akış (CB "Çiçek" rw-FE) kullanarak bir coverslip bioassay toplanan verileri gösteren bir örnek sağlar. Şekil 6 temsil eden başka bir önemli sonuç: çiçek yumurtalık ch-FE meyve ch-FE, çiçekler yaşam döngüsü içinde önemini gösteren daha çok daha uyarıcı C. fioriniae. Ek fotoğraf ve film çekimi ve çiçek yağmur suyu toplama cihazlar/dağıtım, görselleştirmek aktif - ve pasif - ayıklama (film ek olarak kullanılan çiçek önemli görsel sağlamak su bazlı) süreçleri.
Resim 1 : Genel su bazlı bir çiçek özü (FE) bioassay. Bu tahlil su bazlı çiçek özleri ile yaban mersini ve kızılcık çiçekler için kullanılmıştır: etkin -çiçek özleri (etkin-FE), pasif -çiçek özleri (geçmek-FE) ve çiçek yağmur suyu akış (rw-FE). - FE bölümü deneysel/değişken faktör genellikle kabul ettiğiniz anlamına gelir. Diğer taraftan - FE bölümü sabit kalır ve zaman Puan/saat sonrası aşılama değerlendirilir. Tercih doğru 200 X büyütme, 4 alan analizi yapılmıştır. Kısaltmalar: Steril deiyonize su, SDW; Alan başına görüş alanı, A. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Genel kloroform tabanlı bir çiçek özü (ch-FE) bioassay. Bu tahlil yaban mersini ve kızılcık (çiçek, yumurtalıklar ve meyve) için kullanılmıştır. Tek tip bir sulu tedavi karışımı bu tahlil, 1 Bölüm spor süspansiyon (conidial konsantrasyonu ch-FE buharlaşma nedeniyle tutarlı tutmak için) 2 parça SDW için kullanıldı. Bu tahlil birden fazla ch-FE (balmumu çeşitli bitki yüzeyler) veya birden çok kez Puan/saat sonrası aşılama tek bir ch-FE kullanarak karşılaştırmak için kullanılabilir. Kısaltmalar: Steril deiyonize su, SDW; Van Tieghem [cam] hücre VanT. hücre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Görsel Colletotrichum fioriniae su bazlı FE ve ch-FE karşılaştırılması. Bu tahlil blueberry 'Bluecrop' içinde (etkin-FE, su bazlı) (mantar izole: BB #10) ve kızılcık 'Stevens' kloroform tabanlı (ch-FE) (mantar izole: CB-PMAP182) çiçek özleri SDW denetimlere karşılaştırıldığında. Conidia SDW (kontrol) (A) etkinhuzurunda karşılaştırırken ikincil conidiation (yüzük) ve appressorium oluşumu (ok uçları) dramatik bir artış gözlendi-FE (B) 24 saat sonrası aşılama. Ancak, ikincil conidiation ne zaman karşılaştırma-ch-FE (D)kloroform bioassay SDW denetimi (C) kadar belirgin değildi; daha doğrusu, C. fioriniae büyüme appressorial oluşumu doğru kaymıştır. Kloroform tabanlı, ana bilgisayar/çiçek türleri ne olursa olsun açıklanan ve gösterilen her ayıklama türü, su bazlı için ortak bir yanıttır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Ch-FE huzurunda zaman ders çalışma (24 saat) Colletotrichum fioriniae . Bu tahlil içinde bir SDW denetim (A-D) ve kızılcık 'Stevens' ch-FE (E-F) görsel olarak 0, 6, 12 ve 24 saat sonrası aşılama (birden çok FE karşılaştırma yerine değişken zaman puan örneği) denetlendi. Appressorium oluşumu (ok uçları) 6 h ch-Fe'de başladı ve sonraki zaman Puan giderek arttı. Bu sonuçları eludes patojen Biyoloji önemli bir faktör çiçeklenme döneminde: çiçek formu enfeksiyon yapıları için gereken süreyi azaltmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bir bioassay rw-FE kullanarak toplanan verilerin grafik ekran. Yağmur suyu çalıştırmak kızılcık çiçekler (CB "Çiçek" rw-FE) kapalı ve herhangi bir kızılcık bitki dokulardan ("Ground" rw-FE) tek bir ıslatma olay artı bir çift aktif, su bazlı kızılcık çiçek özü (CB etkin dokundu bakir yağmur suyu -FE) (pozitif kontrol) ve SDW (negatif kontrol) bir su bazlı coverslip bioassay tabi ve C. fioriniae büyüme için değerlendirilir. CB "Çiçek" rw-FE standart CB etkinolarak ikincil conidiation ve appressorium oluşumu aynı düzeyde vardı-koleksiyon aygıtları çiçek uyarıcılar sırasında çıkış yakalayan etkili olduğunu belirten FE 24 saat sonrası aşılama, adlı bir ıslatma-olay. Toplam conidia (yatırılır) İlköğretim, conidia ve yeni kurulan ikincil conidia oluşur. Harfler (LSD); p < 0,05 Fischer'ın en azından önemli bir değişikliğe göre önemli farklılıklar test gösterir büyük harfli, toplam conidia; küçük harf, appressoria. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Kızılcık fenoloji dayalı ch-FE bioassay, görsel denetim. Hastalık yönetimi mantarlar kez çürüyen meyve için bloom kez mantar ilacı uygulamaları içerir. Burada, kızılcık kloroform tabanlı özler (ch-FE) kızılcık ('Stevens') birden fazla büyüme aşamalarında etkisi yüzey Vakslar C. fioriniae , 24 saat sonrası aşılama için görsel olarak değerlendirildi. Yumurtalık toplanan Haziran (A), Temmuz ve Ağustos aylarında toplanan olgunlaşmamış meyve (B, C), hasat meyve toplanan Ekim (D)ve bir SDW denetimi (E) appressorial oluşumu (ok uçları) kontrol. Yumurtalık ch-FE appressorial oluşumu, bu bitki fenoloji (bloom) için yaşam döngüsü C. fioriniaeönemli olduğunu belirten en büyük büyüklüğü vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 1: Blueberry önümüzdeki. Yaban mersini çiçekler ('Bluecrop' olarak gösterilen) çekimi için tam çiçeklenme (Nisan-Mayıs ayında New Jersey, ABD) sırasında toplanmıştır. Corollas/yumurtalık bitişik çiçek üzerinden örtüşme ve tamamlayıcı Şekil 2 ile (kızılcık dik) karşılaştırıldığında önümüzdeki genel mimarisi unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: kızılcık dik. Kızılcık çiçekler ('Stevens' olarak gösterilen) çekimi için tam çiçeklenme (Haziran-Temmuz ayında New Jersey, ABD) sırasında toplanmıştır. Not bir tek kızılcık önümüzdeki (dik) ve çengel çeşitli çiçek Etaplar, su damlacığı corolla şeklinde istinat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 3: Blueberry yağmur suyu dağıtım (çiçek). Yaban mersini çiçek yağmur suyu toplama aygıt, doğrudan çiçeklenme bir küme altında yerleştirilen tamamlandı. Dikey olarak cihazın yönlendirmek için kullanılan plastik kaplı tel unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 4: Blueberry yağmur suyu dağıtım (kök). Tamamlanan yaban mersini çiçek yağmur suyu toplama aygıt, yarım taç Bush arasındaki bir önümüzdeki kök aşağı yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 5: Blueberry yağmur suyu dağıtım (taç). Yaban mersini çiçek yağmur suyu toplama aygıt, bush (taç) tabanında yer tamamlandı. Not plastik kaplı teller-ebilmek var olmak çıkarmak değil gerekirse. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 6: Blueberry yağmur suyu dağıtım (toprak). Bakire yağmur suyu toplama aygıt, yaban mersini çalılar için bitişik yerleştirilen tamamlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 7: kızılcık yağmur suyu dağıtım (yakın çekim). Kızılcık çiçek yağmur suyu toplama cihazı, iki tarafta düzgünce çapraz kablo bağları altında sıkışmış ile tamamlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 8: kızılcık yağmur suyu dağıtım. Çoklu bir bataklıkta dağıtılan kızılcık çiçek yağmur suyu aygıtları tamamlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı film 1: etkin, su bazlı çiçek özleri (etkin -FE). Aşağıdaki adımları 2.3-2.5.1 tamamlayıcı video desteği. Yaban mersini 'Bluecrop' çiçek kullanılmıştır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Tamamlayıcı Movie 2: pasif, su bazlı çiçek özleri (geçmek-FE). 3.3-3.4 tamamlayıcı video desteği aşağıdaki adımları. Yaban mersini 'Bluecrop' çiçek kullanılmıştır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Tamamlayıcı film 3: dağıtım kızılcık çiçek yağmur suyu toplama cihazların. 6.4. adımda takip tamamlayıcı video desteği. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Discussion
C. fioriniae yanıt çiçek özleri (FEs) olarak tespit BİYOANALİZLER için blueberry ve yaban mersini meyve çürüklüğü pathosystems geliştirilen ama diğer bahçe bitkileri için kolayca adapte edilebilir. Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralı da dahil olmak üzere birçok önemli veri kümeleri alınıyor değerli edilmiş, fakat bunlarla sınırlı olmamak üzere: FE etkileri çok sayıda patojenlerin, mantar büyüme aşamalarında çeşitli FEs, huzurunda zamanlı Kurs bilgileri birden çok yalıtır Ekstraksiyon teknikleri karşılaştırılması, muayene C. fioriniae büyüme ve farklılaşma, bireysel çiçek organ değerlendirilmesi bireysel kimyasalların ayıklar, C. fioriniae FE iken, etkileri huzurunda sıcaklık etkileri fenoloji bağımlı balmumu çekimi ve çiçek yağmur suyu etkileri. C. fioriniae hayat çok daha net anlaşılmasını sahneler ve çiçeklenme dönemi birçok meyve patojenler çürüyen denetimine çok önemlidir bu yüzden kısmen elucidates sağlanan bu teknikler kullanılarak oluşturulan veri da vardır.
Başlangıçta, tüm çiçekler aynı şekilde etkinolarak işlenmiş olan-FE ama ayıklama işlemi tüm çiçekler kullanarak doğru taşındı. Çiçek diseksiyon zaman alıcı ve elde edilen FEs bioactivity üzerinde çok az etkisi vardı. Ancak, bireysel çiçek organlarını ve varsa olabilir be değerlendirilmiş kullanarak bu iletişim kuralı, ama büyük bir özenle götürülmeli tamamen çiçek dokuları (tamamlayıcı film 1, 2,3 adımda ayrıntılı önlemler ile), macerate için bu kadar neden olup serbest bırakmak mikroskobik Değerlendirmeler deforme FE içine mantarlar-toksik/statik bileşikler. Daha az invaziv çekimi gibi pass -FE (tamamlayıcı film 2) ve rw-FE şimdi edinme kolaylığı nedeniyle daha uygun. Ayrıca, bu ayıklama teknikleri biyolojik olarak aktif çiçek kimyasal ipuçlarını elde etmek için yalnızca vakum filtrasyon gerektirir.
Tüm çekimi kullanılan çiçekler genellikle 0-3 için buzdolabında gün kala özü hazırlık. Bu iletişim kuralı zaman yönetimi FE ciro (alan koleksiyonu depolama yoluyla özler) mücadeledir. Bu birden çok kaynak ve tarihleri çok sayıda örnekleri şiddetlenir. Bozulan ve renksiz çözdürülen çiçek göründükleri gibi donmuş çiçekler herhangi bir gerçek ölçüde, değerlendirilmemiştir. Ancak, bir kez su bazlı FEs hazırdı, buz gibi tekrarlanan ve çözülme etkisi üzerinde göstermiştir FE FE hoşça bioactivity hızlı bir şekilde refrozen bioassay hazırlık (uygun 3 yaşındaki FE) sonra.
Kloroform tabanlı ayıklama patojen yanıt için üç boyutlu çiçek/meyve yüzey Vakslar ch-FE buharlaşma cam coverslips doğum via iki boyutlu düzlemde incelenmesi sağlar. Ancak, bu ch FE'den yatırılır mumlar gerçek kristal yapılarının hangi onlar toplanmıştır yüzeye aynıdır düşüktür. Belirli balmumu yapıları vivo içinde mantar yanıt soruşturmanın ana odak varsa niyetli, tamamlayıcı teknikleri uygulanmalıdır. Kloroform tabanlı özleri su bazlı çekimi daha daha fazla depolama bakım gerekir. Ch-FE özleri karanlıkta tutmak, yanı sıra PTFE kaplı hücre kültürü kapaklar ve şal Evaporatif kaçakları için düzenli olarak kontrol edilmesi gerek mühürleme parafilm tüp ve gerektiği gibi yerine.
Çiçek yağmur suyu akış kontrolü kavramı siteye özgü hastalık izleme araçları tarihini erkene alma fikrini yatmaktadır. Çiçek kapalı tükendi yağmur suyu toplama aygıt yakalar sürece yağmur suyu toplama cihazlar diğer birçok bitki mimarileri için adapte edilebilir. Bu yaklaşım olsun veya olmasın çiçek stimülasyon herhangi bir zamanda alanında mevcut ve sezon boyunca izlenebilir hakkında bilgi sağlar. Alternatif olarak, koleksiyon cihazlar ne kadar çiçek cues verilen herhangi sırasında ıslatma-olay yıkanmış belirlemek için birden fazla gölgelik yerlerde dağıtılabilir. Gelecekte deneyler, mantar ilacı uygulamaları ne zaman başlaması gerektiğini ve ne zaman güvenli bir şekilde sona erebilir rw-FE belirleyecektir. Ayrıca, fenoloji bağımlı balmumu çekimi (iletişim kuralı Bölüm 9) izleyerek, çiçeklenme dönemi patojen Biyoloji için önemi daha da belirgin haline gelmiştir. Bu bölüm Ayrıca geçici ayrılır ana yüzey Vakslar yan yana karşılaştırma için izin yöntemleri sağlayan bu BİYOANALİZLER esnekliğini göstermek için eklenmiştir. Çiçek çıkarma teknikleri ve BİYOANALİZLER kullanılarak oluşturulan verilerin patojen stimülasyon, somut göstergeleri belirli kimyasal sınıfları patojen Biyoloji ve gelecekteki kontrol stratejileri için hedefler için temsil eder.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
William S. Haines, Sr. donatılmış kızılcık Araştırma Fonu ve New Jersey Blueberry ve kızılcık Araştırma Konseyi, Inc destek için teşekkür ederiz. Biz de teşekkür ederiz Jennifer Vaiciunas (rehberlik ve çiçek hazırlıklar), Christine Constantelos (mantar kültürü ve çiçek hazırlıkları), David Jones (çiçek ürünleri ve çekimi), Langley Oudemans (çiçek hazırlıklar, filme/fotoğraf), Jesse Lynch (çiçek hazırlıklar), Roxanne Tumnalis (genel destek) ve çok sayıda öğrenci/yaz stajyer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | - | - | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | - | - | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | - | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | - | - | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Fume hood | Hamilton | - | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | - | - | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | - | - | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | - | - | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | - | - | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | - | - | Equipment, FE preparation |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | - | - | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | - | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | - | - | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | - | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | - | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).
- DeMarsay, A. Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
