Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكولا لدراسة الآلية الجزيئية لبروتون إزفاء عبر الأغشية الدهنية الدهنية واحد، استخدام الفسفرة بو3 كمثال. يمكن الكشف عن الجمع بين كهربية والفحص المجهري الأسفار، تغييرات درجة الحموضة في التجويف حويصلات وحيد، والتي تحتوي على واحد أو إنزيم متعددة، وتحليلها على حدة.
Abstract
ضخ البروتون الإنزيمات من إلكترون نقل سلاسل تفاعلات الأكسدة والاختزال الزوجان إلى إزفاء بروتون عبر الغشاء، إنشاء قوة الدافع البروتون المستخدمة لإنتاج ATP. الطابع amphiphilic للبروتينات الغشاء يتطلب إيلاء اهتمام خاص للمعالجة وإعادة تشكيل في البيئة الطبيعية في الدهون أمر لا غنى عنه عند دراسة عمليات النقل الغشاء مثل إزفاء بروتون. هنا، نحن بالتفصيل أسلوب الذي تم استخدامه لتحقيق إليه ضخ البروتون غشاء إنزيمات الأكسدة والاختزال، أخذ الفسفرة بو3 من الإشريكيّة القولونية كمثال. هو استخدام مزيج من الفحص المجهري كهربية والأسفار للتحكم في حالة الأكسدة كينون تجمع ورصد التغيرات درجة الحموضة في التجويف. مئات الدهنية بسبب القرار المكانية للفحص المجهري نيون، يمكن أن يقاس في وقت واحد بينما يمكن تقليص محتوى إنزيم إنزيم واحد أو الناقل الواحد الحويصلية. تحليل إنزيم واحد منها يمكن أن تكشف عن أنماط في ديناميات إنزيم الوظيفية التي قد تكون مخفية وإلا بسلوك السكان ككل. نقوم بتضمين وصف نصي لتحليل الصورة الآلي.
Introduction
يتم عادة الحصول على معلومات حول آليات الإنزيم وحركية على مستوى الفرقة أو ماكروسكالي مع السكان الإنزيم بالآلاف إلى ملايين جزيئات، التي تمثل فيها القياسات متوسط الإحصائي. ومن المعروف، بيد أن الجزيئات المعقدة مثل الإنزيمات قد تثبت عدم التجانس في سلوكهم والآليات الجزيئية التي لوحظ على مستوى فرقة ليست بالضرورة صالحة لكل جزيء. قد تأكدت هذه الانحرافات بمقياس جزيء الفردية على نطاق واسع بدراسات للإنزيمات واحد مع مجموعة متنوعة من أساليب الناشئة خلال العقدين الماضيين الماضي1. جدير بالذكر أن الأسفار الكشف عن نشاط إنزيم الفردية قد استخدمت للتحقيق في عدم تجانس الإنزيمات النشاط2،3 أو اكتشاف تأثير ما يسمى الذاكرة (فترات من نشاط الإنزيمات عالية نجح خلال فترات انخفاض النشاط و العكس)4،5.
تتطلب العديد من الدراسات إنزيم واحد أن الإنزيمات هي معطلة على السطح أو ثابت مكانياً في طريقة أخرى للبقاء طويلاً بما فيه الكفاية في مجال الرؤية للمراقبة المستمرة. لقد ثبت تغليف الإنزيم في الدهنية لتمكين التثبيت الإنزيم مع منع أي تأثير سلبي الواجب السطح-إنزيم أو بروتين-بروتين تفاعلات6،7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم الدهنية إمكانية فريدة لدراسة البروتينات غشاء مفرد في بهم الدهن الطبيعية البيئة bilayer8،،من910.
فئة من بروتينات الغشاء، الناقلين، يمارس إزفاء اتجاهي للمواد عبر غشاء الخلية، سلوك الذي يمكن دراستها إلا عندما يتم تشكيل البروتينات في دهن بليرس (مثلاً، الدهنية)11، ،من 1213. على سبيل المثال، إزفاء بروتون، تعرض بواسطة إنزيمات عدة سلاسل النقل الإلكترون بدائية وحقيقية النواة، دوراً هاما في التنفس الخلوي إنشاء قوة الدافع البروتون المستخدمة لتركيب ATP. وفي هذه الحالة، يقترن البروتون ضخ نشاط لنقل الإلكترون، على الرغم من أن إليه مفصلة لهذه العملية غالباً ما زال بعيد المنال.
في الآونة الأخيرة، أثبتنا إمكانية الكشف الفلورسنت زوجين مع كهربية لدراسة بروتون ضخ نشاط الإنزيمات واحد من أوكسيديز أوبيكوينول المحطة الطرفية من الإشريكيّة القولونية (الفسفرة بو3) أعيد تشكيلها في الدهنية14. وقد تحقق ذلك بتغليف صبغة الفلورسنت غشاء كتيمة حساسة لدرجة الحموضة في التجويف الدهنية أعدت من هاء القولونية القطبية الدهون (الشكل 1A). وكان الأمثل كمية البروتين حيث أن معظم الدهنية الواردة أما جزيء الإنزيم المعاد تشكيلها لا أو واحد فقط (حسب توزيع Poisson). وقدمت ركائز اثنين من الفسفرة بو3 بإضافة أوبيكوينوني إلى المزيج المادة الدهنية التي تشكلت في الدهنية والأكسجين (المحيط) في حل. ثم هي تمتز الدهنية قليلة على مسرى الذهب فائقة على نحو سلس شبه شفافة، مغطاة تجميعها ذاتيا أحادي الطبقة من 6-ميركابتوهيكسانول. وأخيراً، شنت مسرى على الجزء السفلي من الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال بسيطة (الشكل 1B). يسمح التحكم الكهروكيميائية الدولة الأكسدة تجمع كينون أحد مرونة تحريك أو إيقاف التفاعل الأنزيمي في أي لحظة، بينما يستخدم لرصد تغيرات درجة الحموضة داخل التجويف الدهنية نتيجة إزفاء بروتون بصبغة حساسة لدرجة الحموضة الإنزيمات. قبل استخدام يمكن تحديد كثافة fluorescence صبغة الفلورسنت وثانيا، ربط دهني، حجم وحجم الدهنية الفردية وبالتالي التحديد الكمي للبروتون الإنزيم ضخ النشاط. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا لا سيما أن الفسفرة بو3 جزيئات قادرون على الدخول في حالة تسرب عفوية سرعة تبدد القوة الدافعة بروتون. والهدف من هذه المادة إدخال تقنية القياسات الحويصلية واحد بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد مزيج دهني/UQ-10/فضل
ملاحظة: يجب أن تكون هاء القولونية الدهون المستخدمة لإعداد الدهنية الكوتيد ودقة مختلطة مع أوبيكوينوني-10 (إنزيم الركازة) والطول الموجي الطويل الفلورسنت المسمى صبغ الدهون (لتحديد حجم الدهنية) قبل إعادة تشكيل.
- استخدام المحاقن زجاجية، استخراج نقل 200 ميليلتر من مخزون كلوروفورم الدهني القطبية من الإشريكيّة القولونية (25 ملغ/مل) في قارورة الزجاج جعل مختبرين 5 ملغ.
- إضافة 50 ميليلتر من 1 ملغ/مل أوبيكوينوني-10 (UQ-10؛ وفي كلوروفورم) الدهون جعل نسبة نهائية من UQ-10: 1: 100 الدهون (1% w/w).
- إضافة 20 ميليلتر من 1 ملغ/مل (0.4% w/w) طول موجي طويل الفلورسنت المسمى صبغ دهن (فضل) لهذا المزيج الدهون/UQ-10.
- مجانسة الحل كلوروفورم قبل فورتيكسينج قصيرة وتتبخر معظم كلوروفورم تحت تدفق النيتروجين أو الأرجون لطيف. إزالة آثار كلوروفورم تماما بزيادة التبخر تحت الفراغ ح 1 على الأقل.
ملاحظة: يمكن تخزين مختبرين الدهن تحت جو خامل في-20 درجة مئوية لعدة أشهر.
2-إعادة تشكيل الفسفرة بو3
ملاحظة: لتنقية الفسفرة بو3 من كولاي، يتبع البروتوكول من رومبلي et al. 15 لضمان نقاء عالية من العينات إنزيم مطوية أصلاً، إضافة حجم الاستبعاد اللوني بعد تنقية تقارب خطوة وصفتها رومبلي et al. 15
- إضافة 312.5 ميليلتر من 40 مم الممسحات-كوه/60 مم ك2حتى4، درجة الحموضة 7.4، إلى قاسمة واحد من الدهون/UQ-10/فضل الجافة مزيج (5 ملغ، خطوة 1.4) وتخلط مع دوامة حتى تماما حراكه الفيلم الدهن، تليها 2 دقيقة من العلاج في حمام الموجات فوق الصوتية.
- إضافة ميليلتر 125 ملم 25 حمض 8-هيدروكسيبيريني-1,3,6-تريسولفونيك (هبتس)، صبغة فلورسنت حساسة لدرجة الحموضة التي تحتاج إلى أن تكون مغلفة داخل الدهنية.
- إضافة 137.5 ميليلتر من 250 مم ن-أوكتيل β-د-جلوكوبيرانوسيدي (عجب) الفاعل واستخدام دوامة مزيج sonicate في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة لضمان جميع الدهون هي solubilized في المذيلات الفاعل. نقل التشتت في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
ملاحظة: تعليق خفيف الدهون ينبغي أن تصبح شفافة بعد solubilization مع الفاعل بالسطح. - إضافة الكمية المطلوبة من الفسفرة بو3 (انظر الملاحظة أدناه)، وإضافة الماء عالي النقاوة جعل إجمالي حجم 50 ميليلتر (الفسفرة بو3 الحل بالإضافة إلى الماء). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في خلاط اسطوانة.
ملاحظة: كمية نموذجية لظروف إنزيم واحد هو 0.1 – 0.2% (w/w البروتين للدهن، أي. 5-10 ميكروغرام من البروتين)، على الرغم من أنه يمكن زيادة حتى 1-2% (50 – 100 ميكروغرام من البروتين) إذا كان الهدف مراقبة النشاط الكهروكيميائية فقط (انظر أدناه). كعنصر تحكم سلبية، يمكن إعداد الدهنية دون الفسفرة بو3 . - تزن 2 × 50 ملغ و 2 × 100 مغ من ميكروبيدس البوليستيرين في أربعة 1.5 مل-أنبوب قبعات ووثيق مع الفيلم البرافين لمنع التجفيف.
ملاحظة: قبل استخدام، البوليسترين يجب غسلها ميكروبيدس مع الميثانول والمياه المخزنة في المياه وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: إذا كان يتم استخدام خليط الماء/ميكروبيد، ميكروبيدس البوليستيرين يمكن مريح نقل إلى الحد الأقصى مع ميكروبيبيتي مع معلومات سرية على نطاق واسع. ثم يمكن إزالة الماء من ميكروبيدس استخدام ميكروبيبيتي مع نصيحة رقيقة. - إضافةش150 مغ من ميكروبيدس البوليستيرين في إعادة تشكيل الخليط (الخطوة 2، 4) بوضع الغطاء مع ميكروبيدس البوليستيرين في أنبوب البلاستيك ومل 1.5 مع تشتت وأداء تدور قصيرة لبضع ثوان. تبني في 4 درجات مئوية في خلاط اسطوانة البوليسترين ميكروبيدس الجسميات الفاعل مدة 30 دقيقة.
- كرر الإضافات البوليسترين ميكروبيدس وإينكوبيشنز على النحو التالي: إضافة 50 مغ من ميكروبيدس 60 دقيقة للحضانة؛ إضافة 100 مغ من ميكروبيدس 60 دقيقة للحضانة؛ وإضافة 100 مغ من ميكروبيدس 120 دقيقة للحضانة.
ملاحظة: الحل أعلاه ميكروبيدس استقر ستتحول شفافة خلال الخطوة 2.6 كما تتشكل بروتيوليبوسوميس.
- كرر الإضافات البوليسترين ميكروبيدس وإينكوبيشنز على النحو التالي: إضافة 50 مغ من ميكروبيدس 60 دقيقة للحضانة؛ إضافة 100 مغ من ميكروبيدس 60 دقيقة للحضانة؛ وإضافة 100 مغ من ميكروبيدس 120 دقيقة للحضانة.
- فصل الحل بروتيوليبوسومي من ميكروبيدس البوليستيرين باستخدام ميكروبيبيتي بنصيحة رقيقة. تمييع التشتت في 90 مل 20 مم الممسحات-كوه/30 مم ك2حتى4، ودرجة الحموضة 7.4 (والمماسح العازلة) ونقل في أنبوب أولتراسينتريفوجي Ti45.
- أولتراسينتريفوجي التشتت استخدام نوع 45 Ti الدوار في 125,000 س ز (في البحث والتطويركحد أقصى) ح 1 بيليه بروتيوليبوسوميس.
ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب الطرد المركزي أصغر على الرغم من تقليص في حجم المخزن المؤقت كبير يساعد على خفض تركيز هبتس غير مغلفة في تعليق نهائي. - تجاهل المادة طافية، شطف الكريات مع 20 مم الممسحات-كوه/30 مم ك2حتى4، درجة الحموضة 7.4 المخزن المؤقت (بدون ريسوسبيندينج بيليه). بعد تجاهل المخزن المؤقت الشطف، إعادة تعليق بروتيوليبوسوميس في 500 ميليلتر والمماسح المخزن المؤقت قبل بيبيتينج عليه ذهابا وإيابا بنصيحة رقيقة ميكروبيبيتي. ثم نقل إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
- الطرد المركزي بتعليق لمدة 5 دقائق في 12,000 س ز لإزالة الأنقاض. نقل المادة طافية (المعاد تشكيلها بروتيوليبوسوميس) في قنينة جديدة.
- تخزين تشتت بروتيوليبوسوميس أعيد تشكيلها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها واستخدم خلال يومين.
3-تصنيع أقطاب الذهب شبه شفافة
ملاحظة: يتم الحصول على سطح الذهب السلس بأسلوب تجريد قالب 30 نانومتر سميكة طبقة من الذهب 99.99 ٪ من رقاقة سيليكون الذرة سلس. سمك طبقة الذهب الصغيرة مهم نظراً لأنه يجب أن تكون شبه شفافة تسمح برصد الأسفار. تفاصيل الذهب التبخر (ترسب بخار البدنية، الترسيب الفيزيائي للبخار) يمكن العثور في مكان آخر16 وتجريد قالب فقط يتم تغطيتها هنا. وبدلاً من ذلك، رقائق الذهب فائقة على نحو سلس ويمكن شراؤها في أماكن أخرى (انظر الجدول للمواد).
- الصق كشوف غطاء الزجاج يصل إلى 9 (0.17 مم) على سطح الذهب تبخر باستخدام مكون ثنائي منخفض-الأسفار الإيبوكسي. علاج الغراء عند 80 درجة مئوية ح 4.
- قبل التعديل مع أحادي الطبقة تجميعها ذاتيا (الخطوة 4)، فصل كشوف غطاء الزجاج من رقائق السيليكون مع شفرة. بسبب ركاكة زلات الغطاء، العناية عند فصل كشوف الغطاء لا الكراك أو كسر الشرائح الزجاجية.
4-تعديل على سطح الذهب مع تجميع ذاتي أحادي الطبقة (SAM)
- إعداد 5 مل من محلول المياه من 1 ملم 6-ميركابتوهيكسانول (6MH).
- تراجع فصل طازجة من كشوف غطاء المغلفة بالذهب (الخطوة 3.1) في حل 6MH وترك في 20 – 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (> ح 16) لتشكيل SAM.
ملاحظة: قد ثيول الحلول رائحة كريهة، حيث ينبغي استخدام سفينة مغلقة عندما تفرخ بكشف غطاء المغلفة بالذهب. - في اليوم التالي، إزالة بكشف غطاء المغلفة بالذهب من حل 6MH، وتغسل بإيجاز مع الماء أو الميثانول، ومن ثم مع الايزوبروبانول. الجافة تحت تدفق غاز لطيف.
5-الكهروكيميائية اختبار النشاط بروتيوليبوسوميس
ملاحظة: أولاً الكهروكيميائية نشاط إنزيم يتم التحقق على طبقة الدهنية معبأة عن كثب (الخطوة 5) وأقل حويصلة التغطيات المستخدمة في التجربة حويصلات وحيد لقياس تغيرات درجة الحموضة في التجويف الدهنية (الخطوة 6).
- التجمع بكشف غطاء المغلفة بالذهب في إحدى خلايا الكهروكيميائية الطيف (انظر الشكل 1). تجعل الاتصال للذهب مع سلك مسطحة خارج منطقة محددة من مطاط الدائري.
- إضافة 2 مل الحل المخزن المؤقت المنحل بالكهرباء ووضع مرجع ومساعد كهربائي في الخلية.
ملاحظة: كما تمت مناقشتها في المقطع المناقشة، يفضل أقطاب المراجع دون كلوريد لمنع تشكيل الاتحاد الأفريقي (ط) Cl خلال كهربية. هنا، وزئبق Hg/2هكذا4 (سبت. ك2هكذا4) يستخدم مرجع القطب وإمكانات تعطي مقابل قطب الهيدروجين القياسي (أنها) استخدام 0.658 الخامس مقابل أنها ل الزئبق Hg/2هكذا4 (سبت. ك2حتى4). - تشغيل المعاوقة الكهروكيميائية التحليل الطيفي (0.1 هرتز – 100 كيلوهرتز) في الخلية المفتوحة (OCP) المحتملة لتقييم نوعية سام. تحويل قيم مقاومة للقبول والقسمة 2πω مؤامرة مؤامرة كول-كول، حيث ω هو التردد (انظر المراجع التالية16،،من1718 لمزيد من التفاصيل حول تحويل وتفسير مقاومة الأطياف).
ملاحظة: يجب أن تعطي وثيقة شبه دائرة المؤامرة كول-كول سامز المدمجة وكثيفة من 6MH وإعطاء قيم السعة في حدود 2.5-3.0 µF/سم2 (الشكل 2A). إذا كان يتم الحصول على الانحراف كبيرة من السعة خارج نطاق القيم أو الشكل نصف دائرة، تغيير الكهربائي. - تشغيل فولتاموجرامس دوري فارغة (السير الذاتية) مع مسح أسعار 100 و 10 mV/s في منطقة المحتملة-0.3-0.8 V. وتبين السيرة ذاتية نموذجية (الشكل 2B، خط متقطع).
ملاحظة: هذا يجب أن تثبت السلوك سعوية نقية تقريبا وغياب التيار فارادايك كبيرة، حتى في ظل الظروف المحيطة الأكسجين المستخدمة هنا. - إضافة بروتيوليبوسوميس (تركيز الدهون النهائي 0.5 ملغ/مل، نسبة 1-2% (w/w) الفسفرة بو3 إلى المادة الدهنية) إلى خلية كهروكيميائية ويخلط قليلاً ماصة. الانتظار حتى يتم الانتهاء من (30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) من امتزاز بروتيوليبوسوميس على سطح القطب.
ملاحظة: يمكن تشغيل دوري فولتاموجرامس (السير الذاتية) في المتوسط 10/s أثناء الامتزاز بروتيوليبوسوميس لمتابعة هذه العملية. الامتزاز الانتهاء عند توقف السير الذاتية على التوالي المتغيرة. يمكن العثور على معلومات حول تقنيات السيرة الذاتية في الكتب التالية. 19 , 20 - أغسل الخلية عن طريق تغيير الحل المخزن المؤقت على الأقل 10 مرات ولكن تجنب ترك سطح القطب جافة تماما.
- تشغيل التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية في الفوسفاط (الشكل 2A، الخط الأزرق) لتأكيد وسام على مسرى الذهب لم يتغير ومسح السير الذاتية مع معدلات 10 و 100 mV/s إلى الاحتفال أكسدة أوبيكوينول الحفازة (والحد من الأكسجين) عن طريق الفسفرة بو 3 في بداية إمكانات خفض كينون الكهروكيميائية حول 0 الخامس مقابل أنها) (الشكل 2).
6-كشف بروتون الانزيمية الضخ بالفحص المجهري الأسفار
- تعديل مسرى الذهب كما هو الحال في الخطوة 5 ولكن باستخدام 100 × بروتيوليبوسوميس أقل مقارنة بالخطوة 5.5 (أي، 5 ميكروغرام/مل). الدراسات إنزيم واحد، خفض بوالفسفرة3 إلى نسبة الدهون إلى 0.1-0.2% (w/w).
ملاحظة: سوف الجسميات الدهنية قليلة على سطح القطب مما يتيح رصد حويصلة واحدة بالفحص المجهري الأسفار. في ظل هذه الظروف إنزيم واحد، كمية الإنزيم المعطل تداولها على سطح القطب غير كافية للمراقبة الحالية الحفاز. - وضع الخلية الكهروكيميائية على هدف النفط (60 X) المجهر المقلوب الأسفار مع قطره زيت الغمر. استخدام عوامل التصفية المناسبة لفضل الأسفار، التركيز على سطح القطب. يجب أن تظهر الدهنية واحد النقاط المضيئة في الحد حيود المجهر/الهدف. التقاط صورة لفضل الأسفار.
- قم بالتبديل إلى إحدى مجموعات التصفية fluorescence هبتس في المجهر للتحقق من أن الأسفار هبتس مرئية بوضوح وتمييزها عن الخلفية (في الوقت الذي تم اختياره التعرض، راجع الخطوة 6.4). زيادة شدة الضوء إذا لم يكن الحال.
- برنامج برنامج المجهر لأداء الحصول على صور المحددة زمنياً بالتناوب مجموعتين من تصفية هبتس (القائمة التطبيقات | Define/Run اقتناء ND). تعيين التأخير بين امتلاك الصورة في الحد الأدنى. في هذه التجربة، واستخدام تعرض s 1 و 0.3 ثانية التأخير (بسبب حركة البرج).
ملاحظة: النسبة بين كثافة fluorescence في اثنين من هذه القنوات سيتم لاحقاً تحويلها إلى الأس الهيدروجيني داخل الدهنية عند كل نقطة في الوقت. يمكن أن تختلف مدة اقتناء وفقا لمعدل تغير درجة الحموضة المتوقعة؛ 5 دقيقة يستخدم في هذه المقالة. - ضبط إعدادات بوتينتيوستات إلى تغيير الإمكانات أثناء الحصول على الصورة. على سبيل المثال، في هذه التجربة، استخدم التسلسل التالي: 0-60 s: لا إمكانية تطبيقها (أي الفوسفاط)؛ 60-s: 180-0.2 الخامس (مقابل أنها)؛ 180-300 s: 0.4 V (مقابل أنها). في هذه الحالة، فقط إمكانية تطبيقها في المرحلة الثانية (-0.2 الخامس مقابل أنها) كافية للتقليل من كفاءة تجمع كينون.
- تشغيل في الوقت نفسه اقتناء الصور المحددة زمنياً (مجهر) وتسلسل المحتملة (بوتينتيوستات) قبل بدء تشغيل يدوياً كل القياسات في نفس الوقت.
ملاحظة: التجربة يمكن أن تتكرر في مسرى نفس الوقت عدة بتحريك المرحلة المجهر إلى منطقة مختلفة على السطح. التأخير بين عمليات الشراء ينبغي أن تكون على الأقل 5-10 دقيقة لضمان الموازنة الأس الهيدروجيني كاملة من الدهنية على السطح. يمكن تطبيق مدد مختلفة وأنماط المحتملة حسب الحاجة، على الرغم من التصوير وقت محدود بسبب فوتوبليتشينج هبتس أثناء اقتناء.
7-تحليل الصور الأسفار
ملاحظة: تجربة نموذجية ينتج مجموعة من الصور مع خطوة وقت (مثلاً، 2.6 ثانية) لكل من القناتين، أي (مدة * 2/2.6) الصور. مثال على هذه الصورة بتعيين مسجل خلال تجربة إنزيم واحد يمكن الوصول إليها عبر مستودع "بيانات البحوث ليدز"21. الحصول على معالجة صورة يتكون من عدة خطوات باستخدام التحليل الرياضي الرفيع المستوى برمجة برامج اللغة (يشار إليها من الآن فصاعدا ب كبرمجة البرامج، انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) وفيجي (إيماجيج).
- استخدام فيجي لفصل ملف انقضاء الوقت، محاذاة الصور وحفظها كقنوات منفصلة والأطر الزمنية.
- ملف الفاصل وقت مفتوح باستخدام المستورد بيوفورماتس المقدمة داخل فيجي (الأوامر الماكرو: تشغيل (بيو-صيغ المستورد "")).
- استخدام البرنامج المساعد ستاكريج بمحاذاة كل إطار إلى أول واحد لحساب حركات مرحلة ممكنة أو الانحراف الحراري أثناء الحصول على (أمر ماكرو: تشغيل ("ستاكريج"، "التحول = الترجمة")).
- حفظ ملفات الصور غير مضغوط منفصلة لكل قناة وكل خطوة الوقت في تنسيق TIFF في مجلد واحد.
- استخراج الطوابع الزمنية الدقيقة لكل إطار من بيانات تعريف الملف انقضاء الوقت وحفظها كملف CSV في نفس مجلد الصور. وبدلاً من ذلك، استخراج الطوابع الزمنية باستخدام البرمجيات اقتناء وحفظ يدوياً إلى ملف CSV باستخدام برامج جداول بيانات.
ملاحظة: المجلد مع الصور والطوابع الزمنية جاهز الآن ليتم تحليلها بواسطة البرامج النصية. الخطوات 7.1.1. -7.1.4. يمكن أن يكون أوتوماتيزيد استخدام برنامج نصي لفيجي (نصي مكتوب في بيثون لتجهيز دفعة من ملفات انقضاء الوقت، استخدام "Ctrl-Shift-N" (في Windows)، ثم الملف | فتح لتحميل البرنامج النصي).
- استخدام البرامج النصية للتجهيز الخاص للصور. تحميل التعليمة البرمجية المقدمة إلى البرنامج وانقر فوق تشغيل للغاية. عندما تتم مطالبتك، حدد المجلد الذي يحتوي على الصور من الخطوة 7، 1.
ملاحظة: يتم توفير نصي للتحليل ملكس-تنسيق نصي يعيش، مع تعليقات مستفيضة، تحديد الدهنية واحد ويصلح لهم لوظيفة غاوسي 2D، وتصفية لهم والتحديد الكمي لقيم الأس الهيدروجيني في كل وقت. يتم تنفيذ الخطوات الفرعية التالية تلقائياً من البرنامج النصي.- تحميل جميع الصور الأطر الزمنية لتجربة واحدة في الذاكرة.
- متوسط جميع الصور لقناة واحدة (تحديد القناة مع أعلى كثافة الأسفار) واستخدام الصورة متوسط لتحديد جميع الحدود القصوى التي قد تتوافق مع الدهنية واحدة.
- تناسب الحدود القصوى المحددة في الصورة متوسط في 2D-غاوسي وظيفة وحفظ وادي إلى احتواء المعلمات لكل الحويصلية (انظر الشكل 4A على سبيل المثال الحويصلية المجهزة).
- تصفية القصوى وفقا لمعايير الدهنية الوحيدة المتوقعة، مثل الحجم، والتدوير وكثافة. رفض الدهنية التي يتم تركيبها ضعيف بسبب انخفاض إشارة الضوضاء، وعن كثب المجاورة الحويصلية أو يجري جداً قريب من حافة الصورة.
- تحميل الطوابع الزمنية من الملف الخارجي وتناسب كل الحويصلية التي تمت تصفيتها في 2D-غاوسي الدالة على كل صورة الإطار الزمني بشكل منفصل.
ملاحظة: يمكن زيادة استخدام البرمجة المتوازية ومتعددة النواة وحدة المعالجة المركزية إلى حد كبير سرعة الحساب في هذه المرحلة. - تصفية الدهنية مرة أخرى وفقا لمعايير مماثلة كما هو الحال في الخطوة 7.2.4 لكنها تنطبق على كل إطار زمني.
- في كل خطوة من خطوات الوقت، تحديد نسبة كثافة fluorescence الحويصلية كالنسبة من وحدات التخزين محاطة بوظيفة غاوسي 2D المجهزة في قناتين. حساب قيم الأس الهيدروجيني من نسبة كثافة مصممة من قناتين هبتس واستخدام منحنى معايرة (الخطوة 8). رسم منحنيات وقت الأس الهيدروجيني الناتجة الدهنية ومراقبة على درجة الحموضة تغيير عند تطبيق الإمكانات.
8-أداء منحنى معايرة للأسفار هبتس
ملاحظة: لتحويل نسبة الأسفار هبتس لدرجة حموضة إينترافيسيكولار، منحنى معايرة يجب أولاً إثبات أنه سيأخذ في الاعتبار الظروف الخاصة بتجارب مثل نفاذية الذهب، عوامل الجودة، إلخ. هذه الخطوة قد يتعين القيام بها إلا مرة واحدة أو مرتين، ويمكن استخدام البيانات المعايرة طالما معلمات الإعداد والقياس لا تزال هي نفسها في الخطوة 6.
- إعداد قطب كهربائي مع الدهنية قليلة الممتزة (دون الفسفرة بو3 كما هو موضح في الخطوات 5 و 6-1).
- إضافة 2 ميليلتر من 0.1 مغ/مل جراميسيدين الحل في الإيثانول إلى 2 مل من المخزن المؤقت لخلق تركيز 100 نانوغرام/مليلتر.
- التقاط صورتين الأسفار للقنوات هبتس اثنين.
- تغيير الرقم الهيدروجيني للخلية عن طريق إضافة مختبرين الصغيرة من 1 M HCl أو م 1 ح2حتى4. قياس درجة الحموضة من المخزن المؤقت مع مقياس الأس الهيدروجيني قياسي والتقاط صورتين الأسفار للقنوات هبتس اثنين.
- كرر الخطوات من 8.4 لنطاق الرقم الهيدروجيني 6 إلى 9.
- باستخدام الخوارزمية من 7.2، احتواء وتصفية وحساب متوسط نسبة الأسفار هبتس الدهنية الفردية في كل درجة الحموضة. أن متوسط نسبة هبتس الدهنية كافة.
- يصلح الاعتماد على نسبة الحموضة الناتجة عن ذلك بالمعادلة التالية:
، حيث pK، ص وصبيتم تركيب المعلمات. - استخدام pK، ص و آربلتحويل نسبة هبتس الدهنية الفردية في خطوة 7.2.7. لقيم الأس الهيدروجيني.
، حيث pK، ص وصبيتم تركيب المعلمات.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم التحقق من نوعية بكشف غطاء الذهب تعديل (مسرى) مع سام 6MH قبل كل تجربة مع التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية. ويبين الشكل 2 ألف الممثل كول-كول المؤامرات يتم قياسها باستخدام التحليل الطيفي المعاوقة الكهروكيميائية قبل وبعد هي تمتز الدهنية. إذا كانت نوعية سام كافية، أن تبدي مقاومة التحليل الطيفي على سلوك سعوية نقية تقريبا أسفرت عن مؤامرة كول-كول شبه دائرة. قطر نصف الدائرة في مؤامرة كول-كول يساوي السعة طبقة مزدوجة من سطح القطب، التي ينبغي أن تكون في حدود 2.5-3.0 µF/سم2 . قد تكون لاحظت علما بأن السعة لا ينبغي أن يغير إلى حد كبير على الامتزاز الدهنية، على الرغم من حدوث زيادة طفيفة في السعة (الدهنية عالية التغطية، الشكل 2 ألف، أسفل) أو يمكن ملاحظة تحول طفيف في مقاومة منخفضة ترددات (أعلى التغطيات، الشكل 2 أ، الحويصلية منخفضة).
كهربية يمكن استخدامها لاختبار نشاط الحفاز الفسفرة بو3 في بروتيوليبوسوميس، حيث تعكس التيارات الحفاز تقاس بدوري فولتاميتري النشاط أوكسيدوريدوكتاز أوبيكوينول-الأكسجين. ومع ذلك، يمكن فقط اكتشاف التيارات حافز كبير في كميات كبيرة من بروتيوليبوسوميس في الممتزة والمسبق عن كثب معبأة طبقة من بروتيوليبوسوميس في كشف غطاء الذهب تعديل. يوضح الشكل 2B فولتاموجرامس دوري التمثيلي (السير الذاتية) القطب قبل وبعد الامتزاز الدهنية مع أما تغطية الحويصلية منخفضة أو عالية. ويلاحظ لا الحالي فراديك على السيرة الذاتية فارغة نظراً لانخفاض الأكسجين بمسرى الذهب العارية محظور بواسطة SAM. عند السطح مشبعة الدهنية مع ارتفاع الفسفرة بو3 المحتوى (1.3% (w/w) في هذه الحالة)، وموجه حفاز واضحة بسبب انخفاض الأكسجين هو لاحظ مع على إمكانية ظهور 0 الخامس، أي إمكانات ubiquinone الحد (الشكل 2B، الخط الأزرق). تجمع ubiquinone الأفعال كالركيزة الطبيعية للانزيم وكوسيط إلكترون، نقل الإلكترونات من الإنزيم على سطح القطب. نلاحظ أن تحت تغطية عالية الحويصلية، لا يوجد تمييز من حويصلات الفردية ممكن عن طريق الفحص المجهري وتغطية أدنى مطلوب للدراسات الحويصلية واحد. في تغطية الحويصلية منخفضة (لكن نسبة عالية من البروتين إلى نسبة الدهون)، حفاز الحالي انخفض انخفاضا كبيرا، بالكاد يمكن تمييزها عن الخلفية (الشكل 2B، خط أحمر). علما بأن الحالية الحفاز هو أدنى حتى تحت ظروف واحدة إنزيم (بروتين منخفض لنسبة الدهون)، ولا يمكن قياس موثوق بها.
ويبين الشكل 3 الصور الأسفار من الدهنية تمتز على أقطاب كهربائية في التغطيات مختلفة الثلاثة. واتخذت كل الصور في ظروف الضوء والتعرض متطابقة وتم تعديل السطوع على نفس القدر لتمكين المقارنة المباشرة. الصبغ-تتضمن-الدهنية مرئية على الصور كنقاط مضيئة. وكان الجزء المركزي من الصورة فوتوبلياتشيد لبضع دقائق للكشف عن مستوى الأسفار الخلفية (ونلاحظ أن فدلل نسبيا فوتوستابل وليس فوتوبلياتشيد تماما في الشكل 3). الصور على قناتين هبتس سوبيريمبوسابل، حيث النسبة بين القناتين (410/535 و 470/535) يناظر الرقم الهيدروجيني 7.4 المستخدمة في هذه التجربة. عدد أكبر من الدهنية مرئية بفضل القناة، مما يشير إلى وجود الدهنية التي قد لا هبتس مغلفة. الفرق بين القنوات هبتس وفضل هو أكثر وضوحاً في التغطيات أعلى، ربما لأن في تغطية عالية الحويصلية، الدهنية أكثر احتمالاً انفجار أو الصمامات على السطح.
ويتطلب تحليل صورة محاذاة الإطارات (ضد الإطار الأول) باستخدام إيماجيج، البرنامج المساعد ستاكريج. المحاذاة لأن لا غنى عنها في معظم الحالات انجراف حراري طفيف من العينة عادة ما يحدث داخل المقياس الوقتى للتجربة، تغيير إحداثيات الحويصلية. يتم تنفيذ جميع المزيد من التحليل باستخدام مدونة برامج نصية. هذه التعليمات البرمجية يقوم بالتعرف التلقائي الحويصلية. كما حجم الدهنية أقل من الحد حيود أبي، يعتبر هذه الأسفار كما تنتشر نقطة مهمة أكبر بكثير من قطر الحويصلية الفعلية (الشكل 4 أ). الرمز يناسب شدة الأسفار كل حويصلة على قناتين لدالة جاوس 2D (الشكل 4 أ) وتحسب نسبة الكثافة الحجمية التي يمكن تحويلها إلى الأس الهيدروجيني باستخدام منحنى معايرة. قبل تنفيذ هذه الإجراءات على جميع الأطر الزمنية، يتم الحصول على درجة الحموضة داخل كل حويصلة داخل المقياس الوقتى للتجربة (فيلم 1). ويبين الشكل 4B الوساطات من كافة التغييرات الأس الهيدروجيني حويصلة داخل صورة واحدة عندما يكون محتوى بو3 الفسفرة 1.3 في المائة. زيادة في درجة الحموضة (ضخ البروتون) يظهر بشكل واضح عندما يتم تطبيق محتملة بين-0.1-0.3 V، ولكن ليس من أجل 0 الخامس منذ هذا الأخير لا يكفي للحد من تجمع كينون. عندما يكون المحتوى بو3 الفسفرة أقل بكثير (نسبة البروتين للدهن 0.1%، الرقم 4)، تصبح منحنيات متوسط لا يمكن تمييزها تقريبا من تلك الدهنية فارغة (الشكل 4). يتضح الفرق عند النظر في آثار الحموضة الفردية الدهنية عشوائية (الشكل 5، 6 و 7). بينما الدهنية دون الفسفرة بو3 عرض أية تغييرات درجة الحموضة هامة فيما يتعلق بالضوضاء (الشكل 7)، مجموعة مختارة الدهنية تظهر زيادة (المهيمن)، أو انخفاض درجة الحموضة عندما يكون المحتمل تطبيقها أن العاملات الفسفرة بو3 (6 أرقام، المنطقة الرمادية). الفرق الواضح بين الدهنية في الأس الهيدروجيني--آثار يتسق مع انخفاض نسبة البروتين للدهن، حيث الفسفرة بو3 موجودة فقط في مجموعة فرعية صغيرة من النشاط الدهنية. ويفسر انتشار بزيادة الرقم الهيدروجيني على انخفاض إعادة تشكيل الطريقة التي تفضل توجه "خارجي" من جزيئات الإنزيم (ca. 75%). جزء صغير الدهنية التي عرض تغيير الرقم الهيدروجيني يزيد عند الفسفرة بو3 إلى نسبة الدهون هو أعلى (الشكل 5). لاحظ أيضا أن بعض الدهنية وقف ضخ البروتون والدخول في وضع تبديد بروتون قبل نهاية التطبيق المحتملة. أننا نولي هذا السلوك إلى جزيئات بو3 الفسفرة دخول تسرب دولة، مما يسمح للبروتونات التدفق إلى التجويف الحويصلية14.
يمكن أن يتم مزيد من التحليل لآثار الأس الهيدروجيني بما في ذلك على تركيب وتصميم بروتون ضخ تسرب معدلات استخدام برنامج نصي لأننا نشرنا سابقا14،22 ويمكن الحصول عليها من "مستودع ليدز بيانات البحث" 23 , 24.
رقم 1: مبدأ الأسلوب. (أ) مبدأ لرصد نشاط إنزيم واحد و (ب (مخطط الإعداد التجريبية المستخدمة في هذا العمل مع كوتاواي لإظهار جزء داخلي من الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: استجابة الكهروكيميائية الدهنية. (A) قياس قطع كول-كول في الفوسفاط (0.22 V مقابل أنها؛ خط أسود التربيعية) قبل وبعد الدهنية (1.3% w/w الفسفرة بو3) الامتزاز من الحلول في تركيزات 5 ميكروغرام/مل (خط دائرة حمراء) و 500 ميكروغرام/مل (خط دائرة زرقاء). (ب) دوري فولتاموجرامس في 100 mV/s (اللوحة اليسرى) و 10 mV/s (اللوحة اليمنى) للاتحاد الأفريقي-سام (خط أسود متقطع) قبل وبعد الدهنية (1.3% w/w الفسفرة بو3) الامتزاز من الحلول في تركيزات 5 ميكروغرام/مل (الخط الأحمر) و 500 ميكروغرام/مل (الخط الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Fluorescence مجهرية من الدهنية. صور fluorescence الدهنية في التغطيات السطحية مختلفة: الأسطح المحتضنة مدة 30 دقيقة مع حل الدهنية من 5 ميكروغرام/مل (الصف العلوي)، 20 ميكروغرام/مل (الصف الأوسط) و 500 ميكروغرام/مل (الصف السفلي). يتوافق مع العمود الأيسر إلى 470/535 نانومتر الإثارة/الانبعاثات تصفية الإعداد (1ش هبتس قناة)؛ العمود الأوسط-410/535 نانومتر (2nd هبتس قناة)؛ العمود الأيسر-560/645 نانومتر (فضل القناة). أخذت الصور في التكبير 90 × (60 X 1.5 X التكبير بالمجهر قبل الكاميرا والهدف)، 1 s التعرض وشدة الضوء مماثلة. تتوافق مع أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحديد الحويصلية وتغيير درجة الحموضة. (أ) 3D-عرض جزء من الصورة الأسفار التي تحتوي على الحويصلية واحد نموذجي. كثافة fluorescence يعتبر نقطة نشر الدالة (لون سطح) التي يتم تركيبها على وظيفة غاوسي 2D (مش سوداء). (ب-د) الأس الهيدروجيني، عرض كالمتوسط لجميع الحويصلات داخل منطقة الصورة المفردة (عادة عدة مئات) في إمكانات تطبيقية مختلفة. من 0-60 ثانية، يتم تطبيق لا إمكانيات (الفوسفاط). بين 60 و 180 s (المنطقة الرمادية) طبقت إمكانيات مختلفة: 0 الخامس (أسود)، الخامس (أحمر)،-0.1-0.2-0.3 V (أزرق) من الخامس (الأخضر)،. بين 180 و 300 s, V 0.4 مقابل. وقالت أنها قد طبقت. كان الفسفرة بو3 إلى نسب الدهون (ب) 1.3%، (ج) 0.1%، (د) 0%. ويقابل الآثار للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: آثار الحموضة الدهنية التي تحتوي على 1.3% إنزيم. آثار لدرجة الحموضة تغيير 72 الدهنية واحدة، تم اختيارها عشوائياً، تتضمن الفسفرة بو3 (1.3% w/w) قياسها وتحليلها من خلال تجربة واحدة. من 0-60 ثانية، لا إمكانية تطبيق (OCP)؛ بين 60 و 180 s (المنطقة الرمادية)-0.2 الخامس مقابل. وقالت؛ بين 180 و 300 s, V 0.4 مقابل. وقالت أنها قد طبقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: آثار الحموضة الدهنية المحتوية على 0.1% إنزيم. آثار لدرجة الحموضة تغيير 72 الدهنية واحدة، تم اختيارها عشوائياً، تتضمن الفسفرة بو3 (0.1% w/w) قياسها وتحليلها من خلال تجربة واحدة. من 0-60 ثانية، لا إمكانية تطبيق (OCP)؛ بين 60 و 180 s (المنطقة الرمادية)-0.2 الخامس مقابل. وقالت؛ بين 180 و 300 s, V 0.4 مقابل. وقالت أنها قد طبقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: آثار الحموضة الدهنية دون الإنزيم. آثار تغيير درجة الحموضة الدهنية واحد 72، اختيرت عشوائياً، دون الفسفرة بو3 قياسها وتحليلها من خلال تجربة واحدة. من 0-60 s: لا إمكانية تطبيق (OCP)؛ بين 60 و 180 s (المنطقة الرمادية)-0.2 الخامس مقابل. وقالت؛ بين 180 و 300 s, V 0.4 مقابل. وقالت أنها قد طبقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: الرسوم المتحركة لتغير الرقم الهيدروجيني الحويصلية واحد. (اللوحة العلوية) التغيير من الأسفار الحويصلية على قناتين هبتس (كما هو موضح 3D-سطح الأرض في المنطقة المقابلة) خلال 300 s للتجربة. تم تطبيق إمكانيات التخفيض بين 60 s و 180 س (أسفل اللوحة) المطابق مؤامرة من نسبة كثافة حجمية من قناتين هبتس مقابل الوقت. منطقة تطبيق التخفيض المحتمل هو مظللة باللون الرمادي. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
ملفات تكميلية. اضغط هنا لتحميل الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هي مناسبة لدراسة بروتون ضخ بروتينات الغشاء الرئوي التي يمكن أن يعاد تشكيلها في الدهنية وقادرون على تبادل الإلكترونات مع تجمع كينون. يمكن رصد بروتون ضخ النشاط على مستوى إنزيم واحد استخدام الأصباغ حساسة لدرجة الحموضة (راتيوميتريك) مغلفة في التجويف الحويصلية (الشكل 1A).
الطريقة تعتمد على قدرة ubiquinone (أو أخرى كوينونس)، أدرجت في بلير الدهن، تبادل الإلكترونات مع أقطاب تعديل مع سام18. خصائص مسرى الذهب، تعديل مع سام، محددة جداً. بحاجة إلى الجسميات على SAM و SAM ينبغي أن تكون رقيقة ما يكفي لتمكين الأكسدة الكهروكيميائية السريع والحد من تجمع كينون في الدهنية الدهنية. الأهم من ذلك، يحتاج التفاعل بين القطب والحويصليه ضعيفة ما يكفي ليس تنال من سلامة الغشاء الدهني. وعلاوة على ذلك، اعتماداً على تفاصيل النظام التجريبي، من المستصوب إذا SAM يمنع ردود فعل الجانب حفزت الذهب، مثل الحد من الأكسجين. وأخيراً، يحتاج SAM مستقرة داخل الإطار المحتمل استخدامها. استخدام أقطاب الذهب مسطحة جداً تعديل مع سام عالية الجودة من 6MH يفي بهذه المتطلبات في حالة الفسفرة بو3. تجريد أقطاب الذهب من رقائق السليكون الذرة مسطحة يخلق سطح الذهب فائقة على نحو سلس مع سام مثالية قريب كما يتبين من الأطياف مقاومة. يرجى ملاحظة أن نشكل سام من 6MH في الماء. أبلغنا سابقا في الأكاديمية مع 6MH في الايزوبروبانول16، ولكن هذه سامز يحمل قيم السعة مزدوج الطبقة الأعلى وأطياف المعاوقة التي تشير إلى سطح غير متجانسة أكثر (أي.، عيوب أكثر) مع وجود مقاومة أقل. وعلاوة على ذلك، عندما يتم إعداد سامز من 6MH من المحلول المائي، أقل انخفاض الأوكسجين الخلفية (بسبب انخفاض الأوكسجين تشجعهن الذهب) يلاحظ مقارنة بالأكاديمية التي تكونت من حلاً إيثانول/الكحول. كل هذه الملاحظات تشير إلى أن الأكاديمية من 6MH في حلول المياه أعلى جودة بأقل عيوب. سامز عالية الجودة ويمكن أن تشكل أيضا من مركبات ثيول مع سلاسل ألكان أطول (مثلاً، 1-هيدروكسي-ديكان-ثيول)، لكن حركية نقل إلكترون تصبح أبطأ كما يزيد من سمك سام.
خلال كهربية (الطيف)، وينبغي تجنب أيونات الكلوريد في الحل المخزن المؤقت نظراً لأنهم قد تشيموسورب على سطح الذهب في إمكانات عالية، ربما تتدهور نوعية سام. ولنفس السبب، ينبغي أن يكون قطب مرجع خالية من كلوريد المفضل.
هناك نقطة هامة أخرى هي نفاذية الخلفية الدهنية للبروتونات، التي ينبغي أن تكون منخفضة بما يكفي للسماح بتراكم بروتون نتيجة إزفاء بروتون الانزيمية على المقياس الزمني للتجربة. قد تؤثر على تكوين الدهن الضبط هذه النفاذية. في عملنا، ونحن نستخدم القطبية كولاي مقتطفات الدهن وتستكمل مع أوبيقوينوني-10. لقد ثبت نفاذية بروتون تعتمد بشدة على طول سلسلة الأحماض الدهنية25، على الرغم من أن هذا قد يتعارض مع دراسات مع التراكيب الدهن أكثر تعقيداً26. من المثير للاهتمام، ثبت مؤخرا لتعزيز الاستقرار في غشاء27أوبيقوينوني. أخيرا، يمكن أن تؤثر المنظفات متبقية من عملية إعادة تشكيل البروتين التسرب بروتون وبالتالي من المهم إزالة المنظفات تماما ممكن استخدام ميكروبيدس البوليسترين مسعور، تمييع متبوعاً بالطرد المركزي و شامل الشطف خلية كهروكيميائية بعد بروتيوليبوسوميس هي تمتز على السطح. إذا كان المشكوك فيه، يمكن التحقق من نفاذية الحويصلية بها عقب تغيير الرقم الهيدروجيني التجويف (عن طريق هبتس) ردا على درجة حموضة خارجية القفز28.
يتطلب قياس إنزيم واحد أونيلاميلار الدهنية والدهنية أصغر يتوقع أن تظهر تغييرات أسرع أو أعلى درجة الحموضة نقصان حجم في التجويف. ولتحقيق ذلك، تتم إضافة البوليسترين ميكروبيدس تدريجيا بكميات صغيرة مما يؤدي إلى بطء معدل تكوين الدهنية. في مثل هذه الظروف، تتشكل الدهنية الصغيرة الحجم متجانسة مع متوسط قطرها 70 نانومتر ومؤشر polydispersity 0.24 في حالة لدينا14. كما تمتز هبتس على ميكروبيدس البوليستيرين، الحد من قدرة ميكروبيدس البوليسترين على الجسميات المنظفات. ومن ثم، ينبغي إضافة ميكروبيدس البوليستيرين الزائدة للتعويض عن خسائرها. ولوحظ أن خفض تركيز هبتس في تعليق البروتينات الدهنية بحوالي ربع (من 5 مم إلى 3-4 ملم) المعاملة مع ميكروبيدس البوليستيرين. بيد أن تركيز هبتس الفعلية في التجويف الحويصلية قد تكون أعلى حيث تتشكل في الدهنية مبكرا في المعاملة مع ميكروبيدس البوليستيرين. بدلاً من هبتس، يمكن استخدام صبغات أخرى حساسة لدرجة الحموضة. ومع ذلك، من المهم أن الصبغة الغشاء كتيمة وراتيوميتريك. هذا الأخير يتجنب الأخطاء التجريبية بسبب فوتوبليتشينج وكميات مختلفة من صبغ مغلفة.
يمكن إجراء عمليات حسابية بسيطة لتقدير ما إذا كانت معظم الدهنية غير فارغة ستوتشاستيكالي، تحتوي على جزيء إنزيم واحد فقط. افتراض قطر الحويصلية متوسط 70 نانومتر، وزن الجزيئي دهن دا 750 ودهن في مساحة 0.65 nm2 يعطينا كتلة الحويصلية من 5.2x10-17 ز، أي، 9.6x1013 الدهنية كل إعداد (5 مغ من المادة الدهنية). في 0.1% من الفسفرة بو3 (MW = كاتشين 144)، 2 × 1013 إنزيم جزيئات موجودة، المقابل لنسبة 0.2 بروتين: الحويصلية. استخدام توزيع بواسون، واحد كذلك تحسبها أن احتمال العثور على جزيء إنزيم واحد (17%) كل الحويصلية أعلى عشر مرات من احتمال العثور على واحد أو أكثر من جزيء (1.7 ٪). يمكن إجراء عمليات حسابية أكثر دقة إذا كانت الخسائر الإنزيم والدهون أثناء إعادة تشكيل العزم من فحوصات المطابقة تؤخذ في الاعتبار. ويمكن تقدير هذا الأخير مقايسة بروتين وقياس fluorescence فضل من الدهنية مستعدة.
بمجرد إنشاء البروتوكول وتسجل آثار إنزيم واحد، كذلك إدخال تعديلات على الطريقة ممكناً تبعاً للهدف. قد يتصور المرء حول إضافة مثبط إنزيم أو إدخال إيونوفوري في النظام. وينبغي الحرص على التحقق من أن إضافة المذيبات المستخدمة في إعداد إيونوفوري أو مثبط للأوراق المالية لا تؤثر حالة سام أو نفاذية الدهنية.
هذه التقنية كما هو موضح هنا يقتصر على مجموعة معينة من الإنزيمات التي هي غشاء البروتون الناقلين وتحويل كينون. المعدات والظروف التجريبية المستخدمة هنا هي الأمثل للنشاط الأنزيمي الفسفرة بو3. هنا، هو القرار مرة ثانية 2-3، يحدده وقت التعرض، والوقت الذي يستغرقه للبرج لتغيير عوامل التصفية. مدة التجربة محدودة فوتوبليتشينج صبغة الفلورسنت، وهكذا، بشدة الضوء. وقد وجدنا سابقا بروتون متوسط معدل إزفاء الفسفرة بو3 أن 73 ± 2.2 البروتونات/s باستخدام هذا الأسلوب، على الرغم من اكتشاف الأنشطة وصولاً إلى 20 البروتونات/s. لاستخدام هذه التقنيات للإنزيمات مع أما أكثر أو أقل من النشاط، تحتاج إلى تكييفها مع معلمات اقتناء الصورة (أي.، الضوء على كثافة وزمن التعرض للضوء ومدة التجربة). وفي المستقبل، هذا الأسلوب يمكن تمديد نحو النقل الإلكترون الأخرى الدافعة بروتون ضخ الإنزيمات، على سبيل مثال، مجمع المتقدرية أنا. الإنزيمات الأخرى قد يتطلب إعادة تشكيل مختلف البروتوكولات، وهذا سيكون من الضروري أن يكون الأمثل لكل متعهد النقل المختلفة. مضخات البروتون ليست تحويل كينون الإنزيمات يمكن أيضا دراستها، مثلاً، يحركها ATP29، على الرغم من أن في هذه الحالة لا يمكن أن تسبب إزفاء بروتون اليكتروتشيميكالي، ولكن إضافة البادئ (مثلاً، ATP) مطلوب. وفي الحالة الأخيرة، ليست هناك حاجة لاستخدام قسيمة غطاء الذهب تعديل. وعلاوة على ذلك، شريطة أن تستخدم صبغة فلورسنت غشاء كتيمة ومراعية لايون مناسبة، ويمكن تمديد هذا الأسلوب الأخرى المضخات الأيونية، مثل الصوديوم والبوتاسيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يعترف الكتاب BBSRC (BB/P005454/1) للدعم المالي. NH مولت "البرنامج محقق الشباب مؤسسة فيلوم".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al.
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S.
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J.
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
