Skjelettmuskel differensiering er en svært dynamisk prosess, som bruker spesielt kjernefysisk posisjonering. Her beskriver vi en metode å spore kjerner bevegelser av levende celle tenkelig under myoblast differensiering og myotube formasjon og utføre kvantitativ karakteristikk av kjerner dynamikken ved gitt informasjon automatisk sporing.
Kjernefysisk posisjonering i celler er viktig for flere cellulære prosesser i utvikling og regeneration. Det mest spennende eksempelet på kjernefysiske posisjonering oppstår under Skjelettmuskel differensiering. Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler av fusjon av muskel precursor celler (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering. Riktig kjernefysiske posisjonering i myofibers er nødvendig for riktig muskulære og funksjon. Den vanlige prosedyren for å vurdere myoblast differensiering og myofiber formasjon er avhengig av faste celler analysert av immunofluorescence, som hindrer studiet av kjernefysiske bevegelse og celle oppførsel over tid. Her beskriver vi en metode for analyse av myoblast differensiering og myofiber dannelsen av levende celle tenkelig. Vi tilbyr en programvare for automatisert kjernefysiske sporing å få høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast atferd (dvs. banen) under differensiering og fusion.
Skjelettmuskulatur er den største vev i kroppen, totalt 35% – 40% av kroppen masse1. Satellitt celler er muskel-stamceller, anatomisk preget av sin posisjon (satt sammen til plasma membranen, under den basale lamina av muskel fiber), som gir opphav til voksende myoblasts (myogenic stamfar celler), som til slutt skille og integrere i eksisterende myofibers og/eller sikring til skjemaet ny myofibers2,3,4. Funnet og fremgang i studiet av deres biologi har ført til betydelig innsikt i muskelutvikling og regeneration.
Protokoller å isolere og skille myoblasts i myotubes har blitt utviklet mange år siden og fortsatt er mye brukt til å studere Skjelettmuskel differensiering5,6,7. Men representerer de fleste av disse metodene statisk prosedyrer som stole på analyse av fast celler, og derfor tillater ikke forskere helt utforske svært dynamisk prosesser, for eksempel myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksemplet er kjernefysiske posisjonering, som er strengt regulert, med kjerner først i midten av myofiber, og deretter plassert i periferien etter myofiber modning8,9. Live bildebehandling er den mest passende teknikken for å få ytterligere innsikt i så merkelig fenomen.
Her beskriver vi en metode som gjør at forskerne å registrere myoblast differensiering og myotube dannelsen av time-lapse mikroskopi og utføre kvantitative analyser fra den automatiske sporingen av myoblast kjerner. Denne metoden gir høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast oppførsel under differensiering og fusion. Protokollen er delt inn i fire ulike deler, nemlig (1) samling av musklene hindlimbs mus, (2) isolering av primære myoblasts som består av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen, (3) myoblast spredning og differensiering og (4) Live bildebehandling spore kjerner innenfor de første 16 h myoblast differensiering.
Fremgangsmåten er myoblasts isolert fra H2B-GFP mus og behandlet med 1 µg/mL av doxycycline å indusere H2B-GFP uttrykk, som beskrevet tidligere10. Alternativt er det mulig å isolere myoblasts fra andre transgene mus som uttrykker et fluorescerende protein i kjernen eller transfect celler isolert fra vill-type mus å uttrykke et fluorescerende protein i kjernen, som beskrevet ved Pimentel et al. 9.
Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler som dannes ved blanding av prekursorer muskelceller (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering2,3, 4. For å vurdere myoblast differensiering, består den felles prosedyren av dyrking myoblasts skille medium og feste cellene på ulike tidspunkt å utføre immunofluorescence flekker for MyHC, en markør av differensiering og …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av AFM-Telethon til E.V. (#21545) og til Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskudd til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra bildet analyse sentrum av Institut Pasteur er anerkjent for offentlig deler hans “Enkel Tracker” MATLAB rutiner.
chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
doxyciclin | Sigma | D1515 | |
DMEM | Sigma | D5671 | |
fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
gentamicin | Sigma | G1397 | |
Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
Hoechst | life technologies | 33342 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Matrigel | Corning | 356231 | |
penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
Digestion medium | |||
collagenase | 40 mg | ||
dispase | 70 mg | ||
PBS | 20 ml | ||
filtered 0.22um | |||
Blocking medium | |||
DMEM | |||
Fetal bovine serum | 10% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
filtered 0.22um | |||
proliferation medium | |||
IMDM | |||
Fetal bovine serum | 20% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
chichen embryo extract | 3% | ||
filtered 0.22um | |||
differentiation medium | |||
IMDM | |||
Horse serum | 2% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
chichen embryo extract | 1% | ||
filtered 0.22um |